Пептид и способ его получения

 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской химии, и касается создания новых биологических активных средств, обладающих опиоидной активностью. Цель изобретения - создание нового синтетического аналога природных пептидов, для чего проводят синтез в растворе последовательным наращиванием цепи с С-конца молекулы, с помощью метода смешанных ангидридов исходя из бензилового эфира, глицина и используя тритбутилогликарбонил аминокислоты. 2 с. п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской химии, точнее к способам получения биологически активных веществ, обладающих опиоидной активностью и может быть использовано в практической медицине, а также в научно-исследовательских работах в области нейробиологии.

В настоящее время опиаты, включая корфин и синтетические аналоги, обладающие опиатоподобными свойствами, широко используются в практической медицине в качестве анальгетиков (М. Д. Машковский, Лекарственные препараты. М. Медицина, 1993; Х. Д. Якубке, Х. Ешкейт. Аминокислоты, пептиды, белки. М. Мир, 1985).

В научно-технической и патентной литературе описана возможность получения новых морфиноподобных эндогенных соединений из природных источников (Experientia, 1975, N 31, 285, патент США N 4042682, 1977).

Однако их использование ограничено из-за сложности производства, заключающегося в необходимости многократной хроматографической очистке, а также из-за чрезвычайно низкого выхода полезного вещества.

Последнее обстоятельство явилось стимулом для создания целого арсенала синтетических аналгетиков. Анализ патентной информации показывает, что выраженным анальгедирующим действием, как правило, обладают вещества пептидной природы, имеющие либо от 3 7 аминокислотных (PCT-N 085/02079, 1986, Великобритания, N 1604644, 1981; ЕПВ 0221019, 1988; РСT N 090/06943, 1990 ПВ N 0099173, 1984), либо 11 28 аминокислотных групп (США N 4123523, 1978, РС 91/04041, 1991).

Осуществлен синтез ряда пептидов с опиоидной активностью, подобной активности деморфина (ЕПВ 0147194, 1984, ЕПВ 0096592 США 4684624, 1987).

Полученные к настоящему времени синтетические пептиды не всегда полностью удовлетворяют потребностям медицины, поскольку в большинстве своем не обладают комплексом необходимых свойств, обеспечивающих возможность их эффективного применения: высокой активностью, специфичностью, чистотой, отсутствием побочного действия.

Цель изобретения создание нового синтетического аналога природных опиоидных пептидов с перечисленными выше свойствами и обладающими терапевтическим действием.

Целью изобретения является также создание принципиально нового технологического процесса получения вещества пептидной природы, который позволил бы при минимальном количестве и простоте стадий получать продукт с высоким выходом.

Это достигается проведением химического синтеза в растворе путем наращивания пептидной цепи методом смешанных ангидридов аминокислот, защищенных по альфа-аминогруппе, используя стратегию минимального блокирования функциональных групп.

Получение формулы пептида: 1. Пептид формулы X-Tyr-Y-Phe-Z-A, где X H или Arg, D-Ary, Orn, D-Orn, Lys, D-Lys, -Har, D-Har, Cyt, D-Cyt; Y Ala, D-Val, D-Ltu, D-Ile, D-Phe, D-Asn, D-Trp, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tyr, D-Hyp, D-Cys, D-Cys-Cys, D-Met, D-Lys, D-Ags, D-His, D-Asp, D-Gly, D-Ala, D-Orn; Z оптически активная аминокиcлота: Ala, D-Ala, Val, -Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Phe, D-Phe, Asn, D-Asn, Gin, Trp, D-Trp, Pro, D-Pro, Ser, D-Ser, Thr, D-Thr, Tyr, D-Tyr, Hyp, D-Hyp, Cys, D-Cys, Cys-Cys, Cys-D-Cys, D-Cys-Cys, D-Cys-D-Cys, Met, D-Met, Lys, D-Lys, Arg, D-Arg, His, D-His, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, B-Ala, D-B-Ala, Orn, D-Orn; A OH или замещенный амид (С₁ C₃).

Предлагаемый пептид имеет значение R_f в системе (бутанол уксусная кислота вода 3:1:1) в диапазоне от 0,38 до 0,51.

Способ получения пептида иллюстрируется следующим примером: Пример 1.

H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH Получение BOC-Arg(NO₂)-Tyr(Bzl)-D-Ala-Phe-Gly-oBzl.

1. BOC-Phe-Gly-oBzl.

Смесь 10,7 г (40,0 ммоль) BOC-Phe-OH и 2,4 кл (20,1 ммоль) N-метилиорфолина в 50 мл диметилформамида охлаждают до -15^oС и при перемешивании добавляют 5,6 г (40,0 ммоль) изобутилхлорформиата. Через 2 мин к охлажденному раствору добавляют охлажденный раствор 13,1 г (40,0 ммоль) тозилата бензилового эфира глицина в 5 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают при -15^oС 30 мин и 2 ч при комнатной температуре. Диметилформамид отгоняют в вакууме, остаток заливают 100 мл, этилацетата и промывают 2-ным раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывают водой до нейтральной среды, высушивают над безводным сульфатом натрия. Этилцетатный слой упаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из этилацетата с добавлением эфира и гексана. Выход: 16,4 г (98,2). Т. пл. 135,2^oС, R_f 0,71 (система: хлороформ этилацетат метанол 3:6:1), R_f 0,62 (система: этилацетат гексан 1:1).

2. BOC-D-Ala-Phe-Gly-oBzl.

16,4 г (39,8 ммоль) BCO-Phe-Gly-oBzl растворяют в 80 мл 50-ной трифторуксусной кислоты в хлороформе. Через 1 ч растворители упаривают в вакууме до густого масла. Остаток заливают 150 мл диэтилового эфира и кристаллизуют. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и высушивают на воздухе. Выход: 16,2 г (99,8%). Т. пл. TFA H-Phe-Gly-oBzl 135^oС, R_f 0,34 (система: хлороформ: метанол 9:1).

Смесь 7,5 г (39,7 ммоль) BOC-D-Ala-OН и 2,3 мл (20,0 ммоль) N-метилиорфолина в 50 мл диметилформамида охлаждают до -15^oС и при перемешивании добавляют 5,6 г (40,3 ммоль) изобутилхлорформиата. Через 2 мин вносят охлажденный раствор 16,2 г (40,0 ммоль) трифторацетата H-Phe-Gly-oBzl и 2,3 мл (20,0 ммоль) N-метилиорфолина в 50 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают при -15^oС 30 мин и 2 ч при комнатной температуре. Диметилформамид отгоняют в вакууме, остаток заливают 100 мл этилацетата и промывают 2 -ным раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывают водой до нейтральной среды, высушивают над безводным сульфатом натрия. Этилацетатный слой упаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из эфира. Выход: 14,5 г (75,9). Т. пл. 140^oС, R_f 0,79 (система: хлороформ: этилацетат: метанол 6:3:1), R_f 0,55 (система: хлороформ: метанол 9:1).

3. BOC-Tyr(BOC)-D-Ala-Phe-Gly-oBzl.

14,4 г (29,8 ммоль) BOC-D-Ala-Phe-oBzl растворяют в 80 мл 50-ным трифторуксусной кислоты в хлороформе. Через 1 ч растворители упаривают в вакууме до густого масла. Остаток растворяют в 50 мл диметилформамида и добавляли 3,4 мл (29,8 ммоль) N-метилморфолина. Смесь 11,4 г (30,0 ммоль) BOC-Tyr(BOC)-OH и 3,45 мл (30,0 ммоль) N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида охлаждали до -15^oС и при перемешивании добавляют 4,27 г (30,0 ммоль) изобутилхлорформиата. Через 2 мин вносят охлажденный раствор 14,3 г (29,8 ммоль) бензилового эфира трипептида: H-D-Ala-Phe-Gly-pBzl. Реакционную смесь перемешивают при -15^oС 30 мин и 2 ч при комнатной температуре. Диметилформамид отгоняют в вакууме, остаток заливают 100 мл этилацетата и промывают 2 -ным раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывают водой до нейтральной среды, высушивают над безводным сульфатом натрия. Этилацетатный слой упаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из этилацетата. Выход: 18,5 г (83,4 ). Т. пл. 133,5^oС, R_f 0,62 (система: хлороформ: этилацетат: метанол 6:3:1), R_f 0,57 (система: хлороформ: метанол 9:1).

4. BOC-Arg(NO₂)-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-oBzl.

9,8 г (13,1 ммоль) BOC-Tyr(BOC)-D-Ala-Phe-Gly-oBzl растворяют в 80 мл 50 -ной трифторуксусной кислоты в хлорофоpме. Через 1 ч растворители упаривают в вакууме до густого масла. Остаток кристаллизуют из эфира. Выход: 9,68 г (100).

9,6 г (13,0 ммоль) 2TFA Tyr-D-Ala-Phe-Gly-oBzl растворяют в 150 мл диметилформамида и добавляют 1,5 мл (13,0 ммоль) N-метилморфолина. 5,2 г (14,6 ммоль) BOC-Arg(NO₂)-OH 1/2 THF, 1,97 г оксибензотриазола. Реакционную смесь охлаждают при перемешивании до -10^oС и вносят 3,0 дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают 3 сут при комнатной температуре. Дициклогексилмочевину отфильтровывают, растворитель отгоняют в вакууме, остаток заливают 100 мл этилацетата и экстрагируют 2 раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывают водой до нейтральной среды, высушивают над безводным сульфатом натрия. Этилацетатный слой упаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из этилацетата. Выход: 9,6 г (87,2). Т. пл. 176,7 ^oС, R_f 0,70 (система: хлороформ: этилацетат: метанол уксусная кислота 6:3:1:0,5), R_f 0,23 (система: хлороформ: метанол 9:1).

5. Получение H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH 9,6 г BOC-Arg-(NO₂)-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-oBzl растворяют в 60 мл муравьиной кислоты, добавляют 1,0 палладиевого катализатора и пропускают ток водорода в течение 6 ч. Катализатор отфильтровывают, муравьиную кислоту упаривают в вакууме, добавляют 100 мл воды и упаривают повторно. Остаток заливали диэтиловым эфиром. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром, высушивают на воздухе. Выход: 6,9 г (100), R_f 0,44 (система: бутанол: уксусная кислота: вода 3: 1:1).

Очистку пептида проводят с помощью ионнообменной хроматографии на колонке с Сефадексом в градиенте 0,1 М 1,0 М пиридинацетатного буфера.

Согласно результатам физико-химического исследования пептид H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH имеет молекулярный вес 612,6, линейную бриатуру и представляет собой белый с желтоватым оттенком порошок который растворим в воде, мало растворим в спирте и практически нерастворим в хлороформе.

У. ф.-спектр в области 250 300 мл имеет максимум 275 ± 2 мм, плечо 282 ± 1 мм, 0,1-ный водный раствор имеет рН 5,0 7,0.

Биологическая активность препарата изучалась на крысах и мышах с помощью общепринятых тестов (GPI; MVD; "Hot plate" "tail flick").

Минимальная доза пептида, вызывающая биологически эффект составляет 1 - 10 мкг/кг.

С целью изучения безопасности пептида проводят изучение его острой токсичности.

Задачей исследования являлось выявление общетоксического действия по основному параметру острой токсичности Лд-50.

Изучение острой токсичности проводят в соответствии с Методическими рекомендациями фармакологического комитета РФ "Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ", М. 1985.

Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении доз 800 мг/кг, 1100 мг/кг и 1400 мг/кг пептид не оказывают острого токсичного действия и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть их Лд-50.

Формула изобретения

1. Пептид формулы
X-Tyr-Y-Phe-Z-A,
где X H или Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys, D-Lys, -Har, D-Har, Cyt, D-Cyt;
Y D-Ala, D-Val, D-Ltu, D-Ile, D-Phe, D-Ash, D-Trp, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tyr, D-Hyp, D-Cys, D-Cys-Cys, D-Met, D-Lys, D-Ags, D-His, D-Asp, D-Glu, D-Ala, D-Orn;
Z оптически активная аминокислота: Ala, D-Ala, Val, Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Phe, D-Phe, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Trp, D-Trp, Pro, D-Pro, Ser, D-Ser, Thr, D-Thr, Tyr, D-Tyr, Hyp, D-Hyp, Cys, D-Cys, Cys-Cys, Cys-D-Cys, D-Cys-Cys, D-Cys-D-Cys, Met, Lys, D-Lys, Arg, D-Arg, His, D-His, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, D-Met, B-Ala, D-B-Ala, Orn, D-Orn, Gly;
A OH или замещенный C₁ C₃-амид.

2. Способ получения пептида формулы
X Tyr-Y-Phe-Z-A,
где X H или Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys, D-Lys, Har, D-Har, Cyt, D-Cyt;
Y D-Ala, D-Val, D-Ltu, D-Ile, D-Phe, D-Asn, D-Trp, D-Pro, D-Ser, D-Tyr, D-Hyp, D-Cys, D-Cys-Cys, D-Met, D-Lys, D-Ags, D-His, D-Asp, D-Glu, D-Ala, D-Orn, D-Thr;
Z оптически активная аминокислота: Ala, D-Ala, Val, -Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Phe, D-Phe, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Trp, D-Trp, Pro, D-Pro, Ser, D-Ser, Thr, D-Thr, Tyr, D-Tyr, Hyp, D-Hyp, Cys, D-Cys, Cys-Cys, Cys-D-Cys, D-Cys-Cys, D-Cys-D-Cys, Met, D-Met, Lys, D-Lys, Arg, D-Arg, His, D-His, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, B-Ala, D-B-Ala, Orn, D-Orn, Gly;
A OH или замещенный C₁ C₃-амид,
заключающийся в том, что процесс ведут в растворе, используя метод смешанных ангидридов, где в качестве исходного используют бензиловый эфир аминокислоты и третбутилоксикарбонилфенилаланин, к полученному соединению последовательно присоединяют третбутилоксикарбониламинокислоты с предварительным отщеплением на каждой стадии третбутилоксикарбонильной группы в кислой среде, затем пропускают ток водорода в присутствии палладиевого катализатора и целевой продукт очищают ионообменной хроматографией.