Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к дифференцировочному антигену лимфоцитов человека
Изобретение относится к биотехнологии , а именно к гибридомной технологии, и может быть использовано для выявления дифференцировочного антигена Т- и В-лимфоцитов человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к дифференцировочному антигену лимфоцитов человека Штамм получен при соматической гибридизации клеток мышиной миеломы РЗ-Х63 Ад8 653 им клеток се лезенки мыши линии BALB/c. иммунизированной клетками В-лимфобластоидной линии человека - RPMI 1788 Клетки штамма секретируют МонАТ принадлежащие к классу IgM Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ 282Д Эти антитела выявляют дифференцировочный антиген лимфоцитов человека экспрессированный на поверхности активированных Т- и В-лимфоцитов Секреция моноклонального антитела на 3 4 день культивирования составляет 10-15 мкг в 1 мл к/льтуральчои среды и 3-5 мг в 1 мл асцитической жидкости Условия культивирования типичны для гибридом (Л с
СОК33 СОВЕТСКИХ сОциАлистических
РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/18
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИ ГЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,6д
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4711511/13 (22) 29.06.89 (46) 15,10.91. Бюл. ¹ 38 (71) Институт проблем онкологии им. P.Å.Êàвецкого (72) С.П.Сидоренко, Е.П.Ветрова, А.Г.Бердова и Л.Н,Шлапацкая (53) 578.085.23(088,8) (56) Stein Н. et а! "Blood", ч.66, ¹ 4, р.848—
858, 1985. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛ ЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS
MUSCULUS L — ПРОДУЦЕНТ MOHOKJIQНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ КДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНОМУ АНТИГЕНУ ЛИМФОЦИТОВ
ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, и может быть использовано для выявления дифференцировочного антигена Т- и В-лимфоцитов человека. Целью изобретения являИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления дифференцировочного антигена Т- и
В-лимфоцитов человека.
Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (мон AT) к дифференцировочному антигену лимфоцитов человека, Штамм получают следующим образом.
Штамм клеток ИПО-Е8 получают при соматической гибридизации клеток селезенки мыши BALB/c, иммунизированной клетками линии RPMI-1788 (В-лимфоциты. Ы „, 1684338 А1 ется получение штамма гибридных клеток. продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к дифференцировочному антигену лимфоцитов человека. Штамм получен при соматической гибридизации клеток мышиной миеломы Р3-Х63-Ag8.653 им клеток селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной клетками В-лимфобластоидной линии человека — RPMI--1788.
Клетки штамма секретируют МонАТ, принадлежащие к классу IgM. Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ 282Д. Эти антитела выявляют дифференцировочный антиген лимфоцитов человека, экспрессированный на поверхности активированных
Т- и В-лимфоцитов. Секреция моноклонального антитела на 3-4 день культивирования составляет 10 — 15 мкг в 1 мл культуральной среды и 3 — 5 мг в 1 мл асцитической жидкости. Условия культивирования типичны для гибридом. периферической крови человека. трансформированные вирусом Эпштейна-Барр) и миеломной линией РЗ-Х63-Ag8.653, Слияние клеток миеломы с клетками селезенки мыши и бридных клеток проведено с помощью
ГАТ-среды (конечная концентрация гипоксантина 10, аминоптерина 4х10 М, тимидина 1,6х10 М). Скрининг специфической антительной активности проводят методом иммунофлуоресценции в непрямом варианте на монослое живых клеток на линии клеток RPMI-1788. После клонирования, реклонирования и пассирования in vitro отбирают 1 клон гибридомы ИПО-ЕЯ, клетки которого активно продуцируют антитела к поверхностным энтигенам линии клеток
RPMI-1788. Штамм сбознэчен ИПО-Е8, он
)(ðaH1 тся в Специализированной коллекции перевиваемых сомэт1ческих клеток позво- 5 ночных Инсти)ута цитологии АН СССР под номером 281Д и харак1eðè tóåòñë следук)щими признаками.
Морфологические П1)изнаки, Клетки гибридомы являются лимфобла- 10 стэми со средним ядерно-цитоплээматическим отношением, слабобазофильной цитоплазмой, сетчатой сРруктурой хромэтинэ
IpN цитохимичесхом исслеДОвэнии в !5 цитоплазме клеток ье обнэоуженэ активность ферментов пероксидазы и щелочной фосфатаэы. Активность <ислой фосфатазы, неспецифической экстеразы очень слабая диффузная. 20
Культуральнь!е признаки, Для выращивания клеток ИПО-Е8 используют пластикову о . стеклянную посуду. Посевная доза 100 ть1с. клеток На миллилитр. Клетки пассируют один I)aa в 25
3 — 4 дня, кратность рассева 1:7. Культура суспензионна». Среда f
При г1ассировании штамма на мышах линии BALB/с доза 1<ле-OK при прививке (Остэвляет i 0 в 5 мл среды Иг!1а, Мышам За
7-30 дней до инъекцп клеток вводят внут- 35 рибрюшинно г,ристэн. Асцит формируется через 12 — 14 дней. Секое.сия моноклональных антител на 3-4 день к льтивироваиия составляет 10 — ",5 мкг ь 1 мл культуральной среды и 3-5 "If в 1 мл ас- 40 ц ITHoA )кидкости.
Режим криоконсервирования, Для длР)тельноР О храРfeния;<леток штамм эамора::<ивают в .-мбрионэльной ie Лячьей сывооо <е с доб)авлением 10 / диме- 45
1илсульфОксиДЯ, Ре)ким заморэ)кивэния, 4 в минуту qo 4" С, .затем 1 ll минуту ДО -70 С, далее клетки переносят в;;<идкий ээг)т.
Гибридому размораживэют при переносе ампулы с клетками иa жидкого азота в 50 водяную баню при 37 0. >< .Изнеспособность
t ëeTof(после рээмо рак<ива ния 70 80 о пс
Окрашиванию трипановым синим.
Контаминация бак)ериями, грибами и микоплазмой не обнаружена, 55
Характеристика МонАТ, МонАТ (ИПО 4) относится к IgM классу, СпецифичностР- МонАТ ИПО-, изучают на
18 линиях клеток 4el)0 BeKH различного про»o",foæäPíèÿ, Среди них "1РМ -1788, РН S
GRO (В-лимфоциты человека, трансформированные lf) vltfo вирусом Эпштейна-Барр), Daudi, Namolva, Raji, Ramos, ЕВ-3 (лимфома
Беркитта), RPMI-8226 (множественная миелома), Т-клеточные линии M0LT-4. CCRFHsВ2, Jul kat, СЕМ, MT-4, Н9. эритробластоидная линия К-652, МеЧЧО (меланома), А-431 (аденокарцинома шейки матки). Все линии клеток культивируют на среде RPMI-1640 с 10О/; инактивировачной эмбриональной телячьей сьРворотки. Кроме того, используют лимфоциты крови, стимулированные митогенами, клетки крови и кроветворных органов 10 практически здоровых людей, 66 больных с различными вариантами лимфоидных форм лейкоэов, 3 больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), 33 больных лимфогранулематоэом (Л ГМ) и неходжкинскими злокачественными лимфомами (НЗЛ), клетки миндалин 7 детей с хроническим тонзиллитом в фазе компенсации.
МонАТ ИПО-4 не взаимодействуют с антигенэми гранулоцитов крови практически здоровых людей и клетками периферической крови больных ОЛЛ, Только в единичных случаях клетки периферической крови
ООЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМфОЛЕйКОЗОМ (ХЛЛ), миеломной болезнью (МБ) имеют поверхностный антиген, выявляемый MI ИПО-4, Вместе с тем у 8 из 25 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) количест.-;о клеток, с которыми связывают ан,итела, до.;тигэет 4,5-18,4 Д, Во всех случаях волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ) обнаружен антиген, определяемый МонАТ ИПО-4, С МонАТ ИПО-4 реагируют 13,0% клеток миндалин детей с хроническим 1онзиллитом и 6,0 — 10 4 мононуклеаров периферической крови доноров. Клетки лимфатических узлов больных ЛГМ и НЗЛ также в основном содержат антиген, определяемый Ы,"онАТ ИПО-4. Пример l. Лимфоциты из гепаринизированной периферической крови донора выделяют с помощью дифференциального центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (cl 1,077 в течение 30 мин при 400g), Клетки, отобранные с интерфазы, Отмывают путем трехкратного центрифугирования (5 мин при 2х10 об/мин) в растволре Хенкса, рН которого 7,2 — 7,4. Лим оидные клетки в концентрации 4х10 /мл в ГЛАРХ наносят в лунки на предметные стекла. Инкубируют препарат 45 мин при 37" С во влажной камере. Отмывают в 3 стаканчиках с ГЛАРХ. Наносят по 0,05 мл супернатэнтэ гибридомы ИПО-Е8 на лунку. Супернатант инкубируют 20 мин при 37" С ао влажной камере, отмывают в 3 стаканчиках 1684338 Составитель Н. Маныкин Редактор В. Трубченко Техред М.Моргентал Корректор T. Палии Заказ 3486 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 10; с ГЛАРХ, Наносят меченую Fl ГС кроличью сыворотку против Ig мыши в разведении 1;16 по 0,05 мл на лунку. Препарат инкубируют 20 мин при 37 С во влажной камере, а затем отмывают в трех стаканчиках с 5 ГЛАРХ и высушивают на воздухе. Удаляют парафильм, наносят 50% глицерина íà PBS, покрывают препарат покровным стеклом и запаивают парафином. Исследуют препарат в люмин::центном микроскопе. Зеле- 10 ное свечение наблюдают на поверхности 5% клеток, т.е. в периферической крови донора 5% клеток несут поверхностный антиген, выявляемый МонАТ ИПО-4. Пример 2. Лимфоциты имеют повер- 15 хностные рецепторы для некоторых белков растительного и бактериального происхождения, обладающих митогенным действием. К числу наиболее распространенных митогенов относятся фитогемагглютинин 20 (ФГА), конканавалин А (Кон А), бактериальный липополисахарид (ЛПС). митоген лаконоса (РР/М) и др. Бласттрансформированная куль ура лимфоцитов является удобной моделью для 25 изучения маркеров дифференцировки лимфоцитов. Проводят изучение экспрессии антигена, определяемого МонАТ Mll0-4, на лимфоцитах периферической крови доноров, подвергшихся действию различных ми- 30 тогенов. ЛПС вЂ” В-клеточный тимус-независимый митоген. Клетками-мишенями для ЛПС является фракция В-лимфоцитов, имеющих большую плотность (cI = 1,073-1,080). Через 35 24 ч в культурах, стимулированных ЛПС, не замечено существенных изменений в количестве клеток, реагирующих с МонАТ ИПО4. Через 72 ч после ЛПС стимуляции в кул туре начинают появляться клетки ти:бластов. которые при постановке реа ции непр".;ой иммунофлуоресценции дают полож.:.тельную реакцию с МонАТ ИПО-4. М тоген лаконоса (Р1%М) вызывает Т завис .мую дифференцировку В-лимфоцитов периферической крови чел-века, Пик экс рессии антигенов, определяемый МонА i ИПО-4, наблюдают на 7-й день культи вирования. У некоторых доноров при стимуляции мононуклеаров перифериче ской крови PWM отмечают дополнительный подъем числа ИПО-4 клеток на 2--3 день культивигования. ФГА и Кон А — гликопротеиды, которые стимулируют- преимущественно T-лимфоциты. Пик митогенной активности ФГА приходится на 50-60 ч культивиров"íèÿ,,а Кон А— на 96 ч после добавлени митогсна. Поэтому МонАТ ИПО-4 клетки определяю при ФГА стимуляции на 3-день стимуляции лимфоцитов периферической крови человека и на 4-й день стимуляции Кон А. Отмечают увеличение МонАТ ИПО- Г клеток при стимуляции как ФГА, так и Кон А мононуклеаров перифери геской крови человека. На основании анализа специфи-.ности МонАТ ИПО-4 можно заключить, что антитела, секретируемые клетками цггамма ИПОЕ8 мышиной гибридомы, выявляют антиген-активировлнные 1- и В-лимфоциты человека. Формула изобретения штамм гибридных культиBèðóåìûх клеток животных Mus mu sculu s ВСКК/П/ М 281Д вЂ” продуцент моноклональнь.х антител K дифференцировочному антигену лимфоцитов человека.
