Способ получения и-рнк для специфической иммунотерапии и профилактики
СВОЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИX
РЕСПУБЛИК
l3!
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3426251/28-14 (22) 15 04,82 (31) Р 3115559.6 (32) 16. 04. 81 (33) ПЕ (46) 23.07.86. Цюл. у 27 (71) Коммандитгезельшафт Шварцхаупт (ВЕ) (72) Вальтер Лампрехт (ПЕ) (53) 575(088.8) (56) Jachertz.", 7eitschrift тцт шеdizinische. — l1ikrobio1ogy und
Immunology.. 154(1968), s. 245. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ и-FHK ЛЛЯ
СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОТЕРАПИИ И ПРОФИ(5и 4 A 61 K 45/05, 37/10
ЧЛКТИКИ, включающий приготовление смеси и- lHK, нуклеотидов и нуклеазной ферментной системы из клеток ретикциоэндотелиальной ткани, обработку ука занной смеси вирусным, бактериальным или опухолевым антигенами, инкубацию, экстракцию и-PHK раствором фенола и додецелсульфата натрия с последующей очисткой целевого продукта, о т л ич а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения выхода продукта, очистку проводят центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия/сахароза при 130 000 g, а в качестве нуклеазной ферментной системы используют гомогенат ткани селезенки.
Изобрете!(Hp относится к (гг(уl терапии, а также активной !»Iiavjt)(3;1j11{H и получению антис(,IE)op«7òо к в (!. —. . аниэме челоьека и NHBo",н(гх.
Це{1ь и -) on pe I Р ниЯ вЂ” пол у le;!»C . ? — 1 Ill; пецифиче(Icol о действия против «;<т!<в .-ЕНОВ, EIPPP I(OCÈÌO(1 ЧЕЛОНЕКО«М ПР;! применг tHH, t> част {oc ) fi при ".:.-.-.е" г! <
01 (neon О(уl !pcò!{Ля ". T c!{ cj!e?(у}<7 I I -) гомоl т E<;1 . а . Ic j}IH . P.jte 3 Р }(КИ приготавлпва(от сме(1-.;i-, (!, I(f(ó)(J)< О гт?— дон и иyKJ(e33}(}te ферме;(I? I ц.-(я ст)!.Iупяции 1(ммунной си()темы, г)брабатнп{ают ЭТУ <Э(СCI, Ej {P CE{),1, баК ГЕРИ;>ЛиEI< i j ОПУХ.). (С ВЫ) I аl{ ТИГР ПЯМИ > Э!{Стг) аГИ;7 Г г! 1 и — 1 HK I Z — ым 3од((ым peer}j..)n<7:.I,f() tjeц<(ЛСуи)><1)ата 1(aтрия H i /-1!н!М p<а(":130! О)< <1)åj{0J Н, с це.п,ю 0.-(истки 1; 1)11К цен !.)7?!фУГИРУ)ОТ 3 . Р;IДИЕ.(TP ."Л Э". т«О С ги Х 1,)— pИда ЦРЗИЯ ««Са 1<{р(!. >Ы:.1 ТООй)(Н(.) О <) ": - 1 НОГО )7аст 307а п17и 13C) 000 Эн tc)нук:{ " 3ö3(e фер!.. н-;ы: р)}у.!" о ИЭ С < 3(C .3 Е)(О -(ПО) О ГОМО ) Р 1(а а) ЦЕ П j) I! фУГИР013аll (Е)(3 ГРа {ИPEI I (. П! ОТИС!".Тт! сахарозы .(ри I 00 000 р . П р и м е i7. А) 11<7т<у-<ение фермe:!"— ной системы., < Для получения соo 7)le г!. тв 7)о(1(е г( фермен гной системы можн() и(ч:О 1. «)! лейкоциты и л -{1((jpоциты. Особо!i;{n си О с 0 б и О. Г,«ч е н ия и. 3 с е .=. л 3 Р и к : .. целе>то 1 2 1 c){e)!(e)- o? IC. Tpo ": at <Î",)<7.:;)- < СЕЛЕЗЕНКИ,На){Р)Г}!ЕР С Р.IP 3 Р II(:i (? т::1 ) ! {еи) размельч а(от г c f Jc(êå )7 порез.:.) к ч с с,«хим льДОм II )кипк)»!ты(а 3 О 1 Ом . (10,)( ())Ок вводят в ., 5 мл трО! :!{т)!Т) басф(:,)— ного раствора А в пробирке для цс" рифуги и замораживают суспенэ((ю пttit -70 С. Этот процесс повторяню окоп(<) 10 раз. После зтого п()дготовленн:tp для обработки клетKH От:(енто)ифу: 1!ру.<1 B течение 30 мин в уль раце..тр(и1)уг= Бекмана в роторе БК 50.I прн 30 После центрифугироьа!{иЯ стбир:от 1 — 1,5 мл красного осветле(!ного на),, СаДКа И ПРИВОДЯТ На т{ЕРИОЛИЧPC.K)II градиент сахарозы. Этот Гра;(иен г ТоНТ из 1 мл 60«o — пой ах Яро -<ы в tpol jном буферном растворе !3, {B!(кот, !)!Г<т находятся 2,75 мл 307.— ного раствор;. сахарозы в тройном бу,!)ер!(О}(рас)-II;.-ре Л. Центрифугирование преволя) в ультрацентрифуге 11ек}(<1}{ а, ра стjj;1 ч(, 50, (, при 100 000 г?, 0 0. Чере -: получают необходимую фр Iê.?1}jj<) H коасноватого осветлен!(; г; .-:I(.ÿ «)f» с«)K
?,3<1 ) )ТР.<1)н Ох (а» .:, .И.(ой 1))l " t=.{KO: ! "" )павляк с Ох:.и::.:;1<-? 1-.!tif! троjiH < ): Ti- )т; -тгж? tt) ; !1 7 )К т и— {. t 3::Е, :, lI(, )<<е3(!K <)111) Ii:о If !KJ <пi" !{ая! », it;7 3 -; — I,It ((!. т! сор!га (и—!! !:! .?::3 () К " :.{j))1(); .i !» 1!)ОГ,:.3F: К т{.. . . . <) ! Г б !т I t . I t ) (t н:. i o 1 I në . c t { c) -{: t.: и Р > e I j т(иC : j«1) а. I!! P! -ГОЙ 3 (nГ! Е. .".C,),ЛЕ !> }10 О Т аи)3 а 3; IГ: т;C 1(! О <Пу(1)ерн(! е ра . 13()I t: t." ., <» Ii1 : "Н !) ". ;t t, ()1)) „.,т, < )т}? = l. < т; i:- j)), t -(/I!<«I..(j! ) .«! - —" : ". <3 <1) ОО<3 а <<О (Е ,!!е Ij,, . (: Х Н т.:- .". Т, (). ;«<, (, тт, ))., : — Е;-;, ..;! . т«т. -.-,;.,О) „...-. !. -- ),,,У ° °,.;;;.-1<ч НИР 1iI)Г! !О : - I 1)1l ; т(! Оа )Де;IЯ (;t<- i!> . < ц!.- ю н ерх {к)ю фа.-т; :=3 !)о т аК:(),,. )К ;; т мгт. - 1, IV и 10 )О I ejjо.<:.а-, г (к (тс . (Н1(выпа— :; а!.;:;к,. 1!< ;111(! рока{<(? f f Ой )
ЦО б т, ; i:ill«) 1 )1 Cj 1<{!?!1 I " )ОТ М: !." I, P«I t, —..О?;; (; < .()3 Та I f»÷ .! )!!j; .!. I I;;.IO j ., I " р!) -;О! («3 1 С! 0::.:< ).".: t « и ..". .)«:)<<< г«p<{L ), ) ! . - !) 1С) !тор)Р lijе <,f!(,,; И! (;1 <.!((t т.-. .)са;<ит ., :;(;.1) << <<) с i .,, Р-... )(< .*, 1 - !" тj-"-))< t« Ojt jK « ) )" (); t -,i>t), : ), i, p i» »« :) . (!.1;(!?!1>" !, " .!i нм . (<: г т ) {. . С I . t"! (); )Iоc .1<)(е11 1((t,() чают KОII), < { p;lliH!;t 1 jJ «<.? 1. ! «:), ",,т! " )); У 1)а jн )" гт))!.. 1i (т (.. 1, С (! <), И.— 1,, Г, (ф; т..:;. "и,. j t-1> т , К)!т
:,:- И.<(".;1„-!("t : " ):! .. и < .;i)PI7— j г Ссс т "«;» Tfт е::(т, 1 1 -)---,---,--,- --. Редактор С, Патруюева Те .р-:! И. Поповитт г Заказ 4027/59 j . ", л —,- ((> 0 т«> )- (> BI!IIIIIIII I осудлрс .. »ннот «ксьг>. Г»! з СССР Tio EI p.:Tлм из(. ",,) с те!) ий )>, . );,. 1» l!т} ! 1303:) > Мт)ск)»Л,. т)т- ;5 > Рау(;скл;:Лб ПрОИЗВОдетВЕННΠ—:.(О:ПП раф)тв}ЕСКОС ПРЕЛ. р: — .,:, Г. (, Ij >: }: j f»«)« Оч}11})1 (if() f ) )1)» Р«)» т: :., .:.) 1 !Iс i - . ) г -т а также смс сь }!óêëåñòè;(св AI :1 > 1 l, ICTfI) }} > j fI).;!ë}> êo}Iòðo.",}i f.Оста}»: }): г) МE6 НE>1(Fy10 СМQ С т> O О!> lliЛК О))т т:.(КСП)П f Е т "— венкым соо T}!0(I!»If;fc и, в к) тoj)vff) ЛЯЮт УС}}) М«1 Рl> ITPO}» «))} ff}>(}1 ТР I)Ò(!e }. клпывают всегда охлажден}(ой пппс .—:;,- *,, Оптимальные концентрации отдельн},(х компонентов определяют посредс.тво« . нескольких опытов: Каждую из проб « инкубируют в водяной ва}и)е при 3! С и уже через 3-6 мин разбагляют зо:.;.:: раствором 17-ного сульфата додец.. -.T и 17 †но фенола водного. Оп« .,.>!f-. ВРЕМЯ HHKVCHPOI»BHHTI тахжЕ ЗЛВИС>Г, От концентраций и cooTB»T»òâóf)ï»To л)-.. ( гена и может быть. ОпределеHo нл ст ".; ванин нескольких Опытов. Ох:)лжл: проводят в ванне со льд})}(, цс .грп,гируют при 2000 г(, Наноса)тс:; с л;,": синтезированную сь}рую и-РПК. Г. ОЧИСтКЛ И вЂ” PIIK. (ЛЗ }(Л;то», ° ГЛ и-РНК изолируют по перио"(H ) ";«.! ã:f-:— диенту хлорид цезия/слхлро }},: л)} этого в центри(1)уж}!О}1 т,) убк» из л--. — 25 тилцеллюлозы наслаивают по 1 мл р::..;-вора хлорида цезия, плот.(acòü р — 1,9 г/мл, с 0,75 мл 30Х-кого р",c.f.вора в тройном буферном растворе )1. с рН 8,0. По 2 мл прсо дос ">T»E(T."»ò градиент и трубки закрь(гают стер}(л)>к гарафином. После центрифугировлн)(я т) при 18 С 130 000 р в течение 4 центрифуге Бекмана с ротором Б 01 50.1 забирают слой хлсридл цезия. ))ля зтсй > цели центрифужные трубки прт)калы));-!;)— на дне прокаленной иглой и весь раст— вор хлорида цезия переводят в трубки до слоя сахарозы. Полученнь: †."т образом раствор разбавляют стер()я--.)(ой вОдой в coowHO)l!e}(H)f 1: 2 и сох-»::.::))! От»л-0« .мороженным при -20 С, сед)ментир)я черг:, 1, ) г. .". ..-. ",с }:.-I }! ) г-,,:.;;,:;3 Л-,}ЕТ..О),I ". Лг.—:11-!. =,т „11, ;;-1 -„!;,f f(;1C>;тт ;т т Л «т*, 0 ) (f, .(»!)T})if )> т 1(Г>«!ПТ "-.efi!; (e f,ме;)е, e e}TI;e 4 >f (ппсд > ,—;>т;.!.И ГЕЛ«.!T;, — 9 J ()1)И т ) ,}3 000 т-, .t,- TE»к-.р))}))уг} 1)О.:: (!я } ->;;,) К) Гр,) т, а )В : }) i!;" HH» ) фРЛК1\!(О тт 1) I); ю) 1 > — 1 ., )т,, )к);f )I т)О 3 !0;) TT»:! 1> (=0, -,(л }}л «ьр,-; ; lf!> О, i! . 1 лждой +) т". (П -T",. (>--,- тт )т ОП ""ЕКПЯ т .)а г;l . ЛКТ:тв .. C ."!(, От. ТЛ;i1! > . .!Г . ) 3 .Ë р>IЗРДВ}ПЛЮТ Од))1!;.;. -»НМ 0 б E-,e. .»Ì В«,-П) -х, л}1«-.; прт- — 0 Посл; то. с, 1<а}0 > 0 -.(-Гг.« .тя -, .=,;.- ; -т.-, >()Л, ifт!Н !, "т — т -, 1тт >и,))! \К" }т(, ) t.,Ст > — -Кiтя)- «К::,-., Лт-,-.,:-.: -},.)-,1 .. -,ПГ} -; 1.. к:,-тт 31 т г:- )т)-. г . -;-. Ii>: Л )г 0 ГО»б (яч»*. К".Мl), 11"!T) " f. т т С !eр»К(ГХ С>IT 1 1« }- пт > - .;:тт «)1}.(-)OPq} тт );т I1> r fI " .. - .:Of.. . Сот, С СТВу (Н. HC)f!::) Л:f>»;П,СКЛ ««>Г))» ГО ГIСРС " :. }. » 0 )I:>TT .;Е:}К!! ); : 1) е ППО 1(СХС EIT, (О - «Скт с;> 1) T . . Об!. - =. i 10 f . )> T. I If )»ьl сo i:О С:IСц)1.О., }» —, - —:-. ",(П; - .,—,.- т)..т;)ВЛ}1-;т. 1-С; т(q т(
