Способ получения бычьего,свиного или человеческого проинсулина

 

Изобретение касается соединений , родственных пептидам, в частности получения бычьего, свиного или человеческого проинсулина (ПИ), который проявляет биологическую активность и может быть использован в биологии и медицине. Упрощение процесса достигается переводом S-сульфонатных групп соответствующего исходного пептида в дисульфидные мости ко вые группы с помощью другого, реагента - меркаптана, взятого в количестве , обеспечивающем 1-4 эквивалента S-SH-фрагмента на каждый S-S03-фрагмент.Процесс ведут в водной среде при рН 9-11, концентрации S-сульфонатного полипептида, равной 0,1-7,4 мг/мл водной среды, и температуре 6-21°С. Величину рН реакционной среды поддерживают добавлением 0,05 М раствора глицина. Способ обеспечивает проведение процесса в одну стадию в условиях, не требующих присутствия кислорода. 1 3 . п. ф-лы, 4 т абл. § СУ) : о :о со см

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А3 (1Ю (ll) .;. кр Р

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К rlATEHTV

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 ) 3264049/23-04 (22) 26.03,81 (31) 134389; 210696 (32) 27.03.80; 28.11.80 (33) US (46) 30.03,87. Бюл. У 12 (71) Эли Лилли знд Компани (US) (72) Брюс Хилл Франк (US) (53) 547. 964, 4. 07 (088. 8) (56) Патент США Ф 3883496, кл, С 07 С 103/52, опублик, 1975 °

Патент США Ф 3883500, кл. С 07 С. 103/52, опублик. 1975. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЫЧЬЕГО, СВИНОГО ИЛИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ПРОИНСУЛИНА (57) Изобретение касается соединений, родственных пептидам, в частности получения бычьего, свиного или человеческого проинсулина (ПИ), который проявляет биологическую актив(59 4 С 07 К 7/40, А 61 К 37/02 ность и может быть использован в биологии и медицине. Упрощение процесса достигается переводом S-сульфонатных групп соответствующего исходного пептида в дисульфидные мостиковые группы с помощью другого. реагента — меркаптана, взятого в ко" личестве, обеспечивающем 1-4 эквивалента S-SH-фрагмента на каждый

S-S0 -фрагмент. Процесс ведут в водной среде при рН = 9-1 1, концентр ации S-сульфон атно го полипептида, равной 0,1-7,4 мг/мл водной среды, и температуре 6-21 С. Величину рН реакционной среды поддерживают добавлением 0,05 М раствора глицина.

Способ обеспечивает проведение процесса в одну стадию в условиях, не требующих присутствия кислорода, 1 э,п. ф лы, 4 табл, 1301319

55!

Изобретение относится к способу получения бычьего, свиного или человеческого проинсулина — биологически активного соединения, применяемого в биологии и медицине.

Цель изобретения — упрощение процесса.

Получение исходных продуктов.

Линейный цепной S-сульфонатный предшественник инсулина.

К 100 мп охлажденной деионизированной 7М мочевины добавляют 786 мг сульфита натрия, раствор перемешивают, добавляют 594 Ml тетратионата натрия, перемешивание продолжают, однако раствор остается мутным, Устанавливают рН 7,7 ледяной уксусной кислотой, При перемешивании добавляют очищенный с помощью HPZC бычий проинсулин (503 мг), Устанавливают рН реакционного раствора 7,6 2н, гидроокисью натрия, Полученный мутноватый раствор перемешивают при 6 С в течение 18 ч, Приблизительно половину реакционной смеси отделяют, устанавливают рН 9,1 с помощью 2н. гидроокиси натрия, и вводят в колонку с сефадексом

Ж-25 (грубый).

Условия хроматографирования: растворитель — 0,05М бикарбонат аммония; рН 9,0; размеры колонки 2х90 см; о . температура 21 С; скорость, потока

18,5 мл/мин.

Первые 120 мл вытекающей жидкости сливают, а следующие 75 мл собирают.

Затем колонку промывают другой порцией 0,05М бикарбоната аммония при рН 9,0 (400 мл), ту процедуру повторяют для второй половины реакционного раствора, УФ-спектры двух пулов показывают, что получено всего 401 мг °

Пулы объединяют и лиофилизируют досуха, Получают 445,7 мг сухого обессоленного продукта, Строение полученного продукта - линейного цепного

S- сул ьфон атно го бычье го прои нсули на и отсутствие исходного материала подтверждено электрофорезом на ацетате целлюлозы и полиамидным дисковым гель-электрофорезом, Линейный цепной S-сульфонатный бычий проинсулин чистят хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, Неочищенный образец (443 мг) растворяют в 10 мл смеси 7,5М мочевина — 0,01М Трис—

0,001М ЕДТА при рН 8,5 и вводят в колонку с ДЕАЕ-целлюлозой.

Условия хроматографиравания: растворитель — 7,5М мочевина — 0,01M

Трис — 0,001М ЕДТА, рН 8,5 с градиентом 0-0,35М хлористого натрия; размеры колонки 2,5х90 см; температура о

4 С, скорость потока около 0,9 мл/мин, объем фракций 5,3 мл, Поглощение при 276 нм для каждой фракции, построенное в зависимости от номера фракции, указывает на большой пик с небольшим хвостом. УФспектроскопия показала, что большой пик и есть получаемый продукт, фракции 199-240 с объемом вытекшей фазы

1069-1291 мл объединяют, УФ-спектр для этого образца соответствует

355 мг.

Полученный пул обессоливают на колонке с сефадексом Ж-25 (грубый).

Условия хроматографирования: растворитель — 0,05М бикарбонат аммония; рН 8,0; размер колонки 3,7х

О х105 см, температура 4 С; скорость потока 16,0 мл/мин.

Первые 396 мл жидкости сливают, а следующие 250 мл собирают и сохраняют, Затем колонку промывают другой порцией 2000 мл 0,05М бикарбона30 та аммония с рН 8,0, УФ-спектр этого пула показал

321 мг этого образца. Образец лиофилизируют досуха, Собирают 373 мг сухого материала, Идентичность продук35 та подтверждается полиакриламидным дисковым гель-электрофорезом и высокоэффективной жидкостной хроматографией низкого давления HPZPZC на основании времени элюирования.

40 В следующих примерах описано получение бычьего, свиного или человеческого проинсулина.

Пример 1. Концентрация

0,1 мг/мл.

К раствору 1,61 мг линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсулина в 16,1 мл дегазированного 0,05М глицина (рН 9,5) добавляют 0,158 мл водного 2-меркаптоэтанольного раствора, который при титровании реагентом Эллмана показал содержание меркаптана 2,11 мг/мл, что соответствует 4 экв. 2-меркаптоэтанола на—

SS0 — в линейном цепном S-сульфонатном бычьем проинсулине. Окончательное значение рН 9,46, Раствор, приготовленный при комнатной температуре, запаивают парафином, а за1301319

Продолжение табл.1

5,71

Суз

6,0

6,73

Val

7,0

1,0

31е

1О

Len

0,72

9,01

9,0

3,86

4,0

Tyr

15 Phe

2,93

3,0

Н1$

1,90

2,0

1,94

Ly$

2,0

3,94

Атя

4,0

Т аблица 1

Asp

3,00

3,0

0,91

Thr

1,0

2,62

Ser

3,0

Glu

13,3

13,0

Tro

5,03

5,0

Gly

12,0

12,0

Al a

6,0

6,0 тем перемешивают при охлаждении до о

6 С в течение 19 ч, Затем реакционную смесь подкисляют до рН 4,0+ О, 1 (терморегулировка), используя концентрированную соляную кислоту и 0,5 н, гидроокись натрия.

Выделяют продукт, Строение подтверждено высокоэффективной жидкост ной хроматографией низкого давления (HPZPZC)

Условия HPZPZC следующие: колонка l,lх54 см, стеклянная колонка, заполненная ЛП-l/С, с содержанием

С 16,6Х; растворитель — ЗОЖ ацетонитрила и 70Х 0 1М формиата аммония, рН 4,25; температура 21 С; давление 8028 г/см ; скорость потока

2,40 мп/мин.

Образец вводят в колонку с помощью 5 мл пробного петлеобразного инжектора и работают на длине волны

280 нм.

Первый введенный образец представлял собой 5 мл раствора бычьего проинсулина с номинальной концентрацией протеина 0,1 мг/мл; второй введенный образец — 5 мл подкисленной реакционной смеси. Наличие мономерного бычьего проинсулина в реакционной смеси подтверждено на основании времени элюирования. Расчет площадей пиков двух циклов HPZPZC показал, что выход бычьего проинсулина в реакционной смеси составил 82,6Х.

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Остаточные значения являются средними по трем определениям (30 ч гидролиза), Аlа = 1,0.

Пример 2. Концентрация

0,5 мп/мг.

ЗО К раствору 25,07 мг линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсулина в 50,14 мл дегазированного

0,05М глицина, рн 10,51, добавляют

1,302 мп водного 2-меркаптоэтанольного раствора, который при титрова- нии реагентом Эллмана имеет концентрацию меркаптана 2,10 мг/мп, что соответствует 2,1 экв. 2-меркаптоэтанола на — SSO — в линейном цепз ном S-сульфонатном бычьем проинсулине. Окончательное рН 10,47 ° Раствор, приготовленный при комнатной температуре, запаивают парафином и затем перемешивают при охлаждении о

45 до 6 С в течение 18 ч.

Реакционную смесь подкисляют до рН 4,0 0,1 (терморегулировка), используя концентрированную соляную кислоту и О,lн. соляную кислоту.

5р Анализ с помощью HPZPZC показал

69Х-ный выход бычьего проинсулина в реакционной смеси, Полученный продукт после обессоливания выделяют с помощью гель55 фильтрующей хроматографии.. Устанав. ливают рН реакционной смеси 9,0 концентрированной гидроокисью аммония и вводят в колонку, заполненную сефадексом Ж-25, 19

Т аблица 2 (aI) из природного го (aI) из природного

АминоBI из проинсулина по примеру 2 кис5 лота вяжьего говяжьего инсулина прони сулина

А1а

2,93

2,92

2,93

2,98

2,97

2,98

Asp

Thr 0,96

Ser 2,56

0,93

0,91

2,60

2,57

7,16

7,14

Glu

7Ф11

Pro О, 88

Gly 4,04

1/2Cys 5,47

0,79

0,85

4,02

4,02

5,45

5,00

4,49

4,51

4,54

Val

51»

0,55

0,58

0,54

5,86

5,87

5,83

Leu

3,84

3,93

3,90

Tyr

2,89

2,83

2,88

Phe

His

1,99

1,93

1,90

1,19

1,06

0,99

Lys

0,99

0,98

0,99

Arg

5 13013

Условия хроматографического обессоливания: растворитель - 0,05М бикарбонат аммония, рН 9,0; размеры колонки 2х90 см; температура 21 С; о скорость потока 18,5 мл/мин.

Первые 120 мл полученной жидкости сливают, следующие 75 мй собир ают (протеиновый пул), 3 атем колонку промывают другой порцией 400 мл

0,05М бикарбоната аммония с рН 9,0. 10

УФ-спектр протеинового пула показал, что выделено 21,6 мг протеина, Этот пул лиофилизируют досуха. Получают 22,21 мг сухого обессоленного протеина.

Часть этого материала (14,94 мг) растворяют в 5,5 мп 1,0М уксусной кислоты.

УФ-спектр прозрачного раствора показал, что концентрация протеина составила 2,56 мг/мл. 5 мл этого раствора (12,8 мл по данным УФ) вводят в колонку:с сефадексом Ж-50 (сверхтонкий) °

Условия хроматографирования: растворитель — IM уксусная кислота; размеры колонки 1,5х100 см температура 21 С; скорость потока 0,19 мл/мин; 30 объем фракций около 1,9 мл.

Ho Mepe элюирования в течение ночи IN уксусной кислоты записывают поглощение на длине 280 нм. На полученной кривой — два пика. Первый, 35 меньший, пик соответствует агрегатным формам бычьего проинсулина; второй пик — мономерному бычьему инсулину, Пулы собирают для двух пиков, ПоМученные фракции объединяют. 40

Пул I: фракции 30-46 (55,0-84,0 мп; пик 70,4 мл), Пул II: фракции 47-62 (84,0

112,0 мл; пик 99,8 мл). 45

По данным УФ-спектров в пуле I содержится 1,94 мг, в пуле II — 10,11 мг, т,е. всего 12,05 мг (выход 94,13 от количества, введенного в колонку) .

Всего выделяют 83,9Х мономерного бычьего инсулина.

Оба пула лиофилизируют досуха.

Продукт пула I идентифицирован как бычи проинсулин на основании времени элюирования в цикле HPZPZC, что 55 также подтверждено с помощью обработки трипсином и карбоксипептидазой В (табл. 2).

Пример 3. Влияние температуры.

Процедуру примера 1 использовали для определения влияния температуры на выход бычьего инсулина из линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсулина.

Условия реакции: концентрация . протеина 0,1 мл/мг; буфер - 0,05М глицин; рН 9,5; меркаптан — 2-меркаптоэтанол в количестве, обеспечивающем 4 экв. — SH на — SSOä-, время 18 ч.

Проведение реакции при 21 С обеспечивает выход проинсулина 47 по

7 1301 319 данным HPZPZC. В случае, если реагено ты смешивают при 21 С, а затем проо цесс проводят при охлаждении до 6 С, выход 7 77..

Пример 4. Влияние рН.

Процедуру примера 1 используют для определения влияний рН на выход бычьего проинсулина из линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсу- р о лина в ряде реакций, проводимых одно- 10 временно, Условия реакций: концентрация протеина 0,5 мг/мл; буфер — 0,05М глицин; меркаптан — 2-меркаптоэтанол в количестве, обеспечивающем 2 экв. — 15

SH на — SS0ä, время 1 8 ч; температура 6 С, По данным HPZPZC выход проинсулина следующим образом зависит от рН: рН Выход, 7 20

9,0 43,1

9,5 44,3

10,0 66,7

10,5 76,0

11,0 61,0

Phe

Пул I — 22, 1 мг; пул II — 28, 3 мг; пул III — 103,6 мг, что составляет

154 мг и соответствует выходу 947. от количества, введенного в колонку. Из

1.у s выделенного количества 63, 7Х составляет мономерный человеческий проинсулин, Все три пула замораживают и . лиофилизуют досуха, Из трех пулов собирают 106,55 мг сыхого материала. Идентифицируют человеческий проинсулин аминокислотным анализом и полиакриламидным дисковым гель-электрофорезом, а также на основании времени элюирования на рН LC, 40 при котором ожидается выход человеческого проинсулина по отношению к проинсулину бычьему. Дальнейшую идентификацию проводят при обработке трипсином и карбоксипептидазой В до 45 получения человеческого инсулина (табл. 3).

Продолжение табл.3

4,35

5,0

15 0

15,8

G1u

3,0

2,94

11,0

11,3

4,0

4,0

А1а

6,0

5,89

6,0

5,90

fl е

1,66

2,0

12,0

12,3

Leu

4,0

3,87

Tyr

2.,96

3,0

2,0

1,91

2,0

1,96

4,0

3,95

Arg

Остаточные значения являются средними для трех определений (30 ч гидролиза), Аlа = 1,0, Пример 5. Влияние концентрации протеина на выход продукта.

Процедуру примера 1 используют для определения влияния концентрации протеина на выход бычьего проинсулина из линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсулина в ряде реакций, проводимых одновременно.

Условия реакций: буфер — 0,05М глицин; рН 9,5; меркаптан — 2-меркаптоэтанол в количестве, обеспечивающем 4 экв. — SH на — SSO — врео мя 18 ч; температура Ь С, По данным HRZPZC изменение концентрации протеина следующим образом влияет на выход проинсулина:

Концентрация про- Выход, Ж теина, мг/мп

Таблица 3

55

4,07

0,1

Asp

Thr

3,0

2., 82

0,2

1 301319

0,3

0,4

37,6

25,4

0 5 12

1,0

Условия реакций: концентрация протеина 0,1 мг/мл, буфер — 0,05М

f0 глицин; рН 9,5; меркаптан, 4 экв.

SH на — SSO -, время !8 ч; температура 6 С, По данным HPZPZC тип меркаптана следующим образом влияет на выход

f5 проинсулина:

0,5

77,2

Меркаптан

Выход, 7.

0,96

58,3

Дитиотреитол

39,3

1,83

19,5

Дитиоэри тритол

34,9

4,2

Метилтиогликолят

20,!

56,1

19,6 3-Меркапто — 1,2-пропандиол 65,5

7,4

3-Меркаптопропионовая кислота

Причем в двух последних случаях отношение SH: - SSO3 — = 1,2.

Пример 6. Влияние отношения — БН: - SSO — на выход проинсу- 30 лина.

Процедуру примера 1 используют для определения влияния отношения

SH к — SSO — на выход бычьего проинсулина из линейного цепного S-суль- 35 фонатного бычьего проинсулина в ряде реакций, проводимых одновременно, Условия реакций: концентрация протеина 0 5 мг/мл;. буфер — 0,05М глицин; рН 9,5; время 18 ч; температу6оС

По данным HPZPZC изменение соотношения — SH; — SSO - следующим образом влияет на выход проинсулина:

65,3

2-Меркаптоэтанол

64,1

Выход, 7

Отношение—

880з

Выход, Х

4,0

30,8

Линейный цепной

S-сульфонатный проинсулин

?90

44,7

1,0

37,0

Бычий

60,6

0,5

4,5

Свиной

65,8

При проведении другого цикла опытов для 2 экв. — SH на — SSO — и при рН 10,5 получают следующие результаты:

Концентрация про- Выход, Ж теина, мг/мл

Пример 7. Влияние типа меркаптана на выход проинсулина.!

О

Процедуру примера 1 используют для определения влияния строения меркаптана на выход бычьего проинсулина из линейного цепного S-сульфонатно",о бычьего проинсулина в ряде реакций, проводимых одновременно.

Пример 8. Влияние типа протеина на выход проинсулина.

Процедуру примера 1 используют для определения влияния типа протеина на выход проинсулина из линейного цепного S-сульфонатного проинсулина в ряде реакций, проводимых одновременно.

Условия реакций: концентрация протеина 0,1 мг/мл, буфер — 0,05М шлицин; рН 9,5; меркаптан — 2-меркаптоэтанол в количестве, обеспечивающем 4 экв. — SH на — SSO -, врео мя 18 ч; температура 6 С, По данным HPZPZC выход проинсулина следующим образом зависит от типа протеина:

Пример 9. Получение человеческого инсулина.

ll 1301 3

К раствору 169,3 мг биосинтетически полученного линейного цепного

8-сульфонатного человеческого проинсулина в 338,6 мл дегазированного

0,05М глицина (рН=10,54) добавляют

7,71 мл водного раствора 2-меркаптоэтанола, который при титровании реагентом Эллмана показал концентрацию меркаптана 2,08 мг/мл, что соответствует 2 экв. 2-меркаптоэтанола на

SS0 — в линейном цепном S-сульэ фонатном человеческом проинсулине, С помощью 5н, гидроокиси натрия доводят рН до 10,52 ° Раствор запаивао ют парафином и перемешивают при 6 С в течение 18 ч.

Затем. реакционную смесь подкисля ют до рН 2,9+0,1 (терморегулировка) концентрированной соляной кислотой.

Полученный прозрачный раствор вводят 2р в колонку, заполненную сефадексом

Ж-25 (грубый), для обессоливания.

Условия хроматографирования: растворитель — 27-ная уксусная кислота; размеры колонки 5х100 мм; темпера- 25 тура 25ОС; скорость потока 28,8мл/мин; объем фракции 20,2 мл.

Первые 789 мл полученной жидкости сливают, а следующие 464 мп собирают и сохраняют. Определение оптичес- 30 кой плотности на 280 нм показало, что это протеиновый пул. Колонку промывают дополнительно 2500 мл 27-ной уксусной кислоты. Расчеты на основа нии данных УФ-спектра для протеинового пула показали, что выход протеина

164 мг, что соответствует 101,97 количества, введенного в колонку (теоретический выход reformation реакции). Этот пул замораживают и лиофи- 40 лизируют досуха, Целевой продукт выделяют, используя гель-фильтрационную хроматографию. Сухой продукт (не взвешенный) растворяют В 20 мл IN уксусной КНс 45 лоты. Полученный прозрачный раствор вводят в колонку, заполненную сефадексом Ж-50 (сверхтонкий).

Условия хроматографирования: растворитель — )М уксусная кислота; размеры колонки 2,5xl25 см; температура 25ОС; скорость потока 0,82 мл/мин; объем фракций примерно 4,92 мл.

В течение ночи колонку элюировали

)М уксусной кислотой; записывали поглощение при 270 нм. На полученной кривой поглощения на 280 нм от номера фракции получили 2 пика. Первый пик (меньший) соответствует агрегат19 )2 ной форме человеческого проинсулина, второй пик — мономерному человеческому проинсулину (плечо передней части). Собирают три пула фракций, Фракции объединяют, Пул I фракции 46-67 (2)8-325,5 мп); пул II: фракции 68,81 (325,6-395,5 мл); пул III: фракции 82-100 (395, 5490,3 мл).

Для этих пулов по данным УФ-спектров рассчитаны следующие количества протеин а: пул I — 22,1 мг; пул II — 28,3 мг; пул III — 103,6 мг.

Получено 154 мг продукта, что соответствует выходу 947. от количества, введенного в колонку, Из выделенного количества 67,37 составляет мономерный человеческий проинсулин.

Все 3 пула замораживают и лиофилизируют досуха.

Из трех пулов собирают 106,55 мг сухого материала °

Аминокислотный анализ и полиакриламидный дисковый гель-электрофорез подтвердили, что получен человеческий проинсулин. Время его элюирования при HPZC соответствует времени элюирования человеческого проинсулина по отношению к бычьему проинсулину, Дальнейшую идентификацию проводят при обработке трипсином и карбоксипептидазой В (до получения человеческого инсулина).

Пример 10. Человеческий проинсулин-цистеин, К раствору 130 мг человеческого проинсулин-S-сульфоната в 404 мп холодного дегазированного 0,02М глицина с рН 10,4 прибавляют 13,9 мл исходного водного раствора цистеина, который имеет содержание меркаптана

3,63 мг/мл (титрование с реагентом

Эллмана), что соответствует содержанию 50 мас.X меркаптана в белке. рН 10,5 достигают с помощью прибавления небольшого количества 5н. гидроокиси натрия, Раствор закрывают и о перемешивают при 6 С в течение 18 ч.

После этого реакционную смесь подкисляют до рН 3,8 ледяной уксусной кислотой. По данным жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) выход проинсулина составляет

56,3 мас,7.. К подкисленной реакционной смеси прибавляют твердую мочевину и получают конечную концентрацию мочевины, равную 4М. Проинсулин

Известное значение

Человеческий проинсулин

Амико ки с25 лота

13 1З01З выделяют ионообменной хроматографией на SP-Sephadex, а затем хромато" графией на DEAE. После этого полученное очищенное соединение очищают гель-фильтрационной хроматогра5 фией íà Sephadex G 50SF. Полученное соединение является человечвским проинсулином, что подтверждается

ЖХВД с одновременным элюированием человеческого проинсулина в качестве f0 сравнения. Выход твердого человеческого проинсулина 43 мас,Х. 12 мг человеческого проинсулина отбирают на аналитические цели в ходе описанной фильтрации (если это количест- !5 во включить в результирующий выход, то общий выход проинсулина составит

52 мас.Х).

Результаты исследований приведены в табл. 4.

Таблица 4

Формула изобретения

1. Способ получения бычьего, свиного или человеческого проинсулина общей формулы 1 (А-11 (А-6) (А-7) ау-11Н

Х

Cys-S-S (Д-гп) (И-г )

Cys Су9 — Сф-АВв 0Н

I I

S (А-Ю

1 1 (s-0 S

I

Я AH-РЬе-Суз Cys

19 14

Остаточные значения являются средними для трех определений (ЗО ч гидролиза) . Ala = 1,0, Предлагаемый способ позволяет непосредственно, в одну стадию, превращать S-сульфонат в целевой дисульфидный предшественник инсулина благодаря осуществлению непосредственного обмена в условиях, не требующих присутствия кислорода.

4,0

4,07

Asp

3,0

2,82

4,35

Ser

5 0

Glu!

5,8

15,0

Pro

2,94

3,0

Пу

11,0

11,3

Ala

4,00

4,0

Cys

5,89

6,0

Ual

5,90

6,0

1,66

2,0

Leu

12,3

12,0

Tyr

3,87

4,0

Phe

2,96

3,0

His

1,91

2,0

Ьув

1,96

2,0

Yrg

3,95

4,0 где R — - водород;

Y — Lys-Ala- или -Lys-Thr-;

Х вЂ” Arg-Ar g-Glu-Ua 1-Glu-01у-Pro-Gln-Val-Gly-А 1 а-Ьеи-Gl u-Leu-Аlа-Gly-Gly-Pro-GlyAla-Gly-Gly-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-Arg;

Arg Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro35 -Gln-Ala-Gly"Ala-Ual-Glu-Leu-G1y-Gly-61у-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Аlа-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-G1n-Lys-Arg, 40

-Ar g-Arg-Gl u-Аlа-Glu-Asp-Leu-Glu-Val-20Gly-Gln-Val-G1u-Leu-Gly-G1y-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser--Leu-Glu"

-Pro-Leu-Ala-Leu-Аlа-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Glu Lys-Arg-, путем конверсии S-ñóëüôîíàòíbIõ групп

S-сульфонатюи полипептидов общей формулы II

50 (А-11 61.у-NH Х

1 (A 6) Cys-S-SO, (А-201 (А-20 (А — 7) Суз С уь- Cys — Asn-ОИ

55 8-80 В-80З ь —, (В-1) S $0, S

В-ЫИ-Phe-C11s Cys Y (В "71 (Bds) 15 E 301319 l6 где R Х и Y имеют указанные значе- О, E-7,4 мг на 1 мл водной среды при ния, 6-21 С. в дисульфидкые мостиковые группы, 2. Способпо и. 1, о тли ч аотличающийся тем,что, ю шийся тем, что величину рН с целью упрощения процесса S-сульфо- реакционной среды поддерживают, до5 натные полипептиды общей формулы II бавляя глицин в концентрации 0,05М, подвергают взаимодействию с меркаптаном, взятом в количестве, обес- Приоритет по признакам печивающем 1,0-4,0 эквивалента SH- 27,03.80 — бычий, свиной проинфрагмента на каждый SSO -фрагмент 10 сулин1 в водной среде при рН 9-11, концент- 28,11.80 — человеческий проинрации S-сульфонатного полипептида II сулин. !

Составитель В. Волкова

Редактор Л. Веселовская Техред B.Кадар Корректор А. Зимокосов

Заказ 1163/58 Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4