Производные пептидов или их физиологически приемлемые соли

 

Использование: в медицине, как соединения, проявляющие лечебные свойства при воздействии на патологические состояния, вызываемые брадикинином или родственным брадикинину пентидом. Сущность изобретения: производные пентидов общей формулы I H(D)Arg - Arg - Hyp - Gly - X - Ser - (D)eTic - Oic -ArgOH, где X- Leu, Tbg или Cha или их физиологически приемлемые соли. Пептиды синтезированы ступенчато с помощью пептидного синтезатора модели 430 А при использовании п - бензилоксибензилспиртовой смолы и F - moc Arg(MtR) -OH в качестве исходной C - концевой аминокислоты. 1 з. п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение касается производных пептидов с брадикининантагонистическим действием.

Брадикининантагонистические пептиды известны [1] у них кроме прочего, L-Pro, в позиции 7 пептидного гормона брадикинина или другого аналога брадикинина заменен на D-аминокислоту, такую как D-Phe, D-Thia, D-Pal, CDF, D-Nal, MDV, D-Phy, D-His, D-Trp, D-Tyr, D-hPhe, D-Val, D-Ala, D-His, D-Ile, D-Leu, DOMT.

В основе изобретения лежит задача открыть новые эффективные пептиды с брадикининантагонистическим действием.

Эта задача решается благодаря производным пептидов общей формулы I A-B-C-E-F-K-(D)Tic-G-M-F'-Y (I) A H/D/Ary, B Ary, C Pro Hyp Gly, E Leu, Tby или Cha; F Ser, K, M простая связь, G Oic, F Ary; Y OH, или их физиологически приемлемым солям.

Производные пептидов общей формулы I проявляют лечебные свойства при воздействии на патологические состояния, вызываемые брадикинином или родственным брадикинину пептидом. Пептиды изобретения были получены общеизвестными способами пептидной химии, в основном с помощью трехфазного синтеза [2] или эквивалентными известными способами. В качестве 2-аминозащитной группы используют уретан защитные группы, такие как трет-бутилоксикарбонил (Boc)- или фторенилметилоксикарбонил (Fмос) защитная группа. Если для предотвращения побочных реакций или для синтеза особых пептидов необходимо, то функциональные группы в боковой цепи аминокислот защищены дополнительно надлежащими защитными группами (см. Т.В. Грин. Защитные группы в органическом синтезе), причем в первую очередь используют Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Arg(PMC), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys(4-Mebzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), His(Fmos), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-z), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl), Thr(But), Trp(Mts), Trp(CHO), Tyr(Br-z), Tyr(Bzl), или Tyr(Bur) eingesetzt werden. Трехфазный синтез начинается на оканчивающемся на С-конце пептида с соединения защищенной аминокислоты с соответствующей смолой. Такого рода исходные вещества могут быть получены благодаря соединению защищенной аминокислоты с хлорметил-, гидроксиметил-, бензгидриламино(ВНА)-, метилбензгидридамино (МВНА)-группой, модифицированной полистирол- или полиакриламидной смолой через эфирную или амидную связь. Использованные в качестве вещества носителя смолы, приобретаются коммерческим путем.

Обычно используют БНА- и МВНА-смолы; если синтезированный пептид должен содержать на С-конце свободную карбамоил-группу. Если пептид должен иметь вторичную амидную группу на оканчивающемся на С-конце, то используется хлорметил- или гидроксиметил-смола, и отщепление проводится с соответствующими аммиаками. Если хотят получить, например, этиламид, то пептид может отщепляться от смолы этиламином, причем отщепление боковых цепей защитных групп происходит вслед за тем с помощью других надлежащих реактивов. Если в пептиде должны оставаться сохраненными трет-бутилзащитные группы аминокислой боковой цепи, то проводится синтез с Fмос-защитной группой для временной блокировки α-аминогруппы аминокислоты с использованием методики, описанной, напр. у R. C. Sheppard, I. Chem. Soc. Chem. Comm. 1982, 587, причем гуанидино-функция аргинина защищается благодаря протенизации с пиридинием перхлоратом, а защита других функционализированных в боковой цепи аминокислот осуществляется отщепляемым бензил-защитными группами с помощью каталитического трансфоргидрирования (A. Felix и др. I. Org. Chem. 13, 4194 (1978)) или с помощью натрия в жидком аммиака (W. Roberts, I. Am. Chem. Soc. 76, 6203 (1954)).

После отщепления аминозащитной группы, соединенной со смолой аминокислоты надлежащим реактивом, таким как трифторуксусная кислота в хлориде метилена в случае Вос-защитной группы или 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде в случае Fмос.-защитной группы, соединяются (последующие защитные аминокислоты друг за другом в нужной последовательности. Промежуточно возникающие с N-концевым защищенные пептидные смолы разблокируются перед взаимодействием с последующим производным аминокислоты с помощью уже описанных реагентов.

В качестве реагента соединения могут применяться все возможные в пептидном синтезе применяемые реагенты активирования. Методы органической химии, том 15/2, в частности, диимиды уксусной кислоты, такие как N,N'-дициклогексилкарбодиимид, N, N'-диизопропилкарбодиимид или N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбоди- имид. Взаимодействие может проводиться при этом непосредственно с помощью взаимодействия аминокислотного производного с реагентом активирования и, при необходимости, с добавкой, подавляющей рацемизацию, например 1-нитроксибензотриазол (HOBt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 708 (1970) или 3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидробензотриазин (HOObt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 708 (1970)) до смолы, или же предактивирование производного аминокислоты может осуществляться отдельно в виде симметричного ангидрида или HOBt- или HOObt-эфира, а раствор активированных видов в надлежащем растворителе добавляется к способной присоединяться пептидной смоле.

Взаимодействие или активирование производных аминокислоты с одним из названных реагентов активирования может проводиться в диметилформамиде, N-метилпирролидоне или хлориде метилена, или в смеси названных растворителей. Активированное производное аминокислоты применяется обычно в 1,5-4-кратном избытке. В случаях, когда происходит неполное соединение, реакция взаимодействия повторяется без проведения ранее разблокирования α-аминогруппы пептидной смолы, необходимого для соединения последующей аминокислоты.

Успешное течение реакции может контролироваться с помощью ингидрин-реакции (Е. Кайзер и др. в Anal. Biochem 34595 (1970)). Синтез может проводиться также автоматизированно, например, с помощью пептидного синтезатора модели 430 А фирмы Applied Biosystems, причем могут применяться либо программы синтеза, предусмотренные изготовителем прибора, либо же программы самостоятельно составленные эксплуатирующим. Последние используются, в частности, при применении производных аминокислоты, защищенных Fмос-аминогруппой. После синтеза пептидов описанным образом пептид может отщепляться от смолы с помощью таких реагентов, как, например, жидкий фторводород (в основном у пептидов, полученных Вос-методом) или трифторуксусная кислота в основном у пептидов, синтезированных Fmos-методом. Эти реагенты отщепляют не только пептид от смолы, но остальные защитные группы боковых целей производных аминокислоты. Таким образом получают при использовании ВНА- и МВНА-смол пептид в форме свободной кислоты. В случае с ВНА- или МВНА-смолами получают при расщеплении с помощью фторводорода или трифторметансульфоновой кислоты пептид в виде амида кислоты. Другие способы получения пептидамидов описаны в ЕР-А 287 882 и ЕР-А 322 348. Здесь происходит отщепление пептидамидов от смолы при обработке обычно применяемыми в пептидном синтезе среднекислыми кислотами, например трифторуксусная кислота, причем в качестве связывающих катионы добавляются такие вещества, как фенол, крезол, тиокрезол, анизол, тиоанизол, этандитиол, диметилсульфид, этилметилсульфид или подобные обычные в твердофазовом синтезе ловушки катонов порознь или в смеси двух или нескольких таких вспомогательных веществ. Трифторуксусная кислота может применяться при этом разбавленной с помощью подходящего растворителя, как, например, хлорид метилена. Если защитные группы трет-бутил или бензилбоковых цепей пептидов должны оставаться сохраненными, то отщепление пептида, синтезированного на модифицированном смола-носителе, проводится с 1% трифторуксусной кислотой в хлориде метилена так, как, например, описано у R.C. Sheppard I. Chem. Soc. Chem. Comm. 1982, 587. Если должны оставаться сохраненными отдельные защитные группы трет-бутил или бензилбоковых цепей, то применяют подходящую комбинацию методов синтеза и отщепления.

Для синтеза пептидов с оканчивающейся на С карбамоилгруппировкой или W-амино- или W-гуанидиноалкилгруппировкой используют также описанный Шеппардом модифицированный смола-носитель. После синтеза отщепляется от смолы защищенный в боковой цепи пептид и реагирует в классическом растворном синтезе с соответствующим амином или W-аминоалкиламином или W-гуанидиноалкиламином, причем имеющиеся другие функциональные группы при необходимости могут временно известным образом быть защищены.

Пептиды изобретения синтезировались преимущественно при применении твердофазовой техники согласно двум универсальным тактикам-защитных групп. Синтез осуществлялся с помощью автоматической пептидоинтезирующей модели 430 А фирмы Applied Biosystems при использовании Вос- или Fмос-защитных групп для временного блокирования α-аминогруппы. При применении Вос-защитной группы использовались для синтеза запрограммированные прибороизготовителем синтезные циклы.

Синтез пептидов со свободной карбоксильной группой на оканчивающемся на С-конце осуществлялся на функционализированной с помощью соответствующей Вос-аминокислоты 4-(гидроксиметил)фенилацетамидометилполистиролсмолы (R.B. Merrifield, I. Org. Chem. 43, 2845 (1978) фирмы Applied Biosystems. Для получения пептидамидов применялась МВНА-смола той же фирмы.

В качестве реагентов активирования служили N,N'-дициклогексилкарбодиимид или N,N'-диизопропилкарбодиимид. Активирование проходило в виде симметричного ангидрида, HOBt-эфиров или Hoobt-эфиров в CH₂Cl₂ CH₂Cl₂ -DMF-смесях или NMP. Для соединения применялись 2-4 эквивалента активированного производного аминокислоты. В случаях, если взаимодействие протекало неполностью, реакция повторялась.

При применении Fмос-защитной группы для временной защиты α-аминогруппы использовались для синтеза с помощью автоматического пептидного синтезатора модели 430А фирмы Applied Biosystems собственные синтезные программы. Синтез осуществлялся на p-бензилоксибензилспиртовой смоле (S. Wang, I. Am. Chem. Soc. 95, 1328 (1973)) фирмы Bachem, которая была этерифицирована известным способом (E. Atherton и др. I.C.S. Chem. Comm. 1981, 336) с соответствующей аминокислотой. Активирование производного аминокислоты в виде HOBt или HOObt эфиров осуществлялось непосредственно в доставленных прибороизготовителем аминокислых патронах при добавке раствора диизопропидкарбодиимида в DMF к ранее взвешенной смеси из производного аминокислоты и HOBt или HOObt. Также могут применяться в веществе полученные Fмос-аминокислота OObt эфиры. Отщепление Fмос-защитной группы проходило с 20%-ным раствором пиперидина в DMF в реакционном сосуде. Использованный избыток реактивного производного аминокислоты составлял 1,5-2,5 эквивалентов. Если взаимодействие было полным, то оно было повторено так, как при Вос-методе. Соответствующие изобретению пептиды имеют порознь или в комбинации брадикинин-антагонистическое действие, которое может тестироваться в различных моделях (см. Haudbook of Exp. Pharmacol, т. 25, из-во Спрингера, 1970, с. 53-55), например, на изолированной матке крысы, на подвздошной кишке морской свинки или на изолированной легочной артерии морской свинки.

Для тестирования соответствующих изобретению пептидов на изолированной легочной артерии умерщвлялись морские свинки (Dunkin Hartley) массой 400-450 г ударом в затылок. Грудная клетка открывается, а легочная артерия осторожно препарируется. Окружающая ткань тщательно удаляется, а легочная артерия разрезается спирально под углом 45^о.

Полоска сосуда 2,5 см в длину и 3-4 мм в ширину фиксируется во вмещающей 10 мл органической ванне, которая наполнена раствором Рингера.

Состав раствора, ммоль/л: NaCl 154; KCl 5,6; CaCl₂ 1,9; NaHCO₃ 2,4; глюкоза 5,0.

Раствор проскакивает в виде пузырей с 95% О₂ и 5% СО₂ и нагревается до 37^оС. рН составляет 7,4 предварительная нагрузка на полоску сосуда составляет 1,0 г.

Изометрические сокращательные изменения воспринимаются рычажной насадкой и HF-модемом (измерителем пути) Хюго Сакса и регистрируются на компенсаторное устройство (BEC, Goerz Metrawatt SE-460).

Через час эквимолибрирования начинается опыт. После того как полосы сосуда достигли своего максимального возбуждения относительно 2 х 10^-7 моль/л брадикинина, брадикинин приводит к сокращению полосы сосуда, дают воздействовать пептидам в дозах 5 х 10^-8 1 х 10^-5 моль/л соответственно 10 мин и после новой добавки брадикинина сравнивают уменьшение эффекта брадикинина относительно контроля. Для установления парциально-агонистического эффекта применяются пептиды в дозах 1 х 10^-5 1 х 10^-3 моль/л.

IC₅₀-значения соответствующих изобретению пептидов, рассчитанные из кривых влияния дозы, приведены в таблице.

Cоединение IC₅₀ (м) H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Leu-Ser(D)-Tic-Oic-Arg-OH 5,9˙ 10^-9 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH 3,7 ˙ 10^-8 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Tbg-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH 6,0 ˙ 10^-6 D-Arg[Hyp², Thia^5,8, D-Phe⁷]BK (H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Phe-Thia-Arg-OH 6,4 ˙ 10^-6 Терапевтическая польза соответствующих изобретению пептидов охватывает все патологические состояния, которым брадикинин и родственные брадикинину пептиды способствуют, возбуждают их или поддерживают. В них включают, в том числе, травмы, такие как раны, ожоги, сыпи, эритема, отеки, ангину, артрит, астму, аллергии, ринит, шок, воспаления, пониженное кровяное давление, боль, зуд и измененная моторика спермы.

Изобретение касается применения пептидов формулы I в качестве лечебных средств и фармацевтических препаратов, которые содержат эти соединения. Фармацевтические препараты содержат эффективное количество активного вещества формулы I по отдельности или в сочетании вместе с неорганическим или органическим применяемым в фармацевтике веществом носителем. Применение может осуществляться энтерально, парентерально, например подкожно, внутримышечно или внутривенно-, под язык, надкожно, через нос, ректально, внутривлагалищно, через полость рта или ингаляционно. Дозировка активного вещества зависит от вида гомойтермии, массы тела, возраста и от вида аппликации.

Фармацевтические препараты изобретения изготовляются самим по себе известным способом в виде раствора, смеси, гранул или драже.

Для оральной формы применения или для аппликации на слизистую оболочку смешиваются активные соединения с обычными для этого добавочными веществами, такими как вещества-носители, стабилизаторы или инертные разбавители, и с помощью обычных методов приводят в надлежащую форму введения, такую как таблетки, драже, капсулы, водные, спиртовые или масляные суспензии или водные, спиртовые или масляные растворы. В качестве инертных носителей могут применяться, например Gummi arabicum магнезия, карбонат магния, фосфат калия, молочный сахар, глюкоза, стеарилфумарат магния или крахмал, в частности, маисовый крахмал. При этом приготовление может осуществляться в виде сухих или влажных гранул. В качестве масляных веществ-носителей или растворителей рассматриваются, например, растительные или животные масла, такие как подсолнечное масло или рыбий жир. Препарат для местного применения может использоваться в виде водного или масляного раствора, лосьона, эмульсии или желе, мази или жирной мази или, если возможно, то в форме распылителя, причем при необходимости сцепляемость может улучшаться благодаря добавке полимера.

Для формы применения через нос смешиваются соединения с обычными для нее добавочными веществами, такими как стабилизаторы или инертные разбавители, и приводятся обычными методами в пригодную форму введения, такую как водные, спиртовые или масляные суспензии или водные, спиртовые, или масляные растворы. К водным применяющимся через нос лекарственным формам могут добавляться хелатообразователи, этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота, лимонная кислота, винная кислота или их соли. Введение раствора в нос может осуществляться с помощью дозирующего распылителя или в виде носовых капель с повышенной вязкостью, или геля для носа, или крема для носа.

Для ингаляционного применения могут использоваться распылители или упаковки сжатого газа при применении инертных газов-носителей.

Для внутривенной, подкожной, накожной или внутрикожной аппликации приводятся активные соединения или их физиологически переносимые соли, желательно с обычными в фармацевтике добавочными веществами, например, для изотонирования рН-регулировки, а также растворителями-посредниками, эмульгаторами или другими вспомогательными веществами, в форме раствора, суспензии или эмульсии. Из-за короткого периода полураспада некоторых описанных лекарственных веществ в жидкостях организма имеет большое значение применение инъецируемых ингибирующих лекарственных форм. В качестве лекарственных форм могут использоваться, например, масляные кристаллические суспензии, микрокапсулы, палочки или имплантанты, причем последние могут быть синтезированы из совместимых с тканями полимеров, в частности, биодеструктивных полимеров, например, на базе сополимеров полимолочной и полигликолевой кислот или человеческого альбумина.

Надлежащим пределом дозы для местных ингаляционных форм применения являются растворы с 0,01 5 мг/мл, при систематических формах аппликации подходят 0,01 10 мг/кг.

Использованные для аминокислот сокращения соответствуют обычному в пептидной химии трехбуквенному коду, как он описан в Europ. I. Biochem 138,9 (1984). Использованы следующие сокращения: ACм ацетамидометил
ε-Ahx аминогексаноил
Aос цис, эндо-2-изобицикло[3.3.0]октан-3-S-карбонил
Вос трет-бутилоксикарбонил
Вut трет-бутил
Bzl бензил
CDF хлор-(D)-фенилаланин
Cha циклогексилаланин
Chg циклогексилглицил
CL Z-4-хлор-бензилоксикарбонил
DMF диметилформамид
DOMT О-метил-(D)-треонил
Dnp 2,4-динитрофенил
Fмос 9-фторенилметилоксикарбонил
MDY О-метил-(D)-тирозил
Ме метил
4-Mebzl 4-метилбензил
Mtw 4-метокси-2,3,6-триметилфенилсульфонил
Mts мезитилен-2-сульфонил
NaL 2-нафтилаланил
NMP N- метилпирролидин
Npg неопентилглицил
Oic цис-эндо-октагидроиндол-2-карбонил
OpR изоксазолидин-3-илкарбонил
PaL пиридилаланил
Pмс 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил
Tbg трет-бутилглицил
TFA трифторуксусная кислота
Thia 2-тиенилаланил
Tcs 4-метилфенилсульфонил
Tic 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-илкарбонил
TRt тритил
Примеры должны разъяснить предпочтительные методы для твердофазного синтеза соответствующих изобретению пептидов, хотя изобретение на этом не ограничивается.

Использовали следующие производные аминокислоты:
Fmos-Arg(Mtr)-OH, Boc-(D)-Arg-OH, Fmos-Arg(Pmc)-OH,
Fmos-Hyp-OH, Fmos-Pro-OObt, Fmos-Gly-OObt, Fmos-Phe-OObt,
Fmos-Ser(tBu)-OObt, Fmos-(D)-Tic-OH, Fmos-Gln-OH,
Fmos-Aoc-OH, Fmos-Thia-OH, Fmos-Opr-OH, Fmos-(D)-Ash-OH,
Fmos- β -Ala-OH, Fmos-Oic-OH.

П р и м е р 1. H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Leu-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH.

Ступенчато синтезируют с помощью пептидного синтезатора модели 430 А фирмы Applied Biosystems при использовании Fмщс-метода на этерифицированной с Fмос-Arg(MtR)-OH, p-бензилоксибензил-спиртовой смоле фирмы Novabiochem (наполнение приблизительно 0,5 ммоль/г смолы). Используют 1 г смолы, синтез про- водят с помощью модифицированной для Fмос-метода синтезпрограммы. В патроны синтезатора взвешивают каждый раз 1 ммоль производных аминокислоты со свободной карбоксильной группой вместе с 0,95 ммоль HOObt. Предварительное активирование проводят прямо в патронах при растворении в 4 мл DMF и добавке 2 мл 0,55 моль/л раствора диизопропилкарбодиимида в DMF. HOObt эфиры других аминокислот растворяют в 6 мл NMP, затем также как предварительно активированные in situ аминокислоты сочетают с разблокированной ранее 20% пиперидином в DMF смолой. После законченного синтеза пептид отщепляют от смолы при одновременном удалении защитных групп боковой цепи с помощью трифторуксусной кислоты при использовании тиоанизола и этандитиола в качестве ловушек катионов. Полученный после удаления трифторуксусной кислоты осадок дигерируют несколько раз с эфиром уксусной кислоты и центрифугируют. Оставшийся осадок хроматографируют на Se phadex c 10%-ной уксусной кислотой. Содержащие чистый пептид фракции очищают и сушат вымораживанием. Получают целевой продукт с 43% выходом.

Последующие примеры проводят аналогично примеру 1.

П р и м е р 2. H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH. Выход продукта 38%
П р и м е р 3. H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-OH-Arg-OH. Выход продукта 35%
Физико-химические данные для получения пептидов, а так же соответствующие HPLC-условия.

HPLC-условия: Столб нуклеозил 300-5 С 18, 5 μm, 250 х 4 мм Нога 1 мл/мин, 30^оС, определение при 215 nm Растворитель А: 0,1%-ная водная трифторуксусная кислота Растворитель B: ацетонитил вода 4 1, 0,1%-ная трифторуксусная кислота. Градиент: время, мин В 0 10 2 10 22 90 Время задержки: пример 1: 12,51 мин; пример 2: 13,58 мин; пример 3: 12,35 мин.

Формула изобретения

1. Производные пептидов общей формулы I
A-B-C-E-F-K-(D)Tic-G-M-Fʹ-Y
где А - Н(Д) Agr;
В = Agr;
C = Pro-Hyp-Gy;
E = Leu, Tbg или Cha;
F - Ser;
К,М - простая связь;
G - Oic;
F¹ - Arg;
Y - OH,
или их физиологически приемлемые соли.

2. Производные пептидов общей формулы I по п.1, проявляющие лечебные свойства при воздействии на патологические состояния, вызываемые брадикинином, родственным брадикинину пептидом.