Полипептид,обладающий гипогликемической активностью
Полипептид общей формулы ,1 R- где R - остаток молекулы инсулина, содержащий от 1 до 29 аминокислот; Е остаток молекулы инсулина, содержащий от 31 до 51 аминокислот; ,30 В - L-серин, обладающий гипогликемической активностью . (Л
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
23, :Вм
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ (21) 3614240/23-04 (22) 04.07.83 (46) 23 .11 .85. Бюл . 9 43 (71) Институт экспериментапьной эндокринологии и химии гормонов
AMH СССР (72) Ю. П. Швачкин, С,. П. Краснощекова, А. M. Никитина, E Н. Волуйская, В. П. Федотов и А. И. Иванова (53) 547.964.4.07(088.8) (56) 1. D. S, Н. Nicol, Ь. F. Smiths
"Amino-acid sequence of Human Jusulin". Hature, 1960, !87, 483.
2. Н. Brown, F. Sanger, P. Kitai.
"The structure of Pig and Sheep
Insulin". Biochem., J., 1955, 60, 556, f51) 4 С 07 К 7/40; С 12 P 21/04;
А 61 К 37/02 (54) 21ОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ. (57) Полипептид общей формулы 0 )
R —  — R
Э где R — остаток молекулы инсулина, содержащий от 1 до 29 аминокислот;
Ъ
 — остаток молекулы инсулина, содержащий от 31 до 51 аминозо кислот
В - 2 -серии, обладающий гипогликемической активностью.
1149603
Зо
R-В -R) где R — остаток молекулы инсулина, содержащей от 1 до 29 аминокислот
R - остаток молекулы инсулина, содержащей от 31 до 51 аминоэо кислот
В - L-серии, обладающим гипогликемической активностью, Ниже показаны структурные раэлиЗО чия в положении В между описываемым полипептидом (I), природным инсулином свиньи (II) и инсулином че- 35 ловека (ХХХ).
„о о+ о
CH-С Н вЂ” CH — С он он н cH — сн
5 ОН вЂ”, (щ н
45
Описываемый полипептид получают путем ферментативно-химической трансформации легко доступного и выпускаемого в промышленном масштабе свиного инсулина по двухстадийной схеме..
Первая стадия заключается в катализируемом трипсином трансформировании свиного инсулина, протекающем при взаимодействии последнего с эфиром
Ь-серина. Вторая стадия процесса заключается в химическом демаскировании сложно-эфирного производного под действием трифторуксусной кисло50
Изобретение относится к новому биологически активному соединению— полипептиду, обладающему гипогликемической активностью, которое может найти применение в медицине, 5
В настоящее время в медицинской практике применяют заменитель инсулина человека (инсулин, содержащий эо в положении В остаток оксиаминокислоты L-треонин Я ) — инсулин
10 свиньи, отличающийся от инсулина . о
Ф человека тем, что положение В в его молекуле занимает L-алании $2) .
Цель изобретения — поиск в ряду полипептидов, обладающих гипоглике- 15 мической активностью, полипептидов, более близких по структуре к инсулину человека.
Цель достигается описываемым .полипептидом общей формулы ты в присутствии анизола в качестве протектора, Пример. Растворяют 140 мг (1,14 ммоль) гидрохлорида трет-буO тилового эфира 0-трет-бутил-Ь-серина в смеси 300 мкл диметилформамида и 200 мкл трис-буфера с рН 5,7, Прибавлением 5 H. NaOH доводят рН до
8,0,смесь выдерживают 10 мин при
20 С, прибавляют к ней 100 мг о (17,5 мкмоль) свиного инсулина, предварительно освобожденного от ионов цинка. Прибавлением 50 мкл концентрированной соляной кислоты устанавливают рН 6,3 и вводят 6 мг трипсина и 5 мкл 0,5 M водного раствора хлористого кальция. Смесь вью держивают 24 ч при 24 С, затем подкисляют 50%-ной уксусной кислотой до рН 2,5 и подвергают гель-фильтрации через колонку(2,8 х 100 см) с сефадексом G-50, применяя в качестве элюента lOX-ную уксусную кислоту.
После лиофилиэации элюата получают
70 мг сложноэфирного производного целевого полипептида (I) которое очищают ионообменной хроматографией на колонке (1,7 х 16 см) с ДЭАЭ— сефадексом А-25, применяя в качестве элюента 0,03 И трис-буфер с рН 8,2, содержащий 0,05% ЗДТА и 50% изопропилового спирта. После концентрирования элюата в вакууме раствор (5 мл) обессоливают пропусканием его через колонку (3,5 х 60 см) с сефадексом G-50, предварительно уравновешенную 0,05 М раствором бикарбоната аммония. Полученное после лиофилизации вещество растворяют в 0,4 мл трифторуксусной кислоты, содержащей
0,02 мл анизола, смесь выдерживают
1 ч при 20 С, охлаждают до - 10 C о О прибавляют 20 мл охлажденного диэтилового эфира, смесь выдерживают 2 ч при — 10 С, отделяют вещество, выпаво шее в осадок, центрифугированием, растворяют его в минимальном объеме
lOX-ной уксусной кислоты и образовавшийся раствор пропускают для окончательного обессоливания через колонку (2,2 х 38 см) с сефадехсом G-25, применяя в качестве элюента IOX-ную уксусную кислоту. После лиофилизации получают 15 мг целевого полипептида (Х) с электрофоретической подвижностью 1,35 (электрофорез на бумаге
"Ватман 9,1", рН 1,9, 450 В, 7 мА, стандарт отнесения - бис-Я-сульфонат
В-цепи инсулина свиньи).
3 11496
Аминокислотный анализ: Asp 3,00 (3), Thr !,80 (2), Ser 3,80 (4), Gld
7,06 (7), Pro 1,00 (1), Gly 4,00 (4), А1а 1,02 (1), Cys 4,60 (6), Val 3,60 (4), 31е 1,80 (2), Leu 6,00 (6), Туг
3,50 (4), Phe 2,90 (3), His 2,00 (2), Lys 1,00 (1), Arg 0,95 (1).
Результаты определения С-концевых аминокислот: Ser 0,98 (1), Asn .0,97 (1) . 10
Проведены биологические испытания описываемого полипептида.
Испытания проводили на мышах (самцы) массой 20-22 r после 20-часового. голодания. Животных делят на 6 групп, 15 по 10 животных в каждой. Животным первых трех групп подкожно вводят по 1, 0,75 и 0,5 мкг инсулина-стан-, дарта соответственно; мышам 4»ой, 5-ой и 6-ой группы - те же дозы поли-щ пептида (I). Испытуемые препараты вводят в 0,2 мл физиологического раствора. Животных помещают в разделенную на отдельные ячейки термостатированную камеру при 36 С и наблю- 25 о дают за ними на протяжении 90 мин.
В каждой группе подсчитывают количество животных, у которых развиваются судороги.
Результаты исследований представлены в таблице.
Таким образом, биологическая активность описываемого полипептида полностью соответствует активности инсулина человека, взятого в качест- 3S ве стандарта (тле. описываемый поли« пептид обладает 100_#_.-ной инсулиновой .активностью).
Проведено определение острой токсичности описываемого полипептида. 40
Острую токсичность описываемого соединения проверяли на мышах — самцах весом 20-22 r. Испытуемый полипептид вводят однократно подкожно в дозах 0,5, 0 75 и 1,0 мкг/мышь (25- 45
50 мкг/кг массы тела}, что превышает диапазон активных лечебных доз (720 мкг/кг) . Наблюдения за животными, помещенными в изолированные боксы при температуре 36 С, продолжали в 50 о течение 1 ч. Развившиеся в течение этого времени судороги купировали подкожным введением 20Х-ного раствора глюкозы и продолжали наблюдение за животньпм еще в течение суток. 55
Каких-либо отклонений в поведении
03 4 мьппей подопытных и контрольных групп не наблюдали. В указанных дозах препарат не оказывал местного раздражающего действия. При забое животных через с гки после инъекции соединения (Е) какие-либо уплотнения, раздражения, инфильтраты в местах введения не выявлены. Изменения в органах и тканях не обнаружены.
Токсическое действие иисулинов связано с их основным биологическим действием - гипогликемическим эффектом. При передозировке препарата развиваются гипогликемические судороги, гипогликемическая кома.
Проявления токсического действия абсолютно идентичны для инсулинов человека, .свиньи и крупного рогатого скота.
Описываемый полипептид в сравнении с полипептидом свиньи является более близким структурным аналогом инсулина человека.
В сравнении с описываемым полипептидом инсулин человека более труднодоступный и более дорогостоящий препарат, поскольку для получения инсулина человека необходимо использовать в качестве исходного вещества оксиаминокислоту Ь-треонин, содержащую два ас симе . риче ских центр а { при Ы вЂ” и / углеродных атомах); при получении описываемого полипептида исходным веществом является оксиаминокислота
L-серии, содержащая только один асимметрический центр (лишь приЫуглеродном атоме).
Указанные структурные различия позволяют снизить в два рата побочные реакции рацемизации при получении описываемого полипептида по сравнению с получением инсулина человека.
Сопоставление стоимости оксиаминокислот L-серина и L-треонина показывает, что оПисываемый полипептид дешевле инсулина человека более чем в 5 раз.
Получение описываемого полипептида, обладающего гипо гликемиче ской
100X-ной инсулиновой активностью, основано на ферментативном превращении инсулина свиньи, который является доступным промышленным продуктом.
1149603
Тестирование по судорожному эффекту у мышей
Препарат
0,5
ых прореагировавпе ших мышей
Инсулин (стандарт) -10
10
Полипептид (I) 10
10
20 .
Составитель В. Волкова
Техред А.Бабинец Корректор А. Обручар
Редактор П. Горькова
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4
Заказ 7040/4 Тираж 353 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5
