Способ получения биоматериала для использования в офтальмологии

 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к офтальмологии, и может быть использовано для приготовления материалов для изготовления интраокулярных и контактных линз, при оперативном или консервативном лечении миопии в клинике офтальмохирургии, а также как источник для получения растворов коллагена при лечении миопии легкой степени и изготовления наружных лекарственных форм. Способ получения биоматериала для использования в офтальмологии заключается в том, что в качестве источника биологического сырья используют базальные мембраны крупного рогатого скота, которые после выделения инкубируют в смеси пепсин : гиалуронидаза : 0,5 М раствор уксусной кислоты в соотношении 1 : 1 : 10⁶ в течение 10 ч при 45^oC, после чего раствор центрифугируют от 5000 до 30000 об/мин в течение 30 мин. 1 з. п ф - лы.

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к офтальмологии, и может быть использовано для приготовления материалов для изготовления интраокулярных и контактных линз, при оперативном или консервативном лечении миопии в клинике офтальмохирургии, а также как источник для получения растворов коллагена при лечении миопии легкой степени и изготовления наружных лекарственных форм.

Известен способ получения пластичного биоматериала, заключающийся в ферментной обработке животного сырья, а именно склеры свиньи, получении из нее коллагена и смешивании его с мономерами, который выбран за прототип, поскольку он наиболее близок по техническому решению.

Однако этот способ имеет ряд существенных недостатков, а именно: при ферментной обработке трипсином первичная структура коллагена склеры свиньи необратимо разрушается, изготовленные из такого коллагена изделия обладают хрупкостью, что не позволяет создавать высокую концентрацию такого коллагена в конечном продукте.

Задачей изобретения является получение биоматериала, где в качестве источника биологического сырья используют базальные мембраны крупного рогатого скота, который соответствующим образом обработан растворами.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является получение биоматериала, который может широко использоваться для изготовления эластичных высокопрочных интраокулярных и контактных линз, обладающих высокой биосовместимостью и газопроницаемостью.

Технический результат достигается тем, что в качестве животного сырья используют базальные мембраны крупного рогатого скота, которые после выделения инкубируют в смеси пепсин гиалуронидаза 0,5 М раствор уксусной кислоты при соотношении 1 1 10⁶, в течение 10 ч при 45^oC, после чего раствор центрифугируют от 5000 до 30000 об/мин в течение 30 мин. В качестве базальных мембран используют капсулы хрусталика глаза, почек и плаценты крупного рогатого скота.

Базальные мембраны являются частью соединительной ткани и содержит в основном коллаген IV типа. Особенностью этого типа коллагена является то, что он является нефибриллярным. Это короткие структуры мол. м. 165 185.000 Дальтон (см. Серов В. В. Шехтор А. Б. "Соединительная ткань". 1979, с. 11 - 30). Именно коллаген IV типа придает базальным мембранам важные биологические свойства, а именно высокую газопроницаемость, ферментативную устойчивость, прочность и эластичность. Другим его важным свойством является высокая прозрачность при высоких концентрациях даже в смеси с другими биополимерами. При ферментативном гидролизе первичная структура коллагена IV типа не разрушаются.

Базальные мембраны являются неклеточными структурами и не содержит сосудов, что делает их особо ценными при изготовлении биоматериалов.

Благодаря своей нефибриллярной короткоцепочечной структуре коллаген базальных мембран IV типа может легко встраиваться в структуру мономеров и полимеров, причем в очень высоких концентрациях (до 50).

После механического выделения базальных мембран из органов (хрусталик, капсула почек, плацента крупного рогатого скота) их достаточное весовое количество инкубируют в смеси ферментов пепсин гиалуронидаза 0,5 М раствор уксусной кислоты при соотношении 1 1 10⁶ с целью ферментного и кислотного расщепления. Пепсин гидролизует белки до аминокислот, гиалуронидазу гидролизуют входящие в состав базальных мембран гликозаминогликаны, а уксусная кислота гидролизует коллаген до фибриллярного состояния. Гидролиз проводят не менее 10 ч, так как это время является оптимальным для полного их гидролиза, причем гидролиз осуществляется при 45^oC. Экспериментально установлено, что при этой температуре происходит полный гидролиз всех белков, гликозаминогликанов и других компонентов мембран, кроме коллагена IV типа. При конечной температуре смеси 45^oC через 10 ч ферменты самопроизвольно инактивируются.

После гидролиза надосадок сливают, диализируют, после чего для осаждения коллагена IV типа раствор центрифугируют. При высоком содержании коллагена в растворе достаточно скорости 5.000 об/мин, а при меньшем скорость может достигать 30.000 об/мин. Время центрифугирования при этих скоростях не превышает 30 мин, поскольку это время оказывается достаточным для полного осаждения коллагена. В этом растворе определяют весовое содержание коллагена и после этого его добавляют в мономеры.

Способ осуществляется следующим образом.

Хрусталики крупного рогатого скота, капсулы почек или плаценту крупного рогатого скота очищают от примесей крови, механических загрязнений. От хрусталиков отделяют переднюю капсулу, а плаценту очищают механически от поверхностных тканей. Полученные капсулы отмывают водой, в зависимости от вида ткани подбирают весовые количества ферментов и скорость осаждения коллагена, после чего базальные мембраны (капсулы) инкубируют в смеси пепсин гиалуронидаза 0,5 М раствора уксусной кислоты при соотношении 1 1 10⁶ в течение 10 ч при 45^oC, надосадок сливают и диализируют, после чего раствор центрифугируют от 5.000 до 30.000 об/мин в течение 30 мин. После определения содержания в растворе коллагена его смешивают с мономерами в нужных пропорциях.

Пример 1. Выделение коллагена IV типа из базальной мембраны (передней капсулы хрусталика глаза крупного рогатого скота).

Выделяют из глаз крупного рогатого скота хрусталики и помещают их в физиологический раствор, тщательно отмывают их от примесей крови и остатков стекловидного тела.

Острой бритвой срезают передние капсулы с хрусталиков и помещают их в инкубирующий раствор ферментов.

Раствор ферментов готовят следующим образом: на 500 г хрусталиков берут 50 мг пепсина, 50 мг гиалуронидазы и 500 мл 0,5 М уксусной кислоты.

Выделенные капсулы (500 штук) помещают в раствор ферментов на 10 ч при 45^oC. Производят периодическое перемешивание массы.

Через 10 ч надосадок сливают и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок сливают и раствор коллагена помещают в диализные мешки.

Производят диализ против 0,05 М уксусной кислоты, после чего определяют в диализате концентрацию коллагена.

К 10 г полученного раствора коллагена добавляют 70 г 2- гидроксиэтилметакрилата (мономера), тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин 30 мин.

Смесь охлаждают до 4^oC и облучают дозой излучения 15 кГр.

Полученный гель высушивают и изготавливают линзы методом точения.

Пример 2. Выделенный коллаген IV типа из базальной мембраны (капсулы почек крупного рогатого скота).

Выделенные почки тщательно промывают от крови и примесей, бритвой вырезают капсулы и гомогенизируют их в гомогенизаторе Поттера.

На 1 кг почек готовят раствор ферментов: 100 мг пепсина, 100 мг гиалуронидазы и 1 л 0,5 уксусной кислоты.

Капсулы помещают в инкубирующую смесь на 10 ч при 45^oC. Периодически размешивают массу.

Через 10 ч надосадок сливают и центрифугируют при 10.000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок сливают.

Раствор коллагена диализируют против 0,05 М раствора уксусной кислоты, после чего определяют концентрацию коллагена.

К 10 г полученного гелевого раствора добавляют 50 г акриламида в смеси с 0,01 г N-метиленбисакриламида и воды, гель переносят в форму, охлаждают до 0^oC и облучают γ-облучением 5 кГр.

Полученный гель высушивают и изготовляют линзы методом точения.

Пример 3. Выделение коллагена IV типа из базальной мембраны плаценты крупного рогатого скота.

Плаценту механически очищают и гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера.

Гомогенат (1 кг) помещают в инкубируемую смесь 100 мг пепсина, 100 мг гиалуронидазы в 1 л 0,5 М раствора уксусной кислоты на 10 ч при 45^oC.

Через 10 ч надосадок сливают и центрифугируют при 30.000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок сливают в диализные мешки.

Проводят диализ против 0,05 М уксусной кислоты, после чего определяют в диализаторе концентрацию коллагена.

К 10 г полученного раствора коллагена добавляют 70 г 2-гидроксиметакрилата (мономера), тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин.

Смесь охлаждают до 4^oC и облучают дозой излучения 15 кГр.

Полученный гель высушивают и изготавливают линзы методом точения.

Формула изобретения

1. Способ получения биоматериала для использования в офтальмологии, заключающийся в том, что биологическое сырье обрабатывают ферментами, полученный раствор коллагена смешивают с мономерами, отличающийся тем, что в качестве источника биологического сырья используют базальные мембраны крупного рогатого скота, которые после выделения инкубируют в смеси пепсин гиалуронидаза 0,5 м раствор уксусной кислоты в соотношении 1:1:10⁶ в течение 10 ч при 45^oС, после чего раствор центрифугируют от 5000 до 30000 об/мин в течение 30 мин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве базальных мембран используют капсулы хрусталика глаза, почек и плаценты крупного рогатого скота.