Способ получения стерильного раствора натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты

 

Использование: химико-фармацевтическая промышленность, медицинская промышленность. Сущность изобретения: молоки рыб гомогенизируют, осадок отделяют и подвергают обработке детергентором и высокосолевым раствором при повышенной температуре, реакционную массу обрабатывают ультразвуком до получения фрагментов ДНК с размером 0,6 - 1,5 Х 10⁶ дальтон, детергент и белок отделяют либо с помощью фильтрации через кизельгур и последующей тонкой фильтрации, либо с помощью микрофильтрации через фильтры с диаметром пор 0,4 - 1,2 мкм, раствор концентрируют ультрафильтрацией, проводят диафильтрацию от остаточного белка и солей, повторно обрабатывают ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с мол.мас. 2,5 - 6,0 Х 10⁵ дальтон, при необходимости добавляют раствор хлористого натрия, концентрируют до желаемого содержания ДНК и осуществляют стерильную фильтрацию. 1 табл.

Изобретение относится к химии биологически активных веществ, конкретно к улучшенному способу получения стерильного раствора нативной натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, который может найти применение в медицинской практике, фармацевтической промышленности, биохимии, косметике и парфюмерии.

Известен способ получения натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с мол.мас. 300-500 тыс. дальтон, заключающийся в том, что в качестве сырья используют сгустки высокополимерной ДНК в 70%-ном этаноле, которые отделяют от спирта, набухают в воде, гомогенизируют и деполимеризиурют ультразвуком. Определяют содержание ДНК в растворе, доводят концентрации ДНК и хлористого натрия до необходимых, фильтруют через фильтры с диаметрами пор 1,2; 0,65; 0,45 и 0,22 мкм и стерильно разливают во флаконы. Выход ДНК 33% от содержания ее в молоках [1] Известен способ получения высокополимерной ДНК, заключающийся в том, что молоки осетровых рыб гомогенизируют в цитратно-солевом растворе, гомогенат центрифугируют, осадок депротеинезируют в присутствии додецилсульфата натрия при 55-60^оС фильтруют с кизельгуром, а затем более тонко через бязь-бумагу-бультинг и осаждают этиловым спиртом [2] Недостатками известного способа получения ДНК с мол.мас. 300-500 тыс. дальтон является использование в качестве исходного сырья высокополимерной ДНК и связанные с ее получением многократные и длительные стадии фильтрации и переосаждений, применение для переосаждений этилового спирта и обусловленная этим высокая пожаро- и взрывоопасность метода, а также относительно низкий выход целевого продукта. Высокополимерная ДНК в виде сгустков трудно поддается стандартизации, может быть инфицирована микроорганизмами, неудобна при технологическом оформлении производства (загрузка, дозирование, набухание). Однако основным недостатком известного способа является трудность масштабирования процесса для промышленного производства целевого продукта.

Целью изобретения является устранение стадии выделения высокополимерной ДНК, что позволяет упростить процесс, осуществить масштабирование и промышленный выпуск целевого продукта, улучшить условия труда, снизить пожаро- и взрывоопасность производства, а также увеличить выход целевого продукта.

Поставленная цель достигается объединением в единый технологический цикл получения стерильного раствора нативной натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты с мол. мас. 2,5 6˙10⁵ дальтон из ДНК-содержащего сырья с использованием баромембранных методов выделения и очистки целевого продукта.

Предлагаемый способ получения ДНК, заключается в том, что молоки осетровых рыб гомогенизируют в цитратно-солевом растворе, гомогенат разделяют, осадок отделяют и обрабатывают детергентом и концентрированным солевым раствором при 55-60^оС, реакционную массу охлаждают, осуществляют предварительную ультразвуковую обработку реакционной смеси с использованием типового комплекта оборудования в условиях, обеспечивающих получение ДНК с мол.мас. равной 0,6-15 х 10⁶ дальтон. Детергент и белок отделяют с помощью фильтрации с кизельгуром и последующей тонкой фильтрации, либо с помощью микрофильтрации через фильтры с диаметром пор 0,4-1,2 мкм, после чего реакционную смесь подвергают концентрированию с помощью ультрафильтрации при давлении 0,1-0,8 ати, диафильтрации от остаточного белка и солей, второй ультразвуковой обработке в условиях обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой равной 2,5-6 х 10⁵ дальтон, при необходимости добавляют раствор хлорида натрия, концентрируют до желаемого содержания ДНК и после стерильной фильтрации получают целевой продукт. Выход ДНК составляет 44-48% от количества ДНК, содержащегося в молоках.

Для выделения ДНК используют зрелые молоки рыб, так как содержание ДНК в них составляет >40% в расчете на сухое вещество, а примеси (в особенности РНК) минимальны.

Из вышесказанного следует, что предлагаемый способ существенно упрощает технологию получения ДНК, практически исключает применение этилового спирта в процессе, позволяет легко масштабировать способ и увеличивает выход целевого продукта примерно на 30% Отличительной особенностью предлагаемого способа является получение в едином процессе стерильного раствора нативной натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты с мол.мас. 2,5-6˙10⁵ дальтон из ДНК-содержащего сырья с использованием баромембранных методов выделения и очистки целевого продукта.

Предлагаемый способ позволяет получить стерильный раствор нативной натриевой соли дезоксирибонуклиновой кислоты с мол. мас. 2,5-6˙10⁵ дальтон, который, может найти применение в медицинской практике, фармацевтической промышленности, биохимии, косметике и парфюмерии.

П р и м е р 1. Молоки осетровых рыб в количестве 0,5 кг гомогенизируют в 3 л цитратно-солевого раствора (0,54% цитрата натрия; 0,88% хлорида натрия), полученный гомогенизат разделяют на центрифуге. Надосадочную жидкость сливают, а осадок смешивают с 14 л цитратно-солевого раствора. При непрерывном перемешивании доводят температуру смеси до 55-60^оС и добавляют 2 л 5%-ного раствора додецилсульфата в 35%-ном водном растворе этилового спирта и выдерживают при перемешивании и постоянной температуре в течение 1,5 ч, добавляют 17 л концентрированного цитратно-солевого раствора (29% хлорида натрия; 4,8% цитрата натрия), нагревают до 55-60^оС и выдерживают при этой температуре еще 1,5 ч, затем охлаждают до 10-12^оС и подвергают ультразвуковой обработке до получения времени истечения озвученной реакционной массы на вискозиметре ВПЖ-2 20-25 с, что соответствует молекулярной массе ДНК 8 8˙10⁵ дальтон. Детергент и белок отделяют фильтрацией суспензии с кизельгуром и последующей тонкой фильтрацией. Очищенный раствор концентрируют с помощью ультрафильтрации при давлении 0,5 ати, проводят диафильтрацию для отделения от остаточного белка и солей. Получают 5 л очищенного раствора с концентрацией ДНК ≈0,3% (концентрацию ДНК определяют спектрофотометрическим методом), который обрабатывают ультразвуком до получения ДНК с мол.мас. 2,7˙10⁵ дальтон, концентрируют до содержания ДНК 0,58% и добавляют раствор хлорида натрия. Полученный раствор фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и разливают во флаконы в стерильных условиях. Выход 46,5% от количества ДНК, содержащегося в молоках. Гиперхромный эффект 42% Остальные примеры сведены в таблицу.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРИЛЬНОГО РАСТВОРА НАТРИЕВОЙ СОЛИ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, включающий перевод ДНК в жидкую фазу, обработку раствора ДНК ультразвуком, фильтрацию, стандартизацию по хлористому натрию и стерильную микрофильтрацию, отличающийся тем, что перевод ДНК в жидкую фазу осуществляют путем гомогенизации молок рыб в цитратно-солевом растворе, разделения гомогената, обработки осадка детергентом и концентрированным солевым раствором при 55 - 60^oС, охлаждения реакционной массы, предварительной ультразвуковой обработки ее с использованием типового комплекта оборудования в условиях, обеспечивающих получение ДНК с мол. м. 0,6 · 10⁶ - 1,5 · 10⁶ дальтон, реакционную смесь после фильтрования подвергают концентрированию с помощью ультрафильтрации при давлении 0,1 - 0,8 ати, диафильтрации, второй обработке ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с мол. м. 2,5 · 10⁵ - 6,0 · 10⁵ дальтон и концентрированию.

РИСУНКИ

Рисунок 1