Способ получения липосомальной формы альфа-токоферола и гомогенизирующий клапан для его осуществления

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения новой лекарственной формы альфа-токоферола, которое может быть использовано при различных авитаминозных заболеваниях, сахарном диабете, атеросклерозе, а также в косметологии, в ветеринарии в качестве кормовых добавок и инъекций. В основу изобретения положена задача повышения производительности за счет получения концентрированных суспензий и максимального включения альфа-токоферола в липосомы, а также получения суспензий с заданным размером липосом. Предложенный способ получения липосомальной формы альфа-токоферола включает растворение фосфолипидов в органическом растворителе, упаривание, высушивание с помощью роторного испарителя, гидратацию, гомогенизацию при высоком давлении в непрерывном процессе и стерилизующую фильтрацию липосомальной суспензии. Отличительной особенностью изобретения является то, что растворенные в органическом растворителе фосфолипиды и альфа-токоферол смешивают, фильтруют под давлением в атмосфере инертного газа, а затем эту смесь после гидратации подвергают циклической гомогенизации в замкнутом контуре под давлением 10 - 200 МПа при температуре 32 - 35^oC, при этом соотношение альфа-токоферола к фосфолипидам составляет 1 : 6 по массе соответственно. В качестве фосфолипидов используют лецитин или смесь лецитина и холестерина в любом соотношении. Для растворения фосфолипидов применяют этиловый спирт, а для растворения альфа-токоферола - хлороформ. При проведении процесса гомогенизации число циклов может быть от 1 до 50. Для осуществления данного способа используется гомогенизирующий клапан, содержащий опорное седло с входным и выходным отверстиями, с острой кромкой и кольцевой канавкой. Отличительной особенностью гомогенизирующего клапана является то, что он снабжен затвором, выполненным в виде цилиндра с конической торцевой поверхностью и установленным в выходном отверстии опорного седла с возможностью взаимодействия конической поверхности затвора с острой кромкой седла, причем кольцевая канавка выполнена на внутренней поверхности опорного седла и расположена между острой кромкой седла и выходным отверстием, а отношение ширины и глубины кольцевой канавки составляет от 3 : 2 до 1 : 5 соответственно. Целесообразно, чтобы величина телесного угла конической торцевой поверхности составляла от 15 до 165^o. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения новой лекарственной формы альфа-токоферола, которое может быть использовано при различных авитаминозных заболеваниях, сахарного диабета, атеросклероза, а также в косметологии, в ветеринарии в качестве кормовых добавок и инъекций.

Из литературных источников и патентных документов известны различные методы получения липосом, которые могут применяться в качестве транспортеров лекарственных средств, ферментов и других физиологически активных веществ для решения аналитических, диагностических и терапевтических задач. Включение лекарственных веществ в фосфолипидные везикулы липосомы является одним из путей снижения токсичности препаратов. Альфа-токоферол (витамин E) является антиоксидантом. Способность альфа-токоферола растворяться только в жирах и органических растворителях затрудняет его доступ в клетки кожи. Решающим фактором доставки альфа-токоферола в клетку через ее мембрану является включение альфа-токоферола в бислои липосом.

Известен способ получения липосом с помощью гомогенизатора высокого давления (E. Mentrup and H. Stricker. Herstellung von Liposomen mit einem Hochdruckhomogenisator, Pharm. Ind. 52, Nr.3, 1990, p. 343 347), в котором использовались гидрогенированный фосфатидилхолин из лецитина сои с молярным соотношением стеароил/пальмитоил 6 1, димиристоилфосфатидилхолин, хинолин желтый и судан красный. Судан красный и хинолин желтый использовались для определения внутреннего объема капсулы. В качестве растворителя наряду с дистиллированной водой использовали PBS-буфер.

Способ заключается в следующем. Фосфолипиды, холестерол и при необходимости судан красный растворяли по методу пленок в смеси хлороформ/метанол (метиловый спирт 2/1 объемные части) и высушивали под вакуумом при 60^oC до образования пленки. После добавления водной фазы и гидратирования в течение 1 ч при 60^oC при встряхивании происходило образование везикул. Полученную таким образом грубую дисперсию пропускают через гомогенизатор высокого давления при давлении от 0 до 200 МПа.

В данной работе показана возможность получения липосом различного липидного состава в зависимости от длительности диспергирования (количества прохождения через гомогенизатор высокого давления), от размера сопла (гомогенизирующего клапана), давления и температуры. Конкретного лекарственного вещества для включения в липосомы не использовали, а в качестве модели инкапсулируемого вещества брали красители, например, судан красный или хинолин желтый.

В качестве прототипа выбран способ (M. Halks-Miller, L.S.S. Guo and R.L. Hamilton. Tocopherol-Phospholipid Liposomes: Maximum Content and Stability to Serum Proteins. Lipids, 1985, v.20, N 3, 195 200) приготовления липосом из яичного фосфатидилхолина с помощью пресса Френча, включающих альфа-токоферол в количестве от 15 до 30 моль.

Цель работы определение максимального количества альфа-токоферола, которое может быть включено в липосомы из фосфатидилхолина при изготовлении их с помощью пресса Френча, но не создание препарата в виде липосомальной формы альфа-токоферола.

Способ приготовления липосом, описанный в статье, включает смешивание растворенных в этаноле фосфатидилхолина и различных концентраций альфа-токоферола, упаривание смеси для удаления этанола до сухого остатка, гидратацию для получения липосомальной дисперсии водной солевой композицией (колоночный буфер) и гомогенизацию дисперсии пропусканием 3 4 раза через пресс Френча при давлении 20000 psi (psi=фунт/дюйм², 20000 psi приблизительно составляет около 144 МПа). Иногда при необходимости в состав липосом добавляется холестерин, растворенный в этаноле. Полученные липосомы имеют широкий разброс средних диаметров липосомальных везикул от 28 до 600 нм. Липосомы малых размеров (28 100 нм) являются однослойными, а более крупные (100 600 нм) преимущественно многослойными. Липосомы фракционировались и в каждой фракции определялось содержание альфа-токоферола. Согласно полученным данным максимальное содержание альфа-токоферола в липосомах из фосфатидилхолина, приготовленных с помощью пресса Френча, может быть не более 33 моль. Причем при УЗ-диспергировании липосом включение альфа-токоферола существенно меньше (до 4,8 мол.), чем при использовании пресса Френча.

Таким образом в данном источнике информации подчеркивается, что степень включения альфа-токоферола в липосомы зависит от способа получения липосом и от устройства, реализующего этот способ.

Пресс Френча, как известно, был сконструирован для научно-исследовательских целей по дезинтеграции микроорганизмов. Однако его конструкция и технические параметры позволяют приготавливать небольшие количества эмульсий и липосомальных дисперсий. При этом следует помнить, что гидродинамические условия диспергирования и гомогенизации липосомальных дисперсий не являются оптимальными и, следовательно, полученные липосомальные дисперсии могут обладать не самыми лучшими параметрами как по дисперсному составу, так и по степени включения биологически активного вещества, например альфа-токоферола. Большое значение при получении липосом, включающих альфа-токоферол, имеет поддержание оптимального температурного режима. Исходя из нашего опыта, меньшее включение альфа-токоферола в липосомы при УЗ-обработке, по-видимому, вызвано, во-первых, тем, что при УЗ-обработке в результате кавитации высвобождается большое количество тепла, а охлаждение или отсутствует, или недостаточно, во- вторых, кавитационные гидродинамические параметры эквивалентны давлениям гомогенизации в 300 400 МПа, что приводит к чрезмерному уменьшению среднего диаметра липосомальных везикул и уменьшает включение альфа-токоферола. Пресс Френча позволяет создать более "мягкие" условия гомогенизации, что увеличивает степень включения альфа-токоферола в липосомы. Однако он также не позволяет поддерживать оптимальный температурный режим, а его экструзионное устройство (сопло) не позволяет регулировать давление гомогенизации с целью выбора оптимального режима. Показано, что полученные липосомы имеют широкий разброс размеров и различные фракции липосом включают разное количество альфа-токоферола. Это подтверждает заявление, что степень дисперсности липосом и количество включаемого в них альфа-токоферола зависит в первую очередь от способа гомогенизации и гомогенизирующего устройства.

Таким образом, предлагаемый в прототипе способ получения липосом, содержащих альфа-токоферол, с использованием пресса Френча, имеет следующие недостатки: широкий разброс средних диаметров липосом, что приводит к различной концентрации альфа-токоферола в липосомах; отсутствие температурного контроля процесса гомогенизации, что также снижает включение альфа-токоферола в липосомы; низкую эффективность гомогенизации; Известно устройство (заявка Франции N 2534487, кл. B 01 F 3/12, 1984) для осуществления способа гомогенизации дисперсий гидратированных жировых фаз и получения суспензий, содержащее входное отверстие, ограниченное стенками, (седло) и закрывающий элемент (затвор), создающие узкий проход (гомогенизирующую микрощель). Гомогенизацию осуществляют путем подачи дисперсии под давлением в узкий проход, ограниченный стенками отверстия и краями закрывающего элемента, расположенного в участке отверстия на стороне, противоположной направлению потока дисперсии.

К недостаткам данного устройства следует отнести невысокий гомогенизирующий эффект за счет отсутствия острой кромки у седла.

Известен гомогенизирующий клапан для получения высокодисперсных эмульсий, содержащий седло с острой кромкой и отверстием для установки в нем затвора, выполненного в виде цилиндра с конической торцевой поверхностью, при этом в седле клапана между острой кромкой и отверстием для установки затвора выполнена кольцевая прямоугольная в сечении канавка, а в отверстии седла выполнены радиальные проточки для выхода гомогенизированной эмульсии. Телесный угол конической поверхности затвора имеет величину от 60 до 150^o.

К недостаткам данного устройства следует отнести то, что использование данного клапана не обеспечивает получения липосом с включенными в них биологически активными веществами.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому устройству является гомогенизатор (патент США N 4585357, НКИ 366 176, 1986), содержащий опорное седло, расположенное вблизи первого края смесительного цилиндра и канал для прохода жидкой среды в осевом направлении к центру. Вблизи второго края цилиндра смонтировано нажимное седло. Гомогенизатор, кроме того, содержит один или несколько смесительных цилиндрических клапанов, расположенных последовательно и имеющих в центре проход. Между соседними клапанами, опорным и нажимным седлами ограничены промежуточные микрозазоры, а снаружи вокруг микрозазоров выполнены кольцеобразные канавки. Канавки получены за счет механической обработки внутренней стенки цилиндра или наружных стенок клапанов. Вытекающие из микрозазоров струи жидкости наталкиваются на поверхности канавок, расположенные на внутренней стенке цилиндра. В указанных поверхностях имеются выпускные отверстия, сообщающиеся с каналом для отведения гомогенизированной жидкой среды, выполненными на наружной поверхности смесительного цилиндра.

К недостаткам данного гомогенизатора можно отнести сложность конструкции, не обеспечивающей получение необходимой дисперсности липосомальных суспензий.

В основе изобретения задача повышения производительности за счет получения концентрированных суспензий и максимального включения альфа-токоферола в липосомы, а также получения суспензий с заданным размером липосом.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой новый способ получения липосомальной формы альфа-токоферола, осуществление которого обусловливается применением гомогенизирующего клапана определенной новой конструкции.

Предложенный способ получения липосомальной формы альфа-токоферола включает растворение фосфолипидов в органическом растворителе, упаривание, высушивание с помощью роторного испарителя, гидратацию, гомогенизацию при высоком давлении в непрерывном процессе и стерилизующую фильтрацию липосомальной суспензии согласно изобретению растворенные в органическом растворителе фосфолипиды и альфа-токоферол смешивают, фильтруют под давлением в атмосфере инертного газа, а затем эту смесь после гидратации подвергают циклической гомогенизации в замкнутом контуре под давлением 10-200 МПа при температуре 32-35^oC, при этом соотношение альфа-токоферола к фосфолипидам составляет 1:6 по массе соответственно.

Для осуществления способа в качестве фосфолипидов используют лецитин или смесь лецитина и холестерина в любом соотношении. Для растворения фосфолипидов используют этиловый спирт, а для растворения альфа-токоферола хлороформ. При проведении процесса гомогенизации число циклов может быть от 1 до 50.

Осуществление данного способа возможно с помощью гомогенизирующего клапана, содержащего опорное седло с входным и выходным отверстиями, с острой кромкой и кольцевой канавкой, согласно изобретению гомогенизирующий клапан дополнительно снабжен затвором, выполненным в виде цилиндра с конической торцевой поверхностью и установленным в выходном отверстии опорного седла с возможностью взаимодействия конической поверхности затвора с острой кромкой седла, причем кольцевая канавка выполнена на внутренней поверхности опорного седла и расположена между острой кромкой седла и выходным отверстием, а отношение ширины и глубины кольцевой канавки составляет от 3:2 до 1:5 соответственно.

Целесообразно, чтобы величина телесного угла конической торцевой поверхности составляла от 15 до 165^o.

На фиг.1 представлен гомогенизирующий клапан для осуществления способа.

Гомогенизирующий клапан для получения липосомальной формы альфа-токоферола содержит седло 1 с входным отверстием 2 и выходным отверстием 3, затвор 4 в виде цилиндра с конической торцевой поверхностью 5, которая контактирует с кольцевой острой кромкой седла 6 и образует клапанную щель. Седло со стороны выходного отверстия имеет выступы 7, кольцевую прямоугольную канавку 8, кольцевое углубление 9 с уплотняющей прокладкой 10, расположенное на фронтальной поверхности клапана.

Следует отметить, что кольцевая прямоугольная в сечении канавка образована в седле цилиндрической поверхностью 11 и двумя плоскостями 12 и 13, причем плоскость 12 одновременно формирует острую кромку (и, следовательно, гомогенизирующую щель), а плоскость 13 формирует переднюю стенку выступов, направляющих и центрирующих затвор.

Гомогенизирующий клапан работает следующим образом.

После установки клапана в гомогенизатор седло клапана 1 зажимается и герметизируется с помощью прокладки 10 так, чтобы липосомальная суспензия имела бы один путь через входное отверстие 2. Затвор 4 устанавливается в седло 1 и самоцентрируется посредством конической торцевой поверхности 5 и радиальных выступов седла 7. При плотном без нагрузки прилегании контактирующих поверхностей седла и затвора расстояние между средними линиями микронеровностей профиля контактирующих поверхностей определяется суммой высот наибольших выступов, вступивших в контакт. Затем затвор прижимается к острой кромке седла с некоторой силой F, создаваемой, например, пружиной. Сила F создает давление на поверхность седла и затвора. Давление гомогенизации P, возрастающее в результате работы гомогенизатора, противодействует силе F и при P > F в гомогенизирующем клапане образуется микрощель определенной ширины, через которую проходит продукт. Частицы суспензии липосом, проходя через гомогенизирующую щель, испытывают растягивающее и разрывающее влияние сил микропульсаций турбулентного потока и кавитации, дробятся на более мелкие частицы. Для усиления этого эффекта на выходе из гомогенизирующей щели имеется кольцевая прямоугольная канавка 8. Она создает дополнительные турбулентные вихри с акустической вибрацией, что увеличивает дробление липосом. Количество вихрей и частота акустической вибрации зависят от ширины и глубины кольцевой прямоугольной канавки.

Средний размер частиц суспензии липосом, например липосом, содержащих альфа-токоферол, изменяется в зависимости от телесного угла конической поверхности затвора.

Пример 1. 30,0 мл лецитин-стандарта (10%-ный раствор лецитина в этиловом спирте) смешивают с 0,50 г альфа-токоферола, растворенного в 60,0 мл перегнанного хлороформа, и фильтруют через фильтры под давлением 1,1 атм инертного газа, например, азота, затем помещают в 2,0 л колбу роторного испарителя, при температуре 32-35^oC высушивают в колбе на роторном испарителе. К образовавшейся пленке добавляют 60,0 мл хлороформа и вновь проводят упаривание до образования абсолютно сухой пленки, продувают инертным газом, например, азотом, затем осуществляют гидратацию до образования однородной суспензии, далее смыв грубой суспензии, после чего эту массу подвергают трехкратной гомогенизации в замкнутом контуре в непрерывном процессе с помощью гомогенизирующего клапана в гомогенизаторе под давлением 40 МПа при температуре 30-35^oC, количество циклов гомогенизации (проходов) - три с последующей стерилизующей фильтрацией через фильтры диаметром 0,2 мкм под потоком стерильного инертного газа. Суспензия после гомогенизации получается в виде полупрозрачного липосомального раствора. Липосомы согласно данному примеру получают размером 300 нм. Соотношение альфа-токоферола к фосфолипидам равно 1:6.

Пример 2. Повторяют способ по примеру 1, но используют при этом 2400 мл 10%-ного лецитин-стандарта в спирте и 40 г альфа-токоферола, растворенного в 2600 мл хлороформа. Смесь фильтруют и упаривают в роторном испарителе по примеру 1. Затем пленку перерастворяют в 2600 мл хлороформа, снова упаривают до образования сухой пленки, проводят гидратацию до общего объема суспензии 500 мл, при этом давление в процессе гомогенизации составляет 80 МПа, температура 30 35^oC, количество циклов три, размер липосом согласно данному примеру 150 170 нм, соотношение альфа-токоферола к фосфолипидам составляет 1:6.

Пример 3. Повторяют способ по примеру 1, но используют 30,0 мл 10%-ного лецитин-стандарта, 0,6 г холестерина и 0,4 г альфа-токоферола, давление то же что и в примере 1, соотношение альфа-токоферола и холестерина к фосфолипидам 1:6, соотношение альфа-токоферола к холестерину может быть любым.

Результаты были определены экспериментально, где установлено, что: определение внешнего вида липосомального альфа-токоферола проводится визуально. Суспензия липосом должна быть однородной, без расслоени; анализ размера липосом производится с помощью лазерного фотонного анализатора "Coulter N4". Метод заключается в том, что измеряют размеры липосом в разведенном водном растворе в проходящем лазерном луче путем корреляции броуновских колебаний частиц с их размерами. Размер липосом должен укладываться в интервал значений 50 400 нм; для определения содержания альфа-токоферола в препарате используют спектрофотометрический метод с построением калибровочной кривой зависимости его оптического поглощения от концентрации. Содержание альфа-токоферола в препарате должно равняться 10 мг/мл суспензии липосом.

Способ получения альфа-токоферола липосомальной формы, осуществляемый в соответствии с настоящим изобретением, позволяет получать липосомы с включенным альфа-токоферолом с высокой биологической активностью и стабильностью при хранении.

Проведение циклической гомогенизации с использованием вышеуказанного клапана обеспечивает получение липосом малого размера 50 400 нм. Заданное значение размера липосом достигается путем выбора давления и количества циклов гомогенизации.

Температуру в процессе гомогенизации регулируют путем охлаждения гомогенизирующего клапана с внешнего контура хладагентом.

На фиг.2 показана зависимость среднего размера частиц полученных липосомальных суспензий от количества циклов гомогенизации (проходов) при различных значениях давления; на фиг.3 распределение диаметров частиц липосом в суспензии (дисперсность суспензии липосом) (кривая 1 представляет распределение липосом по диаметрам перед гомогенизацией (средний диаметр липосом D_ср 719 нм и стандартное отклонение SD 671 нм), а кривая 2 распределение липосом по диаметрам после гомогенизации в течение трех циклов при давлении P 70 МПа (средний диаметр липосом D_ср 152 нм и стандартное отклонение SD 67 нм)).

Получение альфа-токоферола липосомальной формы в настоящее время очень актуально, так как альфа-токоферол является антиоксидантом и стабилизатором липидных бислоев в липосомах.

Преимущество предлагаемого способа получения липосомальной суспензии с включенным в него альфа-токоферолом с помощью гомогенизирующего клапана новой конструкции по сравнению, например, с методом фильтрации через ядерные фильтры заключается в том, что данный способ обеспечивает получение более концентрированных (в 8 раз) суспензий, что приводит к повышению производительности. Полученный липосомальный концентрат разбавляется до нужной концентрации.

Необходимо также отметить, что данное изобретение обеспечивает масштабирование процесса.

Наличие кольцевой прямоугольной в сечении канавки обеспечивает дополнительное вихреобразование и акустические вибрации, что повышает качество дисперсности липосомальных структур.

Использование клапана с отношением сторон канавки (ширины i и глубины h) в пределах от 3:2 до 01:5 соответственно обеспечивает наибольшую эффективность гомогенизации при получении липосом заданного размера с включенным альфа-токоферолом.

Проведение циклической гомогенизации в непрерывном процессе ведет к экономии времени и энергозатрат.

Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности, в ветеринарии при использовании липосомального альфа-токоферола в качестве кормовых добавок и инъекций животным, а также в косметической промышленности.

При использовании в косметической промышленности можно отметить, что при нанесении липосомального альфа-токоферола на кожу липосомы сливаются с клеточными мембранами и транспортируют альфа-токоферол внутрь клетки. Поэтому данный препарат способствует улучшению питания и увлажнения кожи, усилению блеска (яркости) кожи, уменьшению глубины морщин и отечности под глазами.

Литература 1. E. Mentrup and H. Stricker. Herstellung von Liposomen mit einem Hochdruckhomogenisator. Pharm. Ind. 52, Nr.3, 1990, p.343 347.

2. Заявка Франции N 2534487, МКИ B 01 F 3/12, 1984 (прототип). "Способ гомогенизации дисперсий гидратированных пластинчатых жировых фаз и полученные суспензии и устройство для его осуществления".

3. Заявка Франции N 2534487, МКИ B 01 F 3/12, 1984. "Способ гомогенизации дисперсий гидратированных пластинчатых жировых фаз и полученные суспензии и устройство для его осуществления" (аналоги: заявка Японии N 1-31414, МКИ B 01 F 3/08, 1989; патент США N 4621023, НКИ 428-402.2, 1986 и патент ЕП N 0107559, МКИ F 61 K 9/50, 1984).

4. Патент США N 4585357, НКИ 366 176, 1986 (прототип). -"Гомогенизатор".

Формула изобретения

1. Способ получения липосомальной формы альфа-токоферола, включающий растворение фосфолипидов и альфа-токоферола в органическом растворителе, упаривание, высушивание, гидратацию с последующим получением водной суспензии липосом и гомогенизацию под давлением, отличающийся тем, что смесь растворенных фосфолипидов и альфа-токоферола перед упариванием фильтруют под давлением в атмосфере инертного газа, и после гидратации полученную суспензию липосом подвергают циклической гомогенизации в замкнутом контуре под давлением 10 200 МПа при 32 35^oС, при этом соотношение альфа-токоферола и фосфолипида составляет 1 6 по массе соответственно.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении процесса гомогенизации число циклов может быть 1 50.

3. Гомогенизирующий клапан для получения липосомальной формы альфа-токоферола, содержащий опорное седло с входным и выходным отверстиями с острой кромкой и кольцевой канавкой, отличающийся тем, что в него введен затвор, выполненный в виде цилиндра с конической торцевой поверхностью и установленный в выходном отверстии опорного седла с возможностью взаимодействия конической поверхности затвора с острой кромкой седла, при этом кольцевая канавка выполнена на внутренней поверхности опорного седла, имеет прямоугольное сечение и расположена между острой кромкой седла и выходным отверстием, а отношение ширины к глубине кольцевой канавки составляет 1,5 - 0,2 соответственно.

4. Клапан по п.3, отличающийся тем, что величина угла при вершине конуса, ограниченного конической торцевой поверхностью затвора, составляет 15 - 165^o.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3