3'-фосфат, n, p-незащищенные фосфотиоатные олигодезокснуклеотиды в качестве исходных соединений для получения фосфотиоатных, олигонуклеотидных реагентов для биотехнологических процессов, фосфотиоатные олигонуклеотидные производные, содержащие 3'- и/или 5'- связанные химические группировки в качестве фосфотиоатных олигонуклеотидных реагентов для биотехнологических процессов и способ их получения

 

Использование: в качестве исходных соединений для получения фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов для биотехнологических процессов. Сущность изобретения: 3'-фосфат, N,P-незащищенные фосфотиатные олигодезоксинуклеотиды I, фосфотиатные олигонуклеотидные производные II, способ получения II взаимодействием 3'- или 5'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов с соответствующим азолами или аминопиридинами, или производными алифатических аминов в присутствии трифенилфосфандипиридилдисульфид и N-метилимидазола в качестве катализатора. 1 табл.

Группа изобретений относится к области биоорганической химии, а именно: a) к новым химическим соединениям 3'-фосфат, N,P-незамещенным фосфотиатным олигодезоксинуклеотидам общей формулы (I) , где B остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина; n 1-20 (общепринято, что к олигонуклеотидам относятся полинуклеотидные последовательности длиной цепи от 1 до примерно 20); которые могут быть использованы в качестве исходных для синтеза фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов для биотехнологических процессов; б) к фосфотиатным олигонуклеотидным реагентам, содержащим 3'- и/или 5'-связанные химические группировки, общей формулы (II) , где R'= B остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n 1-20
(3'-реагенты)
(5'-реагенты)
(3'-, 5'-реагенты)
R" остаток аминопиридина, например 4-диметиламинопиридина (DMAP)

или остаток азола, например N-метилимидазола (MeIm)

или остаток алкилирующего амина, например 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметиламина (HN(CH₃)CH₂RCl)

или остаток алифатического амина, например 1,3-пропилендиамина (NH₂(CH₂)₃NH₂)
-NH(CH₂)₃NH₂
или аминолинкерная группа с остатком интеркалирующего красителя, например N-(2-оксиэтил)феназиния(-NH(CH₂)₃HN-Phn))

R"' аминолинкерная группа с остатком интеркалирующего красителя, например N-(2-оксиэтил)феназиния(-NH(CH₂)₃HN-Phn)),
получаемых на основе исходных 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (I) или на основе 5'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (III) или (IV)

где B остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n 1-20;
x аминолинкерная группа с остатком интеркалирующего красителя, например N-(2-оксиэтил)феназиния (-NH(CH₂)₃HN-Phn));
в) к способу получения фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов общей формулы (II).

Введение различных химических групп в состав природных олигонуклеотидов или их аналогов придает олигонуклеотидной молекуле различные новые свойства и тем самым позволяет значительно увеличить биологическую активность этих соединений и расширить область их применения в биотехнологических процессах [1-2] К тому же, различные химические группировки могут присоединяться как по 3'-, так и по 5'-концу олигонуклеотидной цепи, либо одновременно по 3'- и 5'-концам цепи, что значительно может расширить спектр их действия.

В последнее время широкое применение нашли фосфотиатные аналоги олигонуклеотидов (ФТАО) [1-4] которые отличаются от природных олигонуклеотидов наличием в межнуклеотидных фосфатных остатках атомов серы -OP(S)(O^-)O-. Преимущество ФТАО по сравнению с обычными природными олигонуклеотидами заключается в их устойчивости к действию клеточных нуклеаз, а по сравнению с метилфосфонатными аналогами олигонуклеотидов в хорошей растворимости в водных средах. ФТАО и их производные проявили в некоторых случаях высокую биологическую активность при подавлении развития различных вирусных инфекций (особенно развития вируса СПИДа [3]
Известно, что незащищенные фосфотиатные остатки (-OP(S)(O^-)O-) обладают большей нуклеофильностью по сравнению с природными фосфатами (-OP(O)(O^-)O-) и способны легко окисляться и подвергаться модификации в ходе синтеза.

Несмотря на широкий спектр различных производных нормальных олигонуклеотидов, ассортимент известных на сегодняшний день производных ФТАО ограничен лишь несколькими примерами этих соединений. Известный способ получения производных ФТАО основан на использовании в качестве исходных соединений, присоединенных к полимерному носителю по 3'-концу цепи, 5'-гидроксил, N,P-защищенных олигонуклеотидов общей формулы (V) [3]
,
где B^* остаток тимина, N⁴-бензоилцитозина, N⁶-бензоиладенина, N²-изобутирилгуанина;
n 1-20;
П полимерный носитель.

Например, известно 5'-холестероловое производное фосфотиатного олигонуклеотида, получение которого основано на использовании 5'-гидроксил N,P-защищенных олигонуклеотидов, присоединенных к полимерному носителю по 3'-концу цепи (соединения общей формулы (V)), остаток стероида к которому присоединяют с помощью специально синтезированного стероидсодержащего Н-фосфонатного реагента, по 5'-свободной гидроксильной группе олигонуклеотида [3]
Полученные 5'-холестероловые производные фосфотиатных олигонуклеотидов были использованы в биотехнологических процессах по подавлению развития различных вирусов, в том числе и вирусов СПИДа, в клетках. Присоединение остатка холестерола позволило, например, значительно увеличить проникающую способность исходных фосфотиатных олигонуклеотидов и тем самым увеличить степень подавления развития вирусной инфекции в клетках [3]
Недостатком получения производных фосфотиатных олигонуклеотидов на основе 5'-гидроксил, N, P-защищенных олигонуклеотидов является то, что целевые продукты получаются после жесткой обработки аммиаком (в течение 10 часов при 60^oC) необходимой для удаления обычно используемых N-защитных ацильных групп. В ходе этих обработок (операций) относительно неустойчивые химические группировки могут подвергаться модификации или отсоединению от полученного фосфотиатного олигонуклеотидного реагента. Это приводит к ограничению ассортимента получаемых производных фосфотиатных олигонуклеотидов. В частности, использование присоединенных к полимерному носителю по 3'-концу цепи, 5'-гидроксил, N,P-защищенных олигонуклеотидов общей формулы (V) в качестве исходных соединений не позволяет получать:
а) фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие реакционноспособные (например, алкилирующие, метилимидазолил- или диметиламинопиридилилфосфамидные) группировки, способные активно реагировать с нуклеофилами, поскольку вводимые реакционноспособные группировки при обработке концентрированным аммиаком могут реагировать с ними и образовывать химически не активные соединения, т.е. могут терять свои реакционноспособные свойства;
б) фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты гетерогенного состава (где В
остаток тимидина, аденозина, гуанозина или цитозина), содержащие остатки интеркалирующих красителей, поскольку последние при обработке аммиаком отсоединяются от фосфотиатного олигонуклеотида.

в) фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие химические группировки на 3'-конце олигонуклеотидной цепи, поскольку 3'-конец исходных олигонуклеотидов присоединен к полимерному носителю.

Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов, содержащих различные, в том числе и реакционноспособные, химические группы.

Поставленная задача решается описываемыми новыми соединениями - 3'-фосфат, N, P-незащищенными фосфотиатными олигодезоксинуклеотидами общей формулы (I). При этом использование данных соединений в качестве исходных позволяет проводить присоединение различных, в том числе и реакционноспособных, химических групп путем активации концевых фосфатных групп в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин дипиридилдисульфид [5]
Полученные производные фосфотиатных олигонуклеотидов общей формулы (II) являются новыми, ранее не синтезированными фосфотиатными олигонуклеотидными реагентами, которые могут быть использованы в различных биотехнологических процессах.

Например, диметиламинопиримидиновые, метилимидазолидные или алкилирующие производные (соединения общей формулы (II), где R" остаток диметиламинопиридина, метилимидазола или алкилирующего амина) являются реакционноспособными регентами, способными избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиоатные остатки в самом реагенте) реагировать с различными нуклеофилами (например, с аминами), а N-(2-оксиэтил)феназиниевые производные (см. соединения общей формулы (II), где R" R"' остаток N-(2-оксиэтил)феназиния) обладают свойствами интеркалирующего красителя, т.е. являются интенсивно окрашенными соединениями, где остатки N-(2-оксиэтил)феназиния выступают в качестве олигонуклеотидкрасящей метки, а в перспективе могут выступать в качестве интеркалирующих остатков, способных стабилизировать комплементарные комплексы, образованные с участием нуклеиновых кислот. Способность полученных реакционноспособных фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов взаимодействовать с различными нуклеофилами может быть использована для направленной модификации нуклеиновых кислот или ферментов в живых организмах. (Известно, что в качестве нуклеофильных центров в нуклеиновых кислотах могут выступать N7-положение гуанина, N3- и N7-положения аденина и N3-положение цитидина, которые способны легко модифицироваться под действием реакционноспособных (например, алкилилирующих) групп в составе олигонуклеотидов [6] К нуклеофильным центрам ферментов можно отнести, например, SH-группы остатков метионина, NH₂-группы остатков лизина или остатки гистидина, способные подвергаться модификации под воздействием DMAP-, MeIm- или RCl-алкилирующих фосфамидных производных, например нормальных олигонуклеотидов [7]).

Использование соединений общей формулы (I) в качестве исходных позволяет также получать фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие различные химические группы на 5'-конце цепи, в том числе и уже известные производные фосфотиатных олигонуклеотидов, содержащих, например, остаток холестерола [3] С этой целью исходные 3'-фосфат, N,P-незащищенные фосфотиоатные олигодезоксинуклеотиды общей формулы (I) вначале подвергают ферментативному 3'-дефосфорилированию известными методами в присутствии, например, фермента щелочной фосфотазы, затем фосфорилирут в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты и фермента полинуклеотидкиназы [8] Полученные таким образом 5'-фосфат, N,P-незащищенные фосфотиатные олигодезоксинуклеотиды общей формулы (III) далее могут быть использованы в качестве исходных соединений для присоединения различных, в том числе и реакционноспособных, а также уже известных холестеролсодержащих, химических групп по 5'-концу цепи, аналогично присоединению химических групп по 3'-концу цепи (см. выше) путем активации 5'-концевой фосфатной группы в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин дипиридилсульфид.

Использование соединений общей формулы (I) в качестве исходных позволяет также получать фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие различные химические группы одновременно на 3'- и 5'-концах цепи. С этой целью полученные выше фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие 3'-связанные химические группировки (например, соединения общей формулы (II), где R" остаток интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния), вначале подвергают ферментативному фосфорилированию с помощью аденозинтрифосфорной кислоты в присутствии фермента полинуклеотидкиназы [8] и получают промежуточные 5'-фосфорилированные соединения общей формулы (IV) (где X - аминолинкерная группа с остатком интеркалирующего красителя), путем активации 5'-концевого фосфата которых в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин -дипиридилдисульфид присоединяют различные химические группировки дополнительно по 5'-концу цепи.

Соединения, содержащие химические группировки на 3'- и 5'-концах цепи, могут обладать одновременно двумя свойствами, например свойствами интеркалирующих красителей и свойствами реакционноспособных групп, введенных в состав фосфотиатного олигонуклеотида, т.е. могут быть мечеными интеркалирующим красителем соединениями, способными в то же самое время взаимодействовать с различными нуклеофилами. А присоединение по 3'- и 5'-концам цепи одновременно двух одинаковых по функциональному назначению химических групп позволяет увеличить степень функциональности вводимых химических групп (например, увеличить степень окрашенности фосфотиатного олигонуклеотидного реагента при введении в его состав двух остатков интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния.

Таким образом, использование 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов в качестве исходных соединений для синтеза производных фосфотиатных олигонуклеотидов позволяет получать как уже известные реагенты (содержащие, например, остатки холестерола [3]), так и реагенты, содержащие в своем составе реакционноспособные группировки или остатки интеркалирующих красителей, и таким образом позволяет значительно расширить ассортимент фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов для биотехнологических процессов.

3'-фосфат, N, P-незащищенные фосфотиатные олигодезоксинуклеотиды общей формулы (I) получают последовательной обработкой известных 5'-диметокситритил, 3'-pSMe, N-ацил, P(SMe)-защищенных фосфотиатных олигонуклеотидов [9] общей формулы (VI)
,
где B^* остаток тимина, N⁴-бензоилцитозина, N⁶-бензоиладенина, N²-изобутирилгуанина;
DMTr 4,4'-диметокситритил;
n 1-20,
раствором йода в водном пиридине для удаления 3'-p-концевых SMe-защит [9] (при этом методом ³¹P-ЯМР-спектроскопии нами показано, что межнуклеотидные триэфирные P-SMe группы сохраняются), затем раствором тиофенола в смеси триэтиламина и диоксана для удаления Me-групп с межнуклеотидных P-SMe остатков [10] (в результате которого образуются межнуклеотидные фосфотиатные группы) с последующей обработкой водным аммиаком (для удаления N-ацильных защит с гетероциклических оснований нуклеотидов) и уксусной кислотой (для удаления 5'-O-диметокситритильных защитных групп) с выделением целевого продукта ионообменной хроматографией.

Пример 1. Cинтез 3'-фосфат дитимидилил фосфотиата.

TpsTp (VIII)
0,1 моль (111 мг) защищенного дитимидилата DMTrTp(SMe)Tp(SMe) (VII) (соединение общей формулы (VI), где B^* тимидин, n 1), полученного по известной методике [9] растворяют в 10 мл смеси пиридин-вода (3:2), добавляют 129 мг йода (1 ммоль). Через 20 мин реакционную смесь упаривают, растворяют в 10 мл воды и избыток йода удаляют экстракцией эфиром (3 х 50 мл). Водные слои упаривают. Получают промежуточное соединение DMTrTp(SMe)Tp (VIIIa), которое анализируют ³¹P-ЯМР-спектроскопией. В спектрах ³¹-ЯМР (пиридин-вода, 3:2) обнаружено:
1) сигналы в области 32,3 м.д. относящиеся к исходным межнуклеотидным триэфирным SMe-фосфотиатным группам (-O-P(SMe)(O)O-) [11]
2) полное исчезновение сигналов в области 21,1 м.д. относящихся к 3'-концевой p(SMe) фосфодиэфирной группе (-O-P(SMe)(O)O^- [9]
3) появление сигналов в области 1,6 м.д. относящихся к деблокированной моноэфирной 3'-фосфатной группе (-O-P(O)(O^-)O^-) [12]
Эти данные свидетельствуют о селективном и количественном деблокировании SMe-защит только с 3'-концевой фосфатной группы и об образовании соединения (VIIIa).

Полученное промежуточное соединение (VIIIa) растворяют в 6 мл смеси: тиофенол-диоксан-триэтиламин (1:2:1). Через 48 часов реакционную смесь высаживают (выливают) в 500 мл серного эфира, осадок отделяют и сушат, получают промежуточное соединение DMTrTpsTp (VIIIб), которое анализируют ³¹P-ЯМР-спектроскопией. Отсутствие в спектрах сигналов в области 32,2 м.д. и появление сигналов в области 55,7 м.д. на основании литературных данных [4, 11, 12] свидетельствуют о полном деблокировании Me-групп с P-SMe фосфотриэфирных межнуклеотидных остатков (-O-P(SMe)(O)O-) в промежуточном соединении (VIIIa) и об образовании диэфирных фосфотиоатных межнуклеотидных групп (-O-P(S)(O^-)O- ps). Эти данные подтверждают структуру полученного промежуточного соединения (VIIIб).

Далее реакционную смесь, содержащую промежуточное соединение (VIIIб), выдерживают в 10 мл 80%-ной уксусной кислоты в течение 30 мин и упаривают на ротационном испарителе (стандартные условия для удаления DMTr-защитных групп), получают соединение (VIII). Соединение (VIII) хроматографируют на колонке с ионообменным носителем (Полисил СА) в градиенте K₂HPO₄, содержащем 20% -ный ацетонитрил. Целевой продукт обессоливают на обращенно фазовой колонке, элюируя продукт 50%-ным водным ацетонитрилом, и упаривают.

Получено 1430 OE₂₆₀ целевого соединения. Выход 85%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет большее время удерживания по сравнению с контрольным динуклеотидом TpTp, не содержащим фосфотиатных групп (см. таблицу). При обращенно фазовой хроматографии полученный продукт (VIII) элюируется в виде двух пиков, представляющих собой смесь двух диастереомеров, с большим временем удерживания, чем время удерживания контрольного дитимидилата TpTp. УФ-спектры полученного соединения (VIII) в воде: λ_min 240 нм, λ_max 270 нм, ε₂₆₀16,8 x 10³ л моль^-1 см^-1, идентичны спектрам контрольного дитимидилата TpTp. В ³¹P-ЯМР-спектрах (H₂O) обнаружены сигналы в области 55,1 и 55,4 м.д. которые соответствуют сигналам, относящимся к межнуклеотидным фосфотиатным группам (ps) [15, 24] (два диастереомера). Регистрируются также сигналы в области -0,1 м.д. соответствующие сигналам 3'-концевого фосфата [24] Соотношение фосфотиатных и 3'-фосфатных сигналов 0,99:1 (теоретически 1:1). Других сигналов в ³¹P-ЯМР-спектрах не обнаружено.

Сумма представленных данных доказывает структуру полученного соединения (VIII).

Пример 2. Синтез 3'-фосфат тритимидилил фосфотиата.

TpsTpsTp (IX)
Обработка 15,4 мг (0,1 ммоль) защищенного тритимидилата DMTrTp(SMe)Tp(SMe)Tp(SMe) (VIIa) раствором йода, смесью тиофенола с триэтиламином и диоксаном, уксусной кислотой и выделение продукта хроматографией в условиях примера 1 дают 1768 OE₂₆₀ соединения (IX). Выход 71%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и имеет большее время удерживания по сравнению с контрольным тритимидилатом TpTpTp и выше полученным динуклеозидфосфотиатом TpsTp (VIII) (см. таблицу). При обращенно-фазовой хроматографии продукт элюируется в виде смеси изомеров, время удерживания которых больше, чем время удерживания контрольного тритимидилата TpTpTp. УФ-спектры полученного соединения (IX) в воде: λ_min 240 нм, λ_max 217 нм, ε₂₆₀ 24,9 х 10³ л моль^-1 cм^-1, - идентичны спектрам контрольного тритимидилата TpTpTp. В ³¹P-ЯМР-спектрах (ДМФ, триэтиламонийная соль) обнаруживаются сигналы в области 55,6-56,2 м.д. соответствующие сигналам межнуклеотиных фосфотиоатных групп (ps) и сигналы в области (-0,9)-(-1,2) м.д. соответствующие 3'-концевому фосфату в соотношении 1,95:1 (теоретически 2: 1).

Сумма представленных данных подтверждает структуру полученного соединения (IX).

Пример 3. Синтез 3'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp (X).

Обработка 402 мг (0,1 ммоль) защищенного октануклеотида DMTrC^bzp(SMe)A^bzp(SMe)Tp(SMe)Tp(SMe)G^ibp(SMe) Tp(SMe)G^ibp(SMe)-A^bzp(SMe) (VIIб) раствором йода, смесью тиофенола с триэтиламином и диоксаном в условиях примера 1 дает промежуточное соединение DMTrC^bzpsA^bzpsTpsTpsG^ibpsTpsG^ibpsA^bzp (Xa), которое содержит неблокированные N-ацильные защитные группы, для удаления которых реакционную смесь на этой стадии нагревают в концентрированном аммиаке (20 мл) в течение 6 часов при 50^oC. Получают промежуточное соединение DMrTCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp (Хб). Далее реакционную смесь, содержащую промежуточное соединение (Хб) выдерживают в 10 мл 80%-ной уксусной кислоты в течение 30 мин и упаривают на ротационном испарителе (стандартные условия для удаления DMTr-защитных групп), получают соединение (Х). Соединение (Х) хроматографируют на колонке с ионообменным носителем (Полисил СА) в градиенте K₂HPO₄, содержащем 20%-ный ацетонитрил. Целевой продукт обессоливают на обращенно фазовой колонке, элюируя продукт 50%-ным водным ацетонитрилом, и упаривают.

Получено 1193 OE₂₆₀ целевого соединения. Выход 15%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет большее время удерживания по сравнению с контрольным октануклеотидом CpApTpTpGpTpGpAp, не содержащим межнуклеотидных фосфотиатных групп (см. таблицу). При обращенно-фазовой хроматографии полученный продукт (IX) элюируется в виде смеси диастереомеров, время удерживания которых больше, чем время удерживания контрольного окатнуклеотида CpApTpTpGpTpGpAp. УФ-спектры полученного соединения (X) в воде: λ_min 236 нм, λ_max 266 нм, ε₂₆₀ 79,5 x 10³ л моль^-1 см^-1, идентичны спектрам контрольного октануклеотида CpApTpTpGpTpGpAp. В ³¹P-ЯМР-спектрах (30% CH₃CN в H₂O) обнаруживаются сигналы, соответствующие сигналам межнуклеотидных фосфотиатных групп (ps) ((δ 55,4 м.д.) и 3'-концевому фосфату ((δ -0,2 м.д.) в соотношении 6,8:1 (теоретически 7:1).

Сумма представленных данных подтверждает структуру полученного соединения (X).

Наличие концевого 3'-фосфата в полученном соединении (Х) доказывают следующим образом. Аликвоту соединения (Х) обрабатывают щелочной фосфотазой в стандартных условиях [8] получают 3'-дефосфорилированный продукт CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA, который подвергают ионообменной хроматографии (см. таблицу). Уменьшение времени удерживания полученного дефосфорилированного продукта (27,1 мин) по сравнению со временем удерживания исходного соединения (IX) (35,6 мин) свидетельствует о наличии в исходном соединении (Х) концевого фосфата. Другую аликвоту соединения (Х) обрабатывают аденозинтрифосфорной кислотой в присутствии фермента полинуклеотид киназы в стандартных условиях ферментативного фосфорилирования олигонуклеотидов [8] Получают 3'-, 5'-дифосфорилированный продукт pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp, который подвергают ионообменной хроматографии. Увеличение времени удерживания полученного продукта (44,2 мин) по сравнению со временем удерживания исходного соединения (Х) (35,6 мин) свидетельствует о наличии в соединении (Х) 5'-гидроксильной. Сумма этих данных свидетельствует о наличии в соединении (Х) 3'-фосфатной (и 5'-гидроксильной) группы.

Ниже приведены примеры использования 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (I) в качестве исходных соединений для получения фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов, содержащих 3'-связанные химические группировки общей формулы (II).

Пример 4. Синтез (4-диметиламино)пиридин-3'-фосфамидного производного дитимидилил фосфотиата.

TpsTp-DMAP (XI)
К раствору 19,7 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной динуклеозидфосфотиоата TpsTp (VIII) в 1 мл диметилформамида добавляют 24,4 мг (0,2 ммоль) 4,4'-диметиламинопиридина, 22 мг (0,1 ммоль) 2,2'-дипиридилдисульфида и 26,2 мг (0,1 ммоль) трифенилфосфина. Через 20 мин реакционную смесь выливают в 50 мл серного эфира. Осадок растворяют в 1 мл диметилформамида и снова высаживают в эфир. Осадок промывают эфиром и высушивают.

Получают 247 OE₂₆₀ соединения (XI). Выход 92%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет меньшее время удерживания по сравнению с исходным динуклеозидфосфотиатом (VIII) (см. таблицу). В спектрах ³¹P-ЯМР (ДМФ) обнаружено:
1) сигналы в области 55,4 и 55,7 м.д. относящиеся к исходным межнуклеотидным фосфотиатным остаткам (ps) (два диастереомера) [4, 12]
2) полное исчезновение сигналов в области -0,3 и -0,4 м.д. относящихся к 3'-концевой фосфатной группе [5, 12]
3) появление сигналов в области -7,2 м.д. относящихся к диметиоламинопиридин-3'-фосфамидной группе (3'-pDMAP) [5, 12]
Эти данные свидетельствуют о количественном образовании 3'-pDMAP производного соединения (VIII) и о сохранности межнуклеотидных фосфотиатных групп.

Сумма полученных данных подтверждает структуру полученного соединения (XI).

Возможность использования соединения (XI) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного реагировать с нуклеофилами, проверяли на примерах реакции соединения (XI) с различными аминами (выступающими в данном случае в качестве нуклеофилов) под контролем ³¹Р-ЯМР-спектроскопии.

Примеры реакций соединения (XI) с аминами приведены ниже (примеры 4а-в).

Пример 4а. Реакция фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XI) с бензиламином (NH₂Bnz).

К 10,6 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли соединения (XI) в 1 мл диметилформамида приливают 10,7 мкл (0,1 ммоль) бензиламина. Через 10 мин в спектрах ЯМР наблюдаются полное исчезновение сигналов в области -7,2 м.д. (соответствующих исходным 3'-pDMAP фосфамидным группам) и появление сигналов в области 6,4 и 6,6 м.д. (соответствующих образованию бензиламин-3'-фосфамида [5, 12]), межнуклеотидные фосфотиатные (ps) группы при этом не повреждаются ((δ 55,6 и 55,9 м.д.). Эти данные свидетельствуют об образовании бензилфосфамидного производного TpsTpNHBnz (XIa) (где Bnz остаток бензиламина). Реакционная способность полученного реагента может быть оценена также данными анализа реакционной смеси ионообменной хроматографией. Хроматографические характеристики полученного продукта (XIa) приведены в таблице.

Пример 4б. Реакция фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XI) с пропилендиамином (NH₂(CH₂)₃NH₂).

К 10,6 мг (0,01 ммоль) соединения (ХI) в 1 мл диметилформамида приливают 8,3 мкл (0,1 ммоль) пропилендиамина. Через 10 мин в спектрах ЯМР наблюдаются полное исчезновение сигналов в области -7,2 м.д. и появление сигналов в области 7,7 и 7,9 м.д. (соответствующих образованию (3-амино)пропил-3'-фосфамида [5]), межнуклеотидные фосфотиатные (ps) группы при этом не повреждаются ((δ 56,8 и 56,9 м.д.) Эти данные свидетельствуют об образовании (3-амино)пропил-фосфамидного производного TpsTpNH(CH₂)₃NH₂ (XIб). Реакционная способность полученного реагента может быть оценена также данными анализа реакционной смеси ионообменной хроматографией. Хроматографические характеристики полученного продукта (XIб) приведены в таблице.

Пример 4в. Реакция фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XI) с алкилирующим амином (NH(CH₃)CH₂RCl).

К 10,6 мг (0,01 ммоль) соединения (XI) в 0,9 мл диметилформамида добавляют 21,2 мг (0,1 ммоль) алкилирующего амина NH(CH₃)CH₂RCl, растворенного в 0,1 мл диметилформамида. Через 10 мин в спектрах ЯМР наблюдаются полное исчезновение сигналов в области -7,2 м.д. и появление сигналов в области 7,3 и 7,4 м. д. (соответствующих образованию 3'-фосфамида соответствующего амина [5] ), межнуклеотидные фосфотиатные (ps) группы при этом не повреждаются ((δ 56,4 и 56,7 м.д.). Эти данные свидетельствуют об образовании алкилирующего фосфамидного производного TpsTpN(CH₃)CH₂RCl (XIв). Реакционная способность полученного реагента может быть оценена также данными анализа реакционной смеси ионообменной хроматографией. Хроматографические характеристики полученного продукта (XIa) приведены в таблице.

Сумма представленных в примерах 4а-в данных свидетельствует о высокой реакционноспособности полученного соединения (XI) по отношению к различным аминам (выступающим в данном случае в качестве нуклеофилов) и свидетельствует о возможности использования соединения (XI) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Пример 5. Синтез N-метилимидазол-3'-фосфамидного производного дитимидилил фосфотиата.

TpsTp-MeIm (XII)
Реакция 10,7 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли динукеозидфосфотиата TpsTp (VIII) с 16,4 мкл N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида и трифенилфосфина в условиях, приведенных в примере 4 дает 198 OE₂₆₀ соединения (XII). Выход 91%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет меньшее время удерживания по сравнению с исходным динуклеозидфосфотиатом (VIII) (см. таблицу). В спектрах ³¹P-ЯМР-(ДМФ) обнаружено:
1) сигналы в области 55,1 и 55,5 м.д. относящиеся к исходным межнуклеотидным фосфотиатным остаткам (ps) [4, 12]
2) полное исчезновение сигналов в области -0,3 и -0,4 м.д. относящихся к 3'-концевой фосфатной группе [12]
3) появление сигналов в области -11,5 и -11,7 м.д. относящихся к N-метилимидазол-3'-фосфамидной группе (3'-pMeIm) [5]
Эти данные свидетельствуют о количественном образовании 3'-pMeIm производного соединения (VIII) и о сохранности межнуклеотидных фосфотиатных групп. Сумма полученных данных подтверждает структуру полученного соединения (XII).

Реакционную способность полученного фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XII) по отношению к нуклеофилам проверяли реакцией с различными аминами под контролем ³¹P-ЯМР-спектроскопии. Реакция соединения (XII) с бензиламином, пропилендиамином и алкилирующим амином в условиях, приведенных в примерах 4а-в, в течение уже 10 мин приводит к количественному образованию соответствующих фосфамидных производных (XIa-в) без повреждения межнуклеотидных фосфотиатных групп. Эти данные свидетельствуют о высокой реакционноспособности соединения (XII) и возможности использования соединения (XII) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Пример 6. Синтез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 3'-фосфамидного производного тритимидилил фосфотиата TpsTpsTp.

TpsTpsTp-N(CH₃)CH₂RCl (XIII).

Реакция 14,9 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли тринуклеозидфосфотиоата TpsTpsTp (IX) с 16,4 мкл (0,2 ммоль) N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида, трифенилфосфина и 21,2 мг (0,1 ммоль) алкилирующего 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметиламина (NH(CH₃)CH₂RCl) (растворенного в 0,1 мл диметилформамида) в условиях, приведенных в примере 4, дает 304 OE₂₆₀ соединения (XIII). Выход 87%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет меньшее время удерживания по сравнению с исходным тринуклеозидфосфотиатом (IX) (см. таблицу). В спектрах ³¹P-ЯМР(ДМФ) обнаружено:
1) сигналы в области 56,0-57,0 м.д. относящиеся к исходным межнуклеотидным фосфотиатным остаткам (ps) [4, 12]
2) полное исчезновение сигналов в области (-0,8) (-1,1) м.д. относящихся к 3'-концевой фосфатной группе [12]
3) появление сигналов в области 7,6-7,8 м.д. относящихся к 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил-3'-фосфамидной группе (p-N(CH₃)CH₂RCl) [5]
Эти данные свидетельствуют о количественном образовании 3'-p-N(CH₃)CH₂RCl производного соединения (IX) и о сохранности межнуклеотидных фосфотиатных групп.

По данным ионообменной хроматографии при кислотном гидролизе (0,1 М HCl, 2 часа при 40^oC) [4]) соединение (XIII) практически количественно превращается в исходной фосфотиат (IX) и остаток алкилирующего амина, что дополнительно свидетельствует о сохранности межнуклеотидных фосфотиатных (ps) групп в полученном алкилирующем производном фосфотиата (XIII) и наличии фосфамидной связи в этом соединении. Эти данные подтверждают структуру полученного фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XIII).

Способность полученного соединения (XIII) избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами проверяли на примере реакции алкилирования этим соединением этилендиамина [13] или тиосульфата натрия [14] Ниже приведены примеры реакции соединения (XIII) с этими нуклеофилами.

Пример 6а. Реакция соединения (XIII) с этилендиамином [25] и тиосульфатом натрия (Na₂S₂O₄) [14]
Аликвоту соединения (XIII) выдерживают в течение 5 часов при 37^oC в 1 М водном растворе этилендиамина. Реакционную смесь анализируют ионообменной хроматографией в условиях, приведенных в таблице. Продукт алкилирования этилендиамина имеет меньшее время удерживания (8,5 мин), чем время удерживания исходного реагента (XII) (9,5 мин). Реакционная способность RCl-групп, определенная таким способом, в соединении (XIII) составляет 89% Далее реакционную смесь подвергают кислотному гидролизу (0,1 г HCl 2 ч при 40^oС [5]), и вновь анализируют полученную реакционную смесь ионообменной хроматографией, при этом образуется исходный фосфотиат (IX) со временем удерживания 18,5 мин. Сохранность составляет 95% Аналогично проверяют реакционную способность соединения (XIII) по отношению к тиосульфату натрия (Na₂S₂O₄) [14] которая составляет 92%
Эти данные свидетельствует о высокой реакционноспособности соединения (XIII) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Пример 7. Синтез (3-амино)пропил-3'-фосфамидного производного тритимидилил фосфотиата.

TpsTpsTp-NH(CH₂)₃NH₂ (XIV)
Реакция 14,9 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли тринуклеозидфосфотиата TpsTpsTp (IX) с 16,4 мкл (0,2 ммоль) N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида, трифенилфосфина и 8,3 мкл (0,1 ммоль) пропилендиамина в условиях, приведенных в примере 4, дает 237 OE₂₆₀ соединения (XIV). Выход 95%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии имеет меньшее время удерживания по сравнению с исходным тринуклеозидфосфотиатом (IX). ³¹P-ЯМР (ДМФ) d_ps 55,7-57,3 м.д. По данным ионообменной хроматографии при кислотном гидролизе (0,1 М HCl 2 часа при 40^oC) соединение (XIV) практически количественно превращается в исходный фосфотиат (IX). Эти данные подтверждают структуру полученного соединения. Наличие алифатических аминогрупп в полученном соединении подтверждали реакцией с N-(2-оксиэтил)феназинием [14] которая количественно завершается за 10 мин (см. ниже пример 8а) с образованием соединения (XV), что показывает возможность использования соединения (XIV) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента с аминолинкерной группой.

Пример 8. Синтез производного тритимидилилфосфотиата, содержащего на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназиния.

TpsTpsTp-NH(CH₂)₃NH-Phn (XV)
а) синтез исходя из соединения (XIV)
14,4 мг (0,01 ммоль) соединения (XIV), содержащего концевую алифатическую группу, растворяют в 200 мкл 0,05 М раствора хлорида N-(2-оксиэтил)феназиния в 0,1 M Na₂CO₃^ выдерживают 10 мин и добавляют 5 мл 2%-ного раствора LiClO₄ в ацетоне. Осадок отделяют, растворяют в воде (100 мкл), и процедуру осаждения повторяют 2 раза. Полученное этим методом соединение (XV) выделяют ионообменной хроматографией. Получают 307 OE соединения (XV). Выход 88%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет меньшее время удерживания по сравнению с исходным (IX) и промежуточным (XIV) соединениями и элюируется в виде окрашенного в фиолетовый цвет соединения. При обращенно-фазовой хроматографии продукт элюируется в виде смеси изомеров, время удерживания которых больше, чем время удерживания исходного и промежуточного соединений (IX) и (XIV). В ³¹P-ЯМР-cпектрах (H₂O) обнаруживаются сигналы, соответствующие сигналам межнуклеотидных фосфотиатных групп (ps) ((δ 55,3-55,4 м.д.) и 3'-концевой фосфамидной группе (d 8,7 м.д.). По данным ионообменной хроматографии при кислотном гидролизе (0,1 M HCl 2 часа при 40^oC) соединение (XV) практически количественно превращается в исходный фосфотиат (IX).

Сумма приведенных данных свидетельствует о наличии в полученном соединении межнуклеотидных фосфотиатных остатков и наличии фосфамидной связи.

Электронные спектры поглощения (в воде): l_min 230, 250, 442 нм, λ_max 238, 279, 395 и 549 нм; ε₂₆₀ 34,9 x 10³, ε₃₉₅ 9,4 x 10³, ε₅₃₀ 14,8 x 10³ л моль^-1 cм^-1.

Приведенные электронные спектры поглощения свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния [4] Наличие в электронных спектрах поглощения λ_max 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединения в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использования полученного соединения (XV) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.

б) синтез исходя из соединения (IX)
Реакция 14,9 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли тринуклеозидфосфотиата TpsTpsTp (IX) с 16,4 мкл (0,2 ммоль) N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида, трифенилфосфина и 32 мг (0,1 ммоль) 1,3-пропилендиаминового производного N-(2-оксиэтил)феназиния (NH₂(CH₂)₃NH-Phn) в условиях, приведенных в примере 4, дает 263 OE₂₆₀ соединения (XIV). Выход 75%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим характеристикам (см. таблицу) идентичен продукту, полученному по методу а) (см. пример 8а).

Пример 9. Синтез диметиламинопиридин-3'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-DMAP (XVI)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 4, исходя из соединения (Х).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Реакция полученного реагента с аминами в условиях, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершается в течение 15-20 мин без повреждения межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Эти данные свидетельствует о высокой реакционной способности соединения (XVI) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Пример 10. Синтез N-метилимидазол-3'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA-pMeIm (XVII)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 5, исходя из соединения (Х).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Реакция полученного реагента с аминами в условиях, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершается в течение 10-15 мин без повреждения межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Эти данные свидетельствует о высокой реакционной способности соединения (XVII) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Пример 11. Синтез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 3'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-N(CH₃)CH₂RCl (XVIII)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 6, исходя из соединения (X).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице. Активность RCl-групп при реакции с этилендиамином [13] или тиосульфатом натрия [14] составляет 85 и 90% соответственно, сохранность межнуклеотидных фосфотиатных групп при этом составляет 90 и 95% соответственно.

Эти данные свидетельствует о высокой реакционноспособности соединения (XVIII) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Пример 12. Синтез (3-амино)пропил-3'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH₂)₃NH₂ (XIX)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 7, исходя из соединения (Х).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Наличие алифатических аминогрупп в полученном соединении подтверждали реакцией с N-(2-оксиэтил)феназинием [14] которая количественно завершается за 10 мин (см. ниже пример 13а) с образованием соединения (XX), что показывает возможность использования соединения (XIX) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента с аминолинкерной группой.

Пример 13. Синтез производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназиния.

CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH₂)₃NH-Phn (XX)
a) синтез исходя из соединения (XIX)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8а, исходя из (см. пример 12) соединения (XIX).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Электронные спектры поглощения (в воде): λ_min 228, 245, 442 нм, λ_max 237, 268, 395 и 549 нм; ε₂₆₀ 89,5 x 10³, ε₃₉₅ 9,4 х 10³, ε₅₃₀ 14,8 x 10³ л моль^-1 см^-1.

Приведенные электронные спектры поглощения свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния [14] Наличие в электронных спектрах поглощения λ_max 395 и 529 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединения в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использования полученного соединения (XIX) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.

б) синтез исходя из соединения (X)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8б, исходя из соединения (X).

Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим характеристикам (см. таблицу) идентичен продукту, полученному по методу а) (см. пример 13а).

Ниже приведены примеры использования 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (I) в качестве исходных соединений для получения фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов, содержащих 5'-связанные химические группировки общей формулы (II).

Пример 14. Синтез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

ClRCH₂(CH₃)Np-CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXI)
a). Синтез дезоксиоктануклеотид фосфотиата
CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIa)
Соединение (XXa) получают дефосфорилированием исходного 3'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата (Х) с помощью фермента щелочной фосфотазы в стандартных условиях, приведенных для обычных немодифицированных олигонуклеотидов [8] Продукт выделяют ионообменной хроматографией на носителе Полисил СА. Выход 90% Продукт гомогенен при ионообменной хроматографии и имеет меньшее время удерживания, чем время удерживания исходного недефосфорилированного октануклеотид фосфотиата (X).

Характеристики целевого продукта приведены в таблице.

б). Синтез 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата
pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб)
Соединение (XXб) получают ферментативным 5'-фосфорилированием полученного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXIa) с помощью аденозинтрифосфорной кислоты в присутствии фермента полинуклеотидкиназы в стандартных условиях, приведенных для обычных немодифицированных олигонуклеотидов [8] Продукт выделяют ионообменной хроматографией на носителе Полисил СА. Выход 85% Продукт гомогенен при ионообменной хроматографии и имеет большее время удерживания, чем время удерживания исходного дефосфорилированного октануклеотид фосфотиата (XXIa).

Характеристики целевого продукта приведены в таблице.

в). Синтез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

СlRCH₂(CH₃)Np-CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXI)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 6, исходя из вышеполученного (см. пример 14б) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Активность RCl-групп при реакции с этилендиамином [13] или тиосульфатом натрия [14] составляет 89 и 92% соответственно, сохранность межнуклеотидных фосфотиатных групп при этом составляет 90 и 95% соответственно.

Эти данные свидетельствует о высокой реакционноспособности соединения (XXI) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Пример 15. Cинтез производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего на 5'-конце цепи остаток холестерола (Chol).

Chol-OC(O)(CH₂)₂NH-p-CpaApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXII)
Реакция 34,7 мг (0,01 ммоль) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб) c 16,6 мкл (0,2 ммоль) N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида, трифенилфосфина и 45,8 мг (0,1 ммоль) холестеролового эфира β-аланина (Chol-OC(O)(CH₂)₂NH₂) в условиях, приведенных в примере 4, дает 708 OE₂₆₀ соединения (XXII). Выход 89%
Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и имеет меньшее время удерживания по сравнению с исходным соединением (XXIб) (cм. таблицу). При обращенно-фазовой хроматографии продукт элюируется в виде смеси диастереомеров, время удерживания которых значительно больше, чем время удерживания исходного фосфотиата (XXIб), не содержащего в своем составе остатка холестерола. Эти данные наряду с литературными [3] подтверждают наличие в соединении (XXII) гидрофобного остатка холестерола.

По данным ионообменной хроматографии при кислотном гидролизе (0,1 М HCl 2 часа при 40^oC [5]) соединение (XXIIa) практически количественно превращается в исходный фосфотиат (XXIб). Эти данные показывают наличие в составе соединения (XXII) фосфотиатного олигонуклеотида. Сумма полученных данных подтверждает структуру синтезированного соединения (XXIIa).

Пример 16. Синтез диметиламинопиридин-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

DMAP-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIII).

Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 4, исходя из вышеполученного (см. пример 14б) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Реакция полученного реагента с аминами в условиях, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершается в течение 15-20 мин без повреждения межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Эти данные свидетельствуют о высокой реакционной способности соединения (XXIII) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно 8 (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Пример 17. Синтез N-метилимидазол-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

MeIm-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIV)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 5, исходя из вышеполученного (см. пример 14б) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Реакция полученного реагента с аминами в условиях, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершается в течение 10-15 мин без повреждения межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Эти данные свидетельствует о высокой реакционной способности соединения (XXIV) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Пример 18. Синтез (3-амино)пропил-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.

NH₂(CH₂)₃NH-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXV)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 7, исходя из вышеполученного (см. пример 14б) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Наличие алифатических аминогрупп в полученном соединении подтверждали реакцией с N-(2-оксиэтил)феназинием [14] которая количественно завершается за 10 мин (см. ниже пример 19а) с образованием соединения (XXVI), что показывает возможность использования соединения (XXV) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента с аминолинкерной группой.

Пример 19. Синтез производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего на 5'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназиния.

Phn-NH(CH₂)₃NH-p-CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXVI)
a) синтез исходя из соединения (XXV)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8а, исходя из вышеполученного (см. пример 18) соединения (XXV). Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Электронные спектры поглощения (в воде): λ_min 228, 245, 442 нм, λ_max 237, 268, 395 и 549 нм; ε₂₆₀ 89,5 x 10³, ε₃₉₅ 9,4 x 10³, ε₅₃₀ 14,8 x 10³ л моль^-1 см^-1.

Приведенные электронные спектры поглощения свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния [14] Наличие в электронных спектрах поглощения λ_max 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединения в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использования полученного соединения (XXV) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.

б) синтез исходя из соединения (XXIб)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8б, исходя из соединения (XXIб).

Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим характеристикам (см. таблицу) идентичен продукту, полученному по методу а) (см. 18а).

Ниже приведены примеры использования 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (I) в качестве исходных соединений для получения фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов, содержащих одновременно 3'- и 5'-связанные химические группировки общей формулы (II).

Пример 20. Синтез диметиламинопиридин-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназиния.

DMAP-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH₂)₃NH-Phn (XXVII)
a). Синтез 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиатного производного, содержащего на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназиния
p-CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH₂)₃NH-Phn (XXVIIa)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 14б, путем ферментативного 5'-фосфорилирования вышеполученного 5'-гидроксил, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XX).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

б). Синтез диметиламинопиридин-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназиния
DMAP-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH₂)₃NH-Phn (XXVII)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 4, исходя из вышеполученного (см. пример 20а) 5'-фосфат, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXVIIa).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Реакция полученного реагента с аминами в условиях приведенных в примерах 4а-в количественно завершается в течение 15-20 мин без повреждения межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Эти данные свидетельствуют о высокой реакционной способности соединения (XXVII) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Электронные спектры поглощения (в воде): λ_min 228, 245, 442 нм, λ_max 237, 270, 395 и 549 нм; ε₂₆₀ 99,5 x 10³, ε₃₉₅ 9,4 x 10³, ε₅₃₀ 14,8 x 10³ л моль ^-1 см^-1.

Приведенные электронные спектры поглощения свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния [14] Наличие в электронных спектрах поглощения λ_max 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединения в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использования полученного соединения (XXVII) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.

Пример 21. Синтез N-метилимидазол-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназиния.

MeIm-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH₂)₃NH-Phn (XXVIII)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 5, исходя из вышеполученного (см. пример 20а) 5'-фосфат, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXVIIa).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Реакция полученного реагента с аминами в условиях, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершается в течение 10-15 мин без повреждения межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Эти данные свидетельствуют о высокой реакционной способности соединения (XXVIII) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Электронные спектры поглощения (в воде): λ_min 228, 245, 442 нм, λ_max 237, 268, 395 и 549 нм; ε₂₆₀ 94,5 x 10³, ε₃₉₅ 9,4 x 10³, ε₅₃₀ 14,8 x 10³ л моль^-1 см^-1.

Приведенные электронные спектры поглощения свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния [14] Наличие в электронных спектрах поглощения λ_max 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединения в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использования полученного соединения (XXVIII) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного соединения, меченного интеркалирующим красителем.

Пример 22. Синтез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназиния.

ClRCH₂(CH₃)NpCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp- NH(CH₂)₃NH-Phn (XXIX)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 6, исходя из вышеполученного (см. пример 20а) 5'-фосфат, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXVIIa).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Активность RCl-групп при реакции с этилендиамином [13] или тиосульфатом натрия [14] составляет 87 и 90% соответственно, сохранность межнуклеотидных фосфотиатных групп при этом составляет 90 и 95% соответственно.

Эти данные свидетельствуют о высокой реакционноспособности соединения (XXIX) и возможности использования этого соединения в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагивая межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.

Электронные спектры поглощения (в воде): λ_min 228, 245, 442 нм, λ_max 237, 268, 395 и 549 нм; ε₂₆₀=99,5 x 10³, ε₃₉₅ 9,4 x 10³, ε₅₃₀ 14,8 x 10³ л моль^-1 см^-1.

Приведенные электронные спектры поглощения свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния [14] Наличие в электронных спектрах поглощения λ_max 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединения в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использования полученного соединения (XXIX) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.

Пример 23. Синтез (3-амино)пропил-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназиния.

NH₂(CH₂)₃NH-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp- NH(CH₂)₃NH-Phn (XXX)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 7, исходя из вышеполученного (см. пример 20а) 5%-фосфат, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXVIIa).

Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Электронные спектры поглощения (в воде): λ_min 228, 245, 442 нм, λ_max 237, 268, 395 и 549 нм; ε₂₆₀ 89,5 x 10³, ε₃₉₅ 9,4 x 10³, ε₅₃₀ 14,8 x 10³ л моль^-1 см^-1.

Приведенные электронные спектры поглощения свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния [14]
Наличие алифатических аминогрупп в полученном соединении подтверждали реакцией с N-(2-оксиэтил)феназинием [14] которая количественно завершается за 10 мин (см. ниже пример 24а) с образованием соединения (XXX), что показывает возможность использования соединения (XXIX) фосфотиатного олигонуклеотидного реагента с аминолинкерной группой.

Пример 24. Синтез дезоксиоктануклеотид фосфотиатного производного, содержащего одновременно на 3'- и 5'-концах цепи два остатка N-(2-оксиэтил)феназиния.

Phn-NH(CH₂)₃NH-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp- NH(CH₂)₃NH-Phn (XXXI)
a) синтез исходя из соединения (XXX)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8а, исходя из вышеполученного (см. пример 23) соединения (XXX). Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

Электронные спектры поглощения (в воде): λ_min 230, 242, 442 нм, λ_max 235, 270, 395 и 549 нм; ε₂₆₀ 99,5 х 10³, ε₃₉₅ 18,3 x 10³, ε₅₃₀ 28,9 x 10³ л моль^-1 cм^-1.

Приведенные электронные спектры поглощения свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красителя N-(2-оксиэтил)феназиния [14] Наличие в электронных спектрах поглощения λ_max 395 и 549 нм и ε₃₉₅ 18,3 x 10³, ε₅₃₀ 28,9 x 10³ л моль^-1 см^-1 свидетельствует об увеличении окрашенности полученного соединения в видимой области светового спектра по сравнению с исходным соединением (XX), содержащим один остаток феназиния, примерно в два раза и показывает возможность использования полученного соединения (XXXI) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченого интеркалирующим красителем.

б) синтез исходя из соединения (XXVIIa)
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8б, исходя из соединения (XXVIIa).

Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим характеристикам (см. таблицу) идентичен продукту, полученному выше по методу а) (см. пример 24а).

a) колонка 4,6 х 250 мм с Полисил-СА, градиент концентрации KH₂PO₄ (0 __→ 0,3 М за 60 мин) в 20% CH₃CN, скорость элюции 2 мл/мин.

б) колонка 4,6 х 250 мм с Lichrosorb RP-18, градиент концентрации CH₃CN (0 __→ 80% за 80 мин) в 0,05 М LiClO₄, скорость элюции 2 мл/мин.

^* два диастереомера;
^** смесь диастереомеров;
межнуклеотидные фосфотиоатные группы;
остаток бензиламина;
остаток алкилирующего амина;
остаток N-(2оксиэтил)феназиния;
остаток холестерола.

Формула изобретения

1. 3'-Фосфат, N,P-незащищенные фосфотиоатные олигодезокснуклеотиды общей формулы I

где В остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n 1 20,
в качестве исходных соединений для получения фосфотиоатных олигонуклеотидных реагентов для биотехнологических процессов.

2. Фосфотиоатные олигонуклеотидные производные, содержащие 3'- и/или 5'-связанные химические группировки, общей формулы II

где R¹ соединение формулы

В остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n 1 20;
X -H при (3'-реагенты),
при Y -H(5'-реагенты),
(3-, 5^'-реагенты);
R'' остаток аминопиридина, например 4-диметиламинопиридина (ДМАР)

или остаток азола, например N-метилимидазола (MeIm)

или остаток алкилирующего амина, например 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметиламина [HN(CH₃)CH₂RCl]

или остаток алифатического амина, например 1,3-пропилендиамина [NH₂(CH₂)₃NH₂]
-NH(CH₂)₃NH₂,
или аминолинкерная группа с остатком интеркалирующего красителя, например N-(2-оксиэтил)феназиния [-NH(CH)₃HN-Phn]

R''' аминолинкерная группа с остатком интеркалирующего красителя, например N-(2-оксиэтил)феназиния [-NH(CH₂)₃)HN-Phn]
в качестве фосфотиоатных олигонуклеотидных реагентов для биотехнологических процессов.

3. Способ получения фосфотиоатных олигонуклеотидных производных общей формулы II, заключающийся во взаимодействии 3'- или 5'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиоатных олигодезоксинуклеотидов с соответствующими азолами, или аминопиридинами, или производными алифатических аминов, содержащих остатки алкилирующих или интеркалирующих групп, в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин дипиридилдисульфид и N-метилимидазола в качестве катализатора.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2