Способ синтеза дез-гли 10, /d-лей 6/ lh-rh-этиламида

 

Изобретение относится к органической химии, в частности к препаративному пептидному синтеза аналогов люлиберина в растворе. Цель изобретения - удешевление и расширение технологических возможностей способа. Способ заключается в том, что синтез осуществляют конденсацией производных аминокислот методом последовательно-параллельного наращивания пептидной цепи по схеме: Достоинствами предлагаемого способа являются: использование незащищенного по гуанидиновой группе аргинина; синтез фрагментов 1 - 2 и 3 - 4 с незащищенными С-концевыми карбоксильными функциями. Предлагаемый способ позволяет проводить препаративный синтез. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к органической химии, в частности к препаративному пептидному синтезу аналогов люлиберина в растворе.

Аналоги люлиберина (лютеинизирующего гормона рилизинг-фактора LH-RH) широко используются в медицине и ветеринарии. В частности, аналог, содержащий d-лейцин в положении 6 и этиламид вместо С-концевого амида глицина (коммерческие названия leuprolide и lupron) Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ используется в виде уксуснокислой соли как эффективное лекарство для лечения рака предстательной железы на стадиях А, В, С и D [1, 2] В связи с этим разработка методов синтеза этого соединения представляет несомненный практический интерес.

Известны способы синтеза дез-Гли¹⁰, [d-Лей⁶]-LH-RH-этиламида [3, 4] Наиболее близким к предлагаемому способу является способ синтеза, описанный в [4] Способ заключается в том, что синтез осуществляют конденсацией производных аминокислот методом последовательно-параллельного наращивания пептидной цепи по схеме I: Недостатками известного способа синтеза являются: использование защищенного по гуанидиновой группе аргинина; использование С-концевых защит при синтезе фрагментов 1 3 и 4 5; использование раствора бромистого водорода в уксусной кислоте для деблокирования аминогрупп. Указанные недостатки удорожают способ и увеличивают количество стадий, что ограничивает технологичность способа.

Цель изобретения удешевление и расширение технологических возможностей способа.

Способ заключается в том, что синтез осуществляют конденсацией производных аминокислот методом последовательно-параллельного наращивания пептидной цепи по схеме 2: Достоинствами предлагаемого способа являются: использование незащищенного по гуанидиновой группе аргинина; синтез фрагментов 1 2 и 3 4 с незащищенными С-концевыми карбоксильными функциями.

Предлагаемое техническое решение является промышленно применимым, т.к. настоящая схема синтеза позволяет осуществлять препаративный синтез дез-гли¹⁰,[d-лей⁶]-LH-RH-этиламида.

П р и м е р 1. Синтез Z-Leu-Arg.

19,32 г Z-Leu-ONp (50 ммоль) растворяют в 100 мл ДМФА, добавляют 10,45 г (60 ммоль) аргинина и смесь перемешивают на магнитной мешалке 48 ч. По окончании реакции реакционную смесь упаривают до густого масла, растворяют в хлороформе и наносят на колонку 3х30 см с силикагелем, уравновешенным хлороформом. Колонку промывают хлороформом до исчезновения желтого цвета и продукт элюируют смесью хлороформ/метанол 40:60. Раствор продукта в элюенте упаривают досуха, заливают эфиром и оставляют в холодильнике до окончания кристаллизации. Полученные кристаллы отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. Выход 18,116 г, 43 ммоль, 86 П р и м е р 2. Синтез Z-d-Leu-Leu-Arg.

30,33 г Z-Leu-Arg (72 ммоль) гидрируют в метаноле с Рd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха и остаток растворяют в 100 мл ДМФА. К полученному раствору добавляют раствор 27,82 г (72 ммоль) Z-d-Leu-ONp в 50 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают сутки, упаривают до густого масла, растворяют в 100 мл метанола, добавляют 200 мл воды и метанол отгоняют на роторном испарителе. Смесь выдерживают в холодильнике сутки, воду сливают, остаток растворяют в смеси 100 мл метанола и 100 мл диоксана, упаривают досуха, растворяют в 100 мл метанола и высаживают 300 мл эфира. Полученные кристаллы отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. При неполном отделении пара-нитрофенола кристаллизацию эфиром из метанола следует повторить. Выход 34,22 г (64 ммоль), 88.9 П р и м е р 3. Синтез BOC-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg.

30,48 г (57 ммоль) Z-d-Leu-Leu-Arg растворяют в 100 мл ДМФА. добавляют 350 мл МеОН и гидрируют с Рd/C в качестве катализатора. По окончании реакции метанол и воду отгоняют на роторном испарителе, к остатку добавляют 26,7 г ВОС-Тyr(Bzl)-OSu в 300 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают сутки, упаривают досуха на роторном испарителе, растворяют остаток в 100 мл метанола, добавляют 300 мл воды и метанол упаривают на роторном испарителе. Реакционную массу выдерживают ночь в холодильнике, водный раствор над маслянистым осадком сливают, операцию повторяют и осадок кристаллизуют под гексаном. Выход 39,8 г, 52,79 ммоль, 92,6 П р и м е р 4. Синтез Z-Pro-NH-C₂H₅.

49,85 г Z-Pro-OH (200 ммоль) и 25,6 мл N-этилморфолина (200 ммоль) растворяют в 400 мл ДИФА. Смесь охлаждают до -30^oC и небольшими порциями в течение 2 мин добавляют 27,3 мл (210 ммоль) изобутилхлорформиата. Через 2 мин при энергичном перемешивании к смеси добавляют порциями в течение 5 мин 30 мл 50-ного раствора этиламина в диоксане. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при охлаждении и ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают досуха, растворяют в хлороформе и промывают последовательно 1 н. серной кислотой в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия, карбонатом натрия в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия и водой, упаривают и остаток кристаллизуют из изопропанола гексаном. Выход 43,4 г, 157,2 ммоль, 78,6
П р и м е р 5. Синтез ВОС-Тyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅.

5,713 г (20,7 ммоль) Z-Pro-NH-C₂H₅ гидрируют в метаноле с Рd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, добавляют 10,41 г (13,8 ммоль) ВОС-Тyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg, 4,3 г НОВt, охлаждают и добавляют 4,35 г DCC. Реакционную смесь перемешивают 48 ч, отфильтровывают дициклогексилмочевину, фильтрат упаривают досуха, добавляют 200 мл эфира и охлаждают. Выдерживают ночь в холодильнике, эфир сливают, остаток растворяют в смеси 400 мл хлороформа и 100 мл бутанола и промывают последовательно 1 н NaOH в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия, 1 н. НСl в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия до нейтральной реакции и водой. Органическую фазу упаривают досуха на роторном испарителе во взвешенной колбе. Выход 11,81 г, 13,46 ммоль, 97,6
П р и м е р 6. ВОС-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅.

7,017 г (8 ммоль) ВОС-Тyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ растворяют в 50 мл ТFA и 10 мл анизола. Реакционную смесь перемешивают 30 мин, упаривают, растворяют в 400 мл хлороформа и 100 мл бутанола, промывают 1 н. NaOH в насыщенном растворе хлористого натрия, 5 -ным раствором соды в насыщенном растворе хлористого натрия, упаривают досуха, растворяют в 50 мл ДМФА, добавляют 8 ммоль ВОС-Trp-Ser-OH, полученного разложением 4,582 г (8 ммоль) дициклогексиламмонийной соли ВОС-Trp-Ser-OH^*, и 1,08 г НОВt. Реакционную смесь охлаждают и добавляют 1,68 г DCC. Реакционную смесь перемешивают 48 ч, отфильтровывают дициклогексилмочевину, фильтрат упаривают досуха, добавляют 200 мл эфира и охлаждают. Выдерживают ночь в холодильнике, эфир сливают, остаток растворяют в смеси 400 мл хлороформа и 100 мл бутанола и промывают последовательно 1 н. NaOH в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия, 1 н. НСl в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия до нейтральной реакции и водой. Органическую фазу упаривают до густого масла и остаток кристаллизуют из метанола эфиром. Выход 6,457, 5,44 ммоль, 68
^*Примечание: Дициклогексиламмониевую соль ВОС-Тrp-Ser-OH синтезируют любым из известных описанных в литературе способов.

П р и м е р 7. Синтез Z-Pyr-His.

1,862 г (12 ммоль) L-гистидина, растворяют в 6 мл 2 н. NaOH и при перемешивании добавляют 3,843 г (10 ммоль) Z-Pyr-ONp в 20 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают сутки, упаривают досуха, растворяют в 50 мл 1 н. НСl и экстрагируют 100 мл эфира. Водную фазу отделяют, подщелачивают до рН 4,5 5,5 и оставляют на сутки в холодильнике. Осадок отфильтровывают и сушат на воздухе. Выход 1,473 г, 3,68 ммоль, 36,8
П р и м е р 8. Синтез Z-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅.

5,104 г (4,3 ммоль) ВОС-Тrp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-C₂H₅ растворяют в 50 мл ТFA и 10 мл анизола. Реакционную смесь перемешивают 30 мин, упаривают, растворяют в 400 мл хлороформа и 100 мл бутанола, промывают 1 н. NaOH в насыщенном растворе хлористого натрия, 5% -ным раствором соды в насыщенном растворе хлористого натрия, упаривают досуха, растворяют в 50 мл ДМФА, добавляют 1,722 г (4,3 ммоль) Z-Pyr-His, 0,581 г НОВt, охлаждают и добавляют 1,26 г DCC. Реакционную смесь перемешивают 48 ч, отфильтровывают дициклогексилмочевину, фильтрат упаривают досуха, добавляют 200 мл эфира и охлаждают. Выдерживают ночь в холодильнике, эфир сливают, и остаток дважды кристаллизуют из метанола эфиром и один раз из спирта водой с добавлением слабого раствора хлористого натрия. Выход 4,53 г, 3,08 ммоль, 71,7
П р и м е р 9. Синтез Рyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ (вариант 1).

4,53 г Z-Pyr-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ (3,08 ммоль) гидрируют в водном этаноле, содержащем 5 уксусной кислоты с Pd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают и фильтрат наносят на колонку 2,6х40 см с сульфопропил-сефадексом С-25, уравновешенную 0,2 М пиридиний-ацетатным буфером, рН 5,0. Колонку промывают стартовым буфером и продукт элюируют в градиенте ионной силы 0,2 0,6 М (по 1 л). Фракции, содержащие продукт с чистотой выше 85 объединяют, упаривают и рехроматографируют на колонке 2,5х90 см с сульфопропил-сефадексом в градиенте ионной силы 0,3 0,5 М (по 2 л). После повторной хроматографии объединяют фракции, содержащие продукт требуемой чистоты и объединенные фракции лиофилизуют. Выход продукта с чистотой 98 (по данным ВЭЖХ) 2,385 г, 1,88 ммоль, 61
П р и м е р 10. Синтез Рyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ (вариант 2).

4,53 г Z-Рyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ (3,08 ммоль) гидрируют в водном этаноле, содержащем 2 уксусной кислоты с Рd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают и фильтрат наносят на колонку 2,6х40 см с сульфопропил-сефадексом С-25, уравновешенную 0,2 М ацетатно-аммиачным буфером, рН 5,0. Колонку промывают стартовым буфером и продукт элюируют в градиенте ионной силы 0,2 0,6 М (по 1 л). Фракции, содержащие продукт с чистотой выше 85 объединяют, упаривают и рехроматографируют на колонке 2,5х90 см с сульфопропил-сефадексом, уравновешенным 0,3 М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0, в градиенте ионной силы 0,3 0,5 М. После повторной хроматографии объединяют фракции, содержащие продукт требуемой чистоты, объединенные фракции упаривают до небольшого объема и наносят на колонку (2,5х100 см) с Toyopearl HW-40F, уравновешенную 2-ной уксусной кислотой. Элюируют продукт тем же элюентом, объединяют фракции, содержащие продукт требуемой чистоты и объединенные фракции лиофилизуют. Выход продукта с чистотой 99 + (по данным ВЭЖХ) 2,111 г, 1,66 ммоль, 54
Список используемых сокращений: ДМФА диметилформамид, DCC - дициклогексилкарбодиимид, ТFA трифторуксусная кислота, НОВt - 1-гидроксибензотриазол, НОNB N-гидрокси-5-норбонен-2,3-дикарбимид, DNP - динитрофенил, Z бензилоксикарбонил, Bzl бензил, ВОС - трет-бутоксикарбонил.

Формула изобретения

1. Способ синтеза дез-гли¹⁰, [D-лей⁶]-LH-RH-этиламида: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-ProNHC₂H₅, включающий последовательно-параллельное наращивание пептидной цепи с использованием активных эфиров защищенных аминокислот и дициклогексилкарбодиимида в присутствии нуклеофильных добавок, причем в качестве защитных групп для α-аминогрупп аминокислот используют карбобензокси- и третбутилоксикарбонил-; серин и гистидин используются с незащищенными боковыми функциями, с последующей многоступенчатой хроматографической очисткой конечного продукта, отличающийся тем, что синтез фрагментов и их конденсацию проводят по схеме 2+[2+(4+1)] в качестве нуклеофильной добавки используется N-гидроксибензотриазол, аргинин используется в синтезе с незащищенной боковой функцией, гидроксильная группа тирозина защищена бензильной защитной группой, a-карбоксильные группы аминокислот не защищаются, а многоступенчатую хроматографическую очистку конечного продукта выполняют методом двукратной ионообменной хроматографии на SP-сефадексе в градиенте пиридинийацетатного буфера.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что многоступенчатую хроматографическую очистку конечного продукта выполняют методом ионообменной хроматографии на SP-сефадексе в градиенте пиридинийацетатного буфера, с последующей ионообменной рехроматографией на SP-сефадексе в градиенте аммонийацетатного буфера и хроматографией на носителе Toyopearl HW-40 в среде 2%-ной уксусной кислоты.