Способ получения биологически активного пептидного препарата, обладающего адаптогенными свойствами

 

Изобретение относится к биологии, в частности, к способам получения биологически активных веществ, воздействующих на ряд физиологических функций организма животных и человека, и может быть использовано в фармацевтии, сельском хозяйстве, ветеринарии и медицине. Способ получения биологически активного препарата, содержащего пептиды из ткани мозга, включает гомогенизацию ткани, кислотную экстракцию, отделение осадка и выделение лиофилизированного препарата. Новым в способе является то, что в качестве ткани мозга используют ткань пинеальной железы, экстракцию проводят двукратно 0.1-1.0 н. водным раствором перхлорной кислоты при 2-6^oC в течение 12-48 ч, экстракт нейтрализуют водным раствором гидроокиси калия с последующим отделением перхлората калия, очистку и выделение препарата осуществляют прогреванием и двойной лиофилизацией нейтрализованного экстракта. 3 ил., 1 табл.

Изобретение относится к биологии, в частности к способам получения биологически активных веществ, воздействующих на ряд физиологических функций организма животных и человека, и может быть использовано в фармацевтии, сельском хозяйстве, ветеринарии и медицине.

Известен способ получения антигонадотропных веществ из эпифиза животных, заключающийся в том, что проводят экстракцию пептидов водным раствором перхлорной кислоты, осуществляют их очистку на сефадексе и биогеле [1] Недостатком данного способа является использование таких сложных технологических приемов, как очистка пептидного комплекса на сефадексе и биогеле, которые значительно усложняют применение этого способа в производственных условиях и приводят к большим потерям биологически активных пептидов. Получаемые с помощью такого способа пептиды имеют молекулярную массу 1000 2500 Да и обладают узким фармакологическим эффектом, а именно антигонадотропным действием.

Известен способ получения водорастворимых пептидов из эпиталамо-эпифизарной области мозга животных, предназначенных для физиологического регулирования нейроэндокринной системы, стимулирования иммунитета, ингибирования роста гормональнозависимых опухолей, выбранный авторами за прототип [2] Этот способ заключается в том, что обрабатывают ткань органическим растворителем, после измельчения ткани пептидный комплекс экстрагируют водным раствором уксусной кислоты в присутствии хлористого цинка, после отделения осадка пептиды осаждают и промывают органическим растворителем, из высушенного органическим растворителем осадка пептиды извлекают водой и лиофилизируют.

Недостатком известного способа является использование органического растворителя при обезвоживании и обезжиривании ткани, а также для извлечения пептидного комплекса, так как концентрирование физиологически активных пептидов органическим растворителем неизбежно приводит к большим потерям продукта и делает технологию экологически вредной. Кроме того, недостатком известного способа является использование для экстракции пептидного комплекса уксусной кислоты, извлекающей из гомогенизированной ткани не только пептиды, но и белки, благодаря чему получаемый с помощью этого способа препарат содержит довольно большие по молекулярной массе компоненты (до 11000 Да), несмотря на применение в качестве осадителя белков хлористого цинка.

Предлагаемый способ решает задачу повышения выхода продукта и снижения экологической вредности технологии за счет использования нелетучих и нетоксичных экстрагента и реагентов. Это достигается тем, что в предлагаемом способе осуществляют гомогенизацию ткани пинеальной железы, кислотную экстракцию, отделение осадка, выделение лиофилизированного комплекса пептидов; экстракцию проводят двукратно 0,1-1,0 н водным раствором перхлорной кислоты при 2-6^oC в течение 12-48 ч, экстракт нейтрализуют водным раствором гидроокиси калия с последующим отделением перхлората калия, прогреванием раствора и двойной лиофилизацией.

Новым в способе является то, что в качестве ткани мозга используют ткань пинеальной железы, экстракцию проводят двукратно 0,1-1,0 н водным раствором перхлорной кислоты при 2-6^oC в течение 12-48 ч, экстракт нейтрализуют водным раствором гидроокиси калия, очистку пептидного комплекса осуществляют прогреванием раствора и двойной лиофилизацией. Проведение экстракции гомогенизированной ткани 0,1-1,0 н водным раствором перхлорной кислоты позволяет получить комплекс пептидов, содержащий фракции с молекулярной массой до 4500 Да. Экстракция при пониженной температуре 2-6^oC в течение 12-48 ч позволяет избавиться от белков и нуклеиновых кислот. Двукратная экстракция перхлорной кислотой приводит к увеличению выхода получаемого продукта. Нейтрализация экстракта водным раствором гидроокиси калия на холоду позволяет избавиться от перхлорной кислоты (присутствие которой сделало бы невозможной последующую лиофилизацию пептидов) за счет превращения ее в отделяемый перхлорат калия. Прогревание раствора и его двойная лиофилизация обеспечивают дополнительную очистку получаемого комплекса пептидов от веществ с молекулярной массой выше 4500 Да и части низкомолекулярных примесей.

В результате предлагаемый способ позволяет получить пептидный комплекс с широким спектром фармакологических эффектов, в частности обладающий адаптогенным, антигонадотропным, рост- и иммуностимулирующим свойствами, лишенный видовой специфичности и антигенной активности. При этом способ является экологически безвредным, так как в процессе получения продукта не используется обработка органическими растворителями и не образуется ядовитых отходов. Кроме того, способ обеспечивает увеличение выхода целевого продукта.

На фиг. 1 представлена хроматограмма полученного по заявляемому способу препарата на колонке TSK 2000SW; на фиг. 2 хроматограмма полученного по заявляемому способу препарата на колонке Ultrasphtrae ODS C-18; на фиг.3 - хроматограмма полученного по способу-прототипу препарата на колонке TSK 2000SW.

Пример 1. Пинеальные железы крупного рогатого скота брали непосредственно после забоя животных, отмывали от крови в холодной воде или в физиологическом растворе и в замороженном виде сохраняли до использования. Размороженную ткань гомогенизировали в микроизмельчителе в течение 4 мин в 0,1 н. водном растворе перхлорной кислоты (при соотношении веса ткани к объему раствора кислоты равном 1: 2). Экстракцию проводили при 6^oC в течение 24 ч при постоянном перемешивании. Гомогенат центрифугировали при 4000g в течение 20 мин при 0-4^oC. Осадок повторно гомогенизировали в микроизмельчителе в течение 4 мин в 0,1 н водном растворе перхлорной кислоты (при соотношении вес/объем 1:1). Экстракцию проводили при 6^oС в течение 24 ч при постоянном перемешивании. Гомогенат центрифугировали при 4000g в течение 20 мин при 0-4^oC. Супернатанты объединяли и путем дробного прибавления 10 н. водного раствора гидроокиси калия доводили до нейтрального pH. Выпадающий осадок перхлората калия отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 4000g при 0-4^oС. Экстракт прогревали, повторно центрифугировали и дважды лиофилизировали.

Конечный продукт, выход которого составил 3,7% от массы исходной ткани, представлял собой белое или желтоватое аморфное вещество, хорошо растворимое в воде, слабой щелочи и солевых растворах.

Проводили исследование состава полученного препарата. Установлено, что основную массу (70-80%) органических веществ в препарате составил комплекс пептидов (определяемых спектрофотомерическими и химическими методами) с молекулярной массой 1000-4500 Да. В числе органических примесей были выявлены аминокислоты, ди-пентопептиды, нуклеотиды, нуклеозиды, сахара. Неорганические (зольные) компоненты не превышали 15% от сухого веса препарата. В их числе: K 10,35% Na 2,96% Ca 0,132% Mg 0,123% Fe 0,002% Zn 0,002% Cu 0,003% При фракционировании пептидного комплекса в зависимости от применяемого метода фракционирования выявлено от 5 до 22 фракций. Например, методом гельфильтрации на колонке TSK 2000SW (прибор HPLC, модель 346, фирма Бэкман, США) полученный пептидный комплекс делился на 5-6 фракций в стандартных условиях (0,1М натрий-фосфатный буфер с 0,1М хлористым натрием, pH 6,5, объем вымывающего буфера 15 мл при скорости протока 1 мл/мин). На фиг. 1 приведена хроматограмма препарата, где по горизонтальной оси представлено время выхода фракций в мин, а по вертикальной оси экстинкции при детектируемых длинах волн 260 нм (А) и 215 нм (В) в условных единицах.

Методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке Ultraspherae ODS C-18 (прибор HPLC, модель 346, фирма Бэкман, США) пептидный комплекс делился на 18-22 фракции в стандартных условиях (система буферных растворов: А 0,1% трифторуксусная кислота в воде, В 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле. Смешиванием растворов A и B создавался линейный градиент раствора B в растворе A от 5 до 50% за 30 мин, объем вымывающей буферной смеси был 15 мл при скорости протока 0,5 мл/мин). На фиг. 2 приведена хроматограмма препарата на колонке Ultraspherae ODS C-18, где по горизонтальной оси представлено время выхода фракций в мин, а по вертикальной оси экстинкция при детектируемой длине волны 215 нм в условных единицах.

Для сравнения проводили фракционирование препарата, полученного по способу-прототипу, методом гельфильтрации на колонке TSK-2000SW в условиях, идентичных условиям фракционирования препарата по заявляемому способу на этой же колонке. На фиг. 3 приведена хроматограмма препарата, полученного по способу-прототипу, на колонке TSK-2000SW. Сравнительный хроматографический анализ показал, что основной диапазон пептидных фракций препарата, полученного заявленным способом, совпадает с препаратом, полученным по способу-прототипу, однако последний содержит больше высокомолекулярных пептидных фракций.

Полученный с помощью предлагаемого способа препарат проверен на биологическую активность.

Установлено, что препарат обладал адаптогенными свойствами. Инъецировали полученный препарат однократно внутрибрюшинно белым беспородным самцам крыс в дозах 0,5 и 5,0 мг/100 г массы тела. Через 1 ч после инъекции наблюдалось достоверное увеличение содержания в плазме крови II-оксикортикостероидов на 14 и 30% соответственно. Подвергали животных стрессу (30-минутное плавание в воде), при этом содержание кортикостероидов возрастало на 57 и 13% соответственно дозам вводимого препарата. У контрольных животных, которым вместо препарата вводили растворитель (физиологический раствор), этот показатель увеличивался на 105% Следовательно, препарат из пинеальной железы оптимизировал деятельность гипофиз-адреналовой системы, перестраивая режим работы на более экономичный в неблагоприятных для организма условиях. Через 40 мин после прекращения стрессового воздействия у контрольных крыс измеряли уровень содержания 11-оксикортикостероидов в плазме крови, который оставался повышенным на 51% по сравнению с базальным уровнем. У крыс, которым за 1 час до стрессорного воздействия вводили препарат в дозах 0,5 и 5,0 мг/100 г массы тела, данный показатель в зависимости от дозы оставался выше всего лишь на 26% или не отличался от нормального уровня, зарегистрированного у не подвергавшихся стрессу животных. Таким образом, инъекции препарата способствовали более быстрой нормализации деятельности гипофиз-адреналовой системы после прекращения стрессорного воздействия.

Адаптогенные свойства полученного препарата были подтверждены в экспериментах на личинках стерляди, которых подвергали многократному стрессорному воздействию (пересадка капроновым сачком из одного аквариума в другой). Проводили обработку личинок препаратом в концентрациях 10, 50 и 100 мг/л; время экспозиции составляло 1 ч. Выживаемость 8-, 12- и 20-суточных личинок стерляди, подвергавшихся стрессу, была наибольшей при использовании препарата в концентрации 10 мг/л и превышала выживаемость аналогичных личинок, не обрабатывавшихся препаратом, на 18, 12 и 18% соответственно.

Установлено, что препарат, содержащий пептиды из пинеальной железы, обладал антигонадотропными свойствами. Инъецировали препарат однократно внутрибрюшинно половозрелым самкам крыс в дозах 0,05; 1,0; 5,0 и 10,0 мг/100 г массы тела; измеряли содержание гонадотропинов в гипофизе и плазме крови биологическими и радиоиммунологическими методами. Препарат проявлял антигонадотропное действие во всех исследованных дозах, за исключением дозы 0,05 мг/100 г массы тела. Через 1 ч после инъекции препарата в дозе 1,0 мг/100 г массы тела наблюдалось снижение активности лютропина на 23% и фоллитропина на 20% в гипофизе при одновременном уменьшении содержания обоих гонадотропинов в плазме крови. Производили также подкожные инъекции препарата в той же самой дозе в течение 8 дн односторонне овариэктомированным мышам. Инъекции препарата приводили к достоверному угнетению компенсаторной гипертрофии яичника, составившей 21% тогда как у контрольных животных величина этого показателя была равна 60% Поскольку развитие компенсаторной гипертрофии яичника у односторонне овариэктомированных мышей обусловлено усилением секреции гипофизарных гонадотропинов, то выявленное угнетение гипертрофии яичника после инъекции препарата, содержащего пептиды пинеальной железы, свидетельствовало о присущей ему антигонадотропной активности.

Полученный с помощью заявляемого способа пептидный комплекс проверен на ростстимулирующую активность. В экспериментах на инфантильных самцах крыс линии Вистар изучено влияние внутрибрюшинных инъекций препарата в дозах 0,05, 0,5 и 5,0 мг/100 г массы тела в день в течение 5 дн на увеличение массы тела (взвешивание животных производили ежедневно в течение 20 дн). Обнаружено, что инъекции препарата в дозах 0,5 и 5,0 мг/100 г в день в течение указанного периода приводили к достоверному увеличению массы тела крыс. У контрольных крыс, которым вводили физиологический раствор, увеличение массы тела составило 0,25±0,05 г/день, а у животных, которым инъецировали препарат в указанных дозах, увеличение массы тела составило 1,22±0,06 и 1,40±0,08 г/день соответственно. Через 30 мин после однократной внутрибрюшинной инъекции препарата в дозах 0,05; 0,5 и 5,0 мг/100 г массы тела определяли содержание и интенсивность биосинтеза соматотропина в гипофизе. Было обнаружено, что содержание соматотропина в гипофизе снижалось на 7, 16 и 29% соответственно вводимым дозам. При этом интенсивность биосинтеза соматотропина в гипофизе не изменялась. Следовательно, инъекции препарата, содержащего пептиды пинеальной железы, усиливали выделение соматотропина из гипофиза неполовозрелых крыс и вызывали усиление роста животных.

Проверка ростстимулирующей активности полученного с помощью заявляемого способа препарата, содержащего пептиды, была проведена также на цыплятах кросса "Бройлер-6". Препарат испытывали аэрозольно, двукратно с интервалом в 6 ч. Экспозицию цыплят суточного возраста в аэрозоле препарата проводили в течение 30 мин. Контрольной группе цыплят ингалировали физиологический раствор. Обнаружили, что через 30 дн масса тела цыплят, которых обрабатывали в суточном возрасте препаратом в дозах 25, 50 и 100 мг/м³, была выше по сравнению с контрольной группой цыплят на 10,2, 10,6 и 12,8% соответственно.

Полученный по заявляемому способу препарат проверяли на иммуностимулирующую активность. Эксперименты проводили на цыплятах кросса "Бройлер-6" по изложенной выше схеме. Цыплят суточного возраста обрабатывали препаратом в дозах 25, 50 и 100 мг/м³. Определяли активность лизоцима в сыворотке крови, которая оказалась выше по сравнению с контрольной группой на 10,3, 12,2 и 11,6% соответственно. Измеряли бактерицидную активность сыворотки крови, она была выше по сравнению с контрольной группой на 18,8, 18,6 и 20,2% Оценивали активность β -лизинов в сыворотке крови, она оказалась выше по сравнению с цыплятами контрольной группы на 10,6, 13,2 и 15,5% соответственно. Проведенные эксперименты показали, что препарат повышал защитные свойства организма цыплят.

Полученный с помощью заявляемого способа препарат, содержащий пептиды пинеальной железы, не обладал видовой специфичностью, о чем свидетельствовала эффективность его применения на разных представителях позвоночных животных (грызуны, птицы, рыбы).

Препарат проверяли на антигенную активность. С этой целью осуществляли его инъекции без адъюванта кроликам по наиболее чувствительной схеме иммунизации, по которой проводили первое введение в селезенку, два последующих в лимфатические узлы, затем пять внутривенно и внутримышечно в течение 7 нед в разовой дозе 30 мг/кг массы тела. Инъекции не приводили к образованию антител, определявшихся методом кольцепреципитации, т.е. препарат не обладал антигенной активностью.

Осуществляли длительные инъекции препарата ежедневно в дозе 20 мг/кг массы тела в течение 60 дн подопытным крысам и мышам. При этом не выявляли токсических эффектов. Следовательно, полученный по заявляемому способу препарат нетоксичен.

Пример 2. Пинеальные железы крупного рогатого скота, взятые непосредственно после убоя животных, отмывали от крови в холодной воде или в физиологическом растворе и в замороженном виде сохраняли до использования. Размороженную ткань гомогенизировали в микроизмельчителе в течение 4 мин в 1,0 н водном растворе перхлорной кислоты в соотношении вес/объем 1:2. Экстракцию проводили при 2^oC в течение 12 ч при постоянном перемешивании. Гомогенат центрифугировали при 4000g в течение 20 мин при 0-4^oC. Осадок гомогенизировали в 1,0 н водном растворе перхлорной кислоты в соотношении вес/объем 1:1. Экстракцию проводили при 2^oC в течение 12 ч при постоянном перемешивании. Этот гомогенат центрифугировали при 4000g в течение 20 мин при 0-4^oC. Супернатанты объединяли, путем дробного прибавления 10 н водного раствора гидроокиси калия доводили до нейтрального pH. Выпадающий в осадок перхлорат калия отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 4000g при 0-4^oC. Экстракт прогревали, повторно центрифугировали и дважды лиофилизировали.

Конечный продукт, выход которого составил около 3,0% от массы исходной ткани, представлял собой белое или слегка желтоватое аморфное вещество, растворимость которого в воде, слабой щелочи и солевых растворах была такой же, как у препарата в примере 1.

С помощью спектрофотометрических и химических методов установлено, что основную массу (около 79%) органических веществ в продукте составил комплекс пептидов с молекулярной массой 1000-4500 Да. Хроматограмма препарата соответствовала хроматограммам, представленным на фиг. 1 и фиг. 2. Неорганические (зольные) компоненты в продукте составили 18% от сухого веса.

Производили анализ биологических свойств полученного препарата по методикам, указанным в примере 1. Биологические свойства препарата были идентичны тем, которыми обладал препарат в примере 1.

Пример 3. Пинеальные железы крупного рогатого скота, взятые непосредственно после убоя животных, отмывали от крови в холодной воде или в физиологическом растворе и в замороженном виде сохраняли до использования. Размороженную ткань гомогенизировали в микроизмельчителе в течение 4 мин в 0,1 н водном растворе перхлорной кислоты в соотношении вес/объем 1:2. Экстракцию проводили при 6^oC в течение 48 ч при постоянном перемешивании электромешалкой. Гомогенат центрифугировали при 4000g в течение 20 мин при 0-4^oC. Полученный осадок гомогенизировали в 0,1 н водном растворе перхлорной кислоты в соотношении вес/объем 1:1. Экстракцию проводили при 6^oC в течение 48 ч. Гомогенат центрифугировали при 4000g в течение 20 мин при 0-4^oC. Супернатанты объединяли и путем дробного прибавления 10 н водного раствора годроокиси калия доводили до нейтрального pH. Выпадающий осадок перхлората калия отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 4000g при 0-4^oC. Экстракт прогревали, повторно центрифугировали и дважды лиофилизировали.

Выход конечного продукта составил около 3,9% от массы исходной ткани. Установлено, что основную массу (около 72%) органических веществ препарата составил пептидный комплекс с молекулярной массой 1000 4500 Да. При фракционировании пептидного комплекса в зависимости от применяемого метода фракционирования выявлено 5-22 фракций. Хроматограммы препарата соответствовали хроматограммам, представленным на фиг. 1 и 2. Проведен анализ биологических свойств препарата с использованием методик, указанных в примере 1. Результаты испытаний идентичны примеру 1.

В таблице представлены сравнительные характеристики препаратов, содержащих пептиды пинеальной железы, полученные с помощью заявляемого и известного способов.

По данным таблицы видно, что заявляемый способ повышает выход целевого продукта и обеспечивает извлечение пептидов, молекулярная масса которых не превышает 4500 Да.

Источники информации 1. Авт. св. СССР N 773992, кл. A 61 K 37/02, 35/39.

2. Патент ФРГ N 3742139, кл. A 61 K 37/02, C 07 K 15/06.

Формула изобретения

Способ получения биологически активного пептидного препарата, обладающего адаптогенными свойствами, включающий гомогенизацию ткани, кислотную экстракцию, отделение осадка, выделение лиофилизированного препарата, отличающийся тем, что используют ткань пениальной железы, экстракцию проводят двухкратно 0,1 1,0 н водным раствором перхлорной кислоты при температуре 2 - 6^oС в течение 12 48 ч, экстракт нейтрализуют водным раствором гидроокиси калия с последующим отделением перхлората калия, очистку и выделение препарата осуществляют прогреванием и двойной лиофилизацией нейтрализованного экстракта.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4