Способ лечения гепатита в

 

Изобретение относится к медицине, конкретно к терапии и касается способов лечения вирусного гепатита B препаратом ламивудин, (-)-цис-1-(2-(2-гидроксиметил)-1,3-оксатиолан-5-ил-цитозин. Показано, что 3-месячное лечение ламивудином при дозах не менее 100 мг/день приводит стопроцентному подавлению ДНК вируса гепатита B у больных. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

Настоящее изобретение относится к применению производных 1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)цитозина и их физиологически функциональных производных для лечения инфекций вируса гепатита B.

Вирус гепатита B (ВГВ) является всемирно известным вирусным патогенным микроорганизмом. ВГВ наиболее широко распространен в азиатских странах и в африканских странах южнее Сахары. Вирус этиологически связан со злокачественной гепатомой и, как полагают, вызывает 80% случаев рака печени в мире. В США каждый год госпитализируют больше 10 000 людей в связи с инфекцией ВГВ, в среднем 250 человек умирают в связи с быстрым развитием болезни. В США имеется около 500 000 - 1 млн носителей инфекции. Хронический активный гепатит развивается у более чем 25% носителей и часто переходит в цирроз. Согласно оценке около 5000 людей умирает от цирроза, связанного с ВГВ, каждый год в США и возможно 1000 умирает от рака печени, связанного с ВГВ. Даже в случае универсальной ВГВ вакцины, будет оставаться необходимость в эффективных анти-ВГВ соединениях. Большое количество постоянно инфецированных носителей, оцениваемое в 220 млн. человек во всем мире, не получит пользы от вакцинации и будет пребывать в состоянии высокого риска заболеть болезнями печени, вызываемыми ВГВ. Популяция носителей служит источником инфекции восприимчивых индивидуумов, сохраняющих случаи заболеваний, особенно в эндемических областях и группах высокого риска, таких как злоупотребляющие лекарствами и гомосексуалисты. Таким образом, существует необходимость в эффективных антивирусных средствах как для борьбы с хроническими инфекциями, так и для снижения роста злокачественной гепатомы.

Клинические проявления инфекции вирусом ВГВ включают головную боль, лихорадку, недомогание, тошноту, рвоту и боли в животе. Репликация вируса обычно регулируется иммунным ответом с продолжительностью периода выздоровления в недели или месяцы у людей, но инфекция может быть более серьезной, приводя к постоянной хронической болезни печени. В книге: Вирусные Инфекции Человека, (второе издание, ред. А.С.Эванс, 1982, Пленум Паблишинг Корп., Нью-Йорк), глава 12 описывает этиологию инфекции вирусным гепатитом.

Европейский патент N 0382526 описывает некоторые 1,3-оксатиолановые аналоги нуклеозидов, ингибирующие репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Мы нашли, что производные 1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5- ил)цитозина формулы I , (в которой R - водород или C₁-C₃-алкил) и их физически функциональные производные, имеющие высокую активность против ВГВ.

Предпочтительным соединением формулы I является соединение, где R - водород, т.е. 1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-цитозин.

Следует заметить, что соединения формулы I содержат два хиральных центра, и, следовательно, существуют в форме двух пар оптических изомеров, например энантиомеров, и их смесей, включая рацемические смеси. Таким образом, соединения формулы I могут быть либо цис- или транс-изомером, либо их смесью. Каждый цис- и транс-изомер может существовать в качестве одного из двух энантиомеров или их смеси, включая рацемические смеси. Все такие изомеры и их смеси, включая рацемические смеси, входят в предмет изобретения. Предпочтительным является цис-изомер соединения формулы I. Изобретение включает оптические и геометрические изомеры и все таутомерные формы соединений формулы I: из цис-изомеров (-)-изомер, т.е. (-)-цис-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-цитозин, особенно предпочтителен.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения мы предлагаем использовать соединения формулы I или их физиологически функциональные производные для лечения или профилактики инфекций вируса гепатита B. Согласно другому аспекту изобретения мы предлагаем использовать соединения формулы I или их физиологически функциональные производные для приготовления лекарственных препаратов для лечения или профилактики инфекций вируса гепатита B. Дополнительные аспекты настоящего изобретения включают способ лечения или профилактики инфекций вируса гепатита B у хозяина, например, млекопитающего, такого как человек, который предусматривает введение хозяину терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его физиологически функционального производного.

"Физиологически функциональное производное" означает фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир или соль эфира соединения формулы I или любое другое соединение, которое после введения реципиенту, способно превращаться (прямо или непрямо) в соединения формулы I или их активный метаболит или остаток.

Предпочтительные сложные эфиры в соответствии с изобретением включают эфиры карбоновых кислот, в которых некарбонильный остаток кислотной части эфира выбирают из нормального алкила или изоалкила, например, н-пропила, трет-бутила, н-бутила, алкоксиалкила (метоксиметил), арилалкила(бензил), арилоксиалкила (феноксиметил) и арила (фенил); эфиры сульфокислот, такие как алкил- или арилсульфонил (метаносульфонил); эфиры аминокислот, например, L-валил или L-изолейцил; эфиры дикарбоновых кислот, например, гемисукцинат; 5¹-моно-, ди- или трифосфатные эфиры, причем фосфатные эфиры могут быть этерифицированы, например, C₁-C₂₀-спиртом или его реакционноспособным производным или 2,3-ди-C₆-C₂₄-ацилглицерином.

Алкильный остаток сложного эфира содержит 1 - 18 атомов углерода, предпочтительно 1 - 4 атома углерода. Арильный остаток такого сложного эфира предпочтительно представляет собой фенил, возможно замещенный галогеном, C₁-C₄-алкилом, C₁-C₄-алкокси- или нитрогруппой.

В описанных выше сложных эфирах аминогруппа цитозина может присутствовать в амидной форме, например, NHCOR, где R - C₁-C₆-алкил или арил, например, фенил, возможно замещенный галогеном, C₁-C₄-алкилом, C₁-C₄-алкокси-, нитро- или гидроксигруппой.

Примеры фармацевтически приемлемых солей в соответствии с изобретением включают соли с основаниями, например, производные соответствующих оснований, такие как щелочнометаллические (натриевые), щелочноземельные (магнитные), аммониевые или четвертичные аммониевые соли NX₄, где X - C₁-C₄-алкил. Фармацевтически приемлемые аддиционные соли с кислотами включают соли органических карбоновых кислот, например, уксусной, молочной, винной, яблочной, изэтионовой, лактобиеновой и янтарной кислот; соли сульфокислот, например, метансульфоновой, этансульфоновой, бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислоты; и соли неорганических кислот, например, соляной, серной, фосфорной и сульфаминовой кислот.

Количество соединения формулы I (далее называемого также "активный компонент") или его физиологически функционального производного, которое необходимо для достижения желаемого эффекта, зависит от многих факторов, в особенности от специфического применения, природы отдельного соединения, способа введения и состояния пациента. В общем подходащая доза составляет 3,0 - 120 мг на кг массы тела реципиента в день, предпочтительно 6 - 90 мг на кг массы тела в день и наиболее предпочтительно 15 - 60 мг на кг массы тела в день. Нужную дозу предпочтительно разбивают на 2 - 6 или больше поддоз, вводимых через соответствующие интервалы времени в течение дня. Эти поддозы можно вводить в единых дозировочных формах, например, содержащих 10 - 1500 мг, предпочтительно 20 - 1000 мг и наиболее предпочтительно 50 - 700 мг активного компонента на единую дозировочную форму.

В идеальном случае активный компонент должен быть введен для достижения пиковой концентрации в плазме активного компонента 1 - 75 мкМ, предпочтительно 2 - 50 мкМ, наиболее предпочтительно 3 - 30 мкМ. Это можно достичь, например, внутривенной инъекцией 0,1 - 5% раствора активного компонента, возможно в физиологическом растворе, или пероральным введением болюса, содержащего 1 - 100 мг/кг активного компонента. Желательный уровень в крови можно поддерживать непрерывным вливанием для обеспечения 0,01 - 5,0 мг/кг/ч или прерывными вливаниями, содержащими 0,4 - 15 мк/кг активного компонента.

В технологии производства лекарственного препарата, далее также называемого "препарат" соединения формулы I или их физиологически функциональные производные, "активный компонент", смешивают с одним или больше фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем м, возможно, другими терапевтическими средствами.

Применяют препараты, подходящие для перорального, ректального, назального, местного (включая чрезкожное, трансбукальное и подъязычное), вагинального или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное) введения. Составы обычно могут иметь единую дозировочную форму и могут быть получены любыми способами, хорошо известными в фармации. Такие способы включают стадию смешивания активного компонента с носителем, который состоит из одного или больше дополнительного компонента. В общем составы получают однородным и тщательным смешиванием активного компонента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или с теми и другими и затем, если необходимо, формованием продукта.

Препараты настоящего изобретения, подходящие для перорального введения могут иметь форму отдельных единицы, такую как капсулы, пакетики или таблетки, содержащие определенное количество активного компонента; порошки и гранулы; растворы или суспензии в водной или неводной жидкости; или жидкие эмульсии "масло в воде" или "вода в масле". Активный компонент также может быть помещен в болюс, кашку или пасту.

Таблетки делают прессованием или формованием, возможно вместе с одним или больше вспомогательными компонентом. Прессованные таблетки делают прессованием в соответствующем аппарате активного компонента в свободно-текучей форме, например, в форме порошка или гранул, возможно смешанного со связующим (повидон. желатин, гидроксипропилметилцеллюлоза), смазочным средством, инертным разбавителем, консервантом, дезинтегрантом (натрийгликолат крахмала, сшитый повидон, сшитая карбоксиметилцеллюлоза), поверхностно-активным или диспергирующим средством. Формованные таблетки делают формованием в соответствующем аппарате смеси порошковых соединений, увлажненных инертным жидким разбавителем. Таблетки можно покрыть, можно приготовить состав таким образом, чтобы обеспечить медленное или регулированное выделение активного компонента, используя, например, гидроксиметилцеллюлозу в различных пропорциях для достижения желаемого профиля освобождения активного компонента. Таблетки можно покрыть антеросолюбильной оболочкой для выделения активного компонента вне желудка.

Пероральные препараты могут включать буферные средства, предназначенные для нейтрализации желудочной кислотности. Такие буферы выбирают из различных органических или неорганических средств, таких как слабые кислоты или основания, смешанные с их сопряженными солями.

Препараты для местного введения во рту включают лепешки, содержащие активный компонент на вкусовой основе, обычно в сахарозе и акации или астрагале; пастилки, содержащие активный компонент в инертной основе, такой как желатин или глицерин, или сахароза и акация; жидкость для полоскания рта, содержащую активный компонент в подходящем жидком носителе.

Препараты для ректального введения могут быть представлены суппозиториями с подходящей основой, состоящей, например, из масла какао или салицилата.

Препараты для вагинального введения могут быть представлены пессариями, тампонами, кремами, гелями, пастами, пенами или разбрызгивающимися препаратами, содержащими вместе с активным компонентом известный носитель.

Препараты для парентерального введения включают водные и неводные изотонические стерильные инъекционные растворы, возможно содержащие антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, делающие препараты изотоническими по отношению к крови предполагаемого реципиента; водные или неводные стерильные суспензии, возможно включающие суспендирующие средства и загустители, а также липосомы или другие системы микрочастиц, нацеливающие соединения на компоненты крови одного или нескольких органов.

Препараты предполагаются в однодозовых или многодозовых сосудах, например, ампулах и пробирках, и могут храниться в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Инъекционные растворы для немедленного применения могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток, описанных ранее.

Предпочтительными препаратами являются те, которые содержат дневную дозу, дневную дозу или соответствующую часть дозы активного компонента. Следует понимать, что в дополнение к отдельно упомянутым компонентам препараты этого изобретения могут включать другие средства, имеющие отношение к типу препарата, например, пероральные препараты могут включать такие дополнительные средства, как подслащивающие средства, загустители и вкусовые вещества.

Соединения формулы I можно получать, например, по способу, описанному в EP 0382526 или по аналогичному способу.

Таким образом соединения формулы I можно получать, например: а) реакцией необязательно замещенного 5-R-цитозина, где R определен выше, с производными 1,3-оксатиолана формулы IIA , где R₁ - водород или защитный радикал для гидроксигруппы и L-уходящая группа, или б) реакцией соединений формулы IIB , где R и R₁ определены выше, с реагентом, превращающим оксогруппу в положении 4 кольца урацила в аминогруппу, любые оставшиеся защитные группы удаляют, например, кислотным или щелочным гидролизом.

В способе (а) защитные радикалы для гидроксигруппы выбирают из ацила (например, ацетила), арилацила (например, бензоила или замещенного бензоила), тритила или монометокситритила, бензила или замещенного бензила, триалкилсилила (например, диметил-трет-бутилсилила) или дифенилметилсилила. 5-R-Цитозин может быть защищен силилом, например, триметилсилилом. Такие группы можно удалять обычными способами. Уходящая группа L - это типичная в нуклеозидной химии уходящая группа, например, галоген (хлор или бром), алакоксигруппа (метокси- или этоксигруппа) или ацил (ацетил или бензолил).

Реакцию в способе (а) можно проводить в органическом растворителе, например, 1,2-дихлорэтане или ацетонитриле, в присутствии кислоты Льюиса, например, хлорида олова (IV) или триметилсилилтрифлата.

Соединения формулы IIA можно получать из защищенного 2-гидроксиацетальдегида формулы R₁OCH₂CHO (III), где R₁ определен выше, как описано в Can. J. Research, 8, 129 (1933) и EP 0382526. Реакция соединений формулы III с известным (Chem. Ber 85, 924 - 932 (1952)) меркаптоацеталем HSCH₂(OR)₂, где R - C₁-C₄-алкил, например, HSCH₂CH(OC₂H₅)₂, приводит к соединениям формулы IIA, где L-группа OP, например, метокси- или этокси-группа. Альтернативно, соединения формулы IIA, где L-алкоксигруппа. можно превратить в соединения формулы IIA, где L-галоген или ацил, известными методами химии углеводов. Соединения формулы III можно получать из 1,2-O-изопропилиденглицерина введением R₁, например, тризамещенного силила, бензила или тритила, и удалением изопропилидена мягкой кислотой, например, водными муравьиной или уксусной кислотами, или бромидом цинка в ацетонитриле с последующим окислением спиртовой группы водным периодатом.

В способе (б) соединения формулы IIB преимущественно обрабатывают 1,2,4-триазолом вместе с 4-хлорфенилдихлорфосфатом. Образующееся 4-(1,2,4-триазолил)-ьное производное превращают в 4-аминоцитидии по реакции с, например, метанолом. Исходные соединения формулы IIB получают, например, реакцией соответствующего (возможно защищенного) основания с соединениями формулы IIA, способом аналогичным описанному в способе (а).

Разделение (±)-цис и (±)-транс-изомеров, например, в защищенной форме, может быть выполнено хроматографически на силикагеле смесью органических растворителей, таких как этилацетат/метанол, этилацетат/гексан или дихлорметан/метанол. Любые защитные группы затем можно удалить, используя соответствующий реагент для каждой группы.

Расщепление (±)-энантиомеров может быть выполнено ферментативным способом с применением эстеразы, такой как эстераза печени свиньи (Сигма Кемикал Ко, Сент Луис, МО 63178), причем один энантиомер 5¹-ацилпроизводного соединения формулы I диэтерифицируется. После разделения оставшееся этерифицированное соединение формулы I может быть подвергнуто реакции в основных условиях, например. NH₃ в метаноле или NaOMe в метаноле, с получением индивидуальных (+)- и (-)-энантиомеров. Альтернативно, (±)-цис или (±)-транс-изомеры соединений формулы I можно ввести в реакцию с фосфорилирующим реагентом, например, оксихлоридом фосфора, в инертном растворителе, таком как триэтилфосфат, ацетонитрил или 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1H)-пиримидинон с образованием 5¹-монофосфатного производного или его соли. Обработка 5¹-монофосфатного производного ферментом, таким как 5¹-нуклеотидаза яда змеи, приводит предпочтительно к гидролизу одного из энантиомеров. Отделение и последующее дефосфорилирование другого 5¹-монофосфатного энантиомера приводит к индивидуальным (+)- или (-)-энантиомерам соединений формулы I. Соединения формулы I можно превратить в фармацевтически приемлемые эфиры реакцией с соответствующим этерифицирующим реагентом, например, ацилгалогенидом или ангидридом. Соединения формулы I можно превратить в фармацевтически приемлемые соли обычным способом, например, в результате обработки основанием. Эфиры и соли соединений формулы I можно превратить в исходное соединение, например, гидролизом.

Для лучшего понимания изобретения приведены следующие примеры.

Пример. 1-(2-Гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)цитозин.

Способ А: (±)-цис и (±) -транс-2-бензоилоксиметил-5-(N₄-этилцитозин-1-ил)- 1,3-оксатиолан получают и разделяют на (±)-цис- и (±)-транс-изомеры как описано в EP 0382526. N₄-ацетил и 2-бензоил удаляют диметиламином в этаноле и продукт, (±)-цис-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)цитозин, выделяют.

Способ Б: (±)-цис- и (±)-транс-2- бензоилоксиметил-5-(урацил-1-ил)-1,3-оксатиолан и получают как описано в EP 0382526. После удаления защиты 2-гидроксигруппы насыщенным раствором аммиака в метаноле изомеры разделяют на силиканеле с применением смеси этилацетат/метанол в качестве элюента (EP 0382526). (±)-цис-Изомер вводят в реакцию с уксусным ангидридом в пиридине при комнатной температуре с образованием 2-ацетата. Растворитель удаляют в вакууме при <30C. 2-Ацетат затем растворяют в CHCl₃ и промывают водным бикарбонатом натрия. Отделенный органический слой высушивают и CHCl₃ выпаривают в вакууме. Превращение урацильного основания в цитозиновое основание выполняют через стадию получения 4-(1,2,4-триазол-1-ил)льного производного по методу К.В.Риса, J. Chem. Soc. Perkinsl, 1171 (1984) и В.Л.Санга, Nucleic Acids Res 9, 6139 (1981), используя 1,2,4-триазол и 2 эквивалента 4-хлорфенилдихлорфосфата в сухом пиридине при комнатной температуре. 2-Ацетат гидролизуют насыщенным раствором аммиака в метаноле при 0^oC и получают (±)-цис-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)цитозин.

Пример 2. 1-(2-Гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-5-метил-цитозин.

(±)-цис и (±)-транс-2-бензоилоксиметил-5-(тимин- N-ил)-1,3-оксатиолан получают и разделяют на (±)-цис- и (±)-транс-изомеры как описано в EP 0382526. (+)-цис-изомер вводят в реакцию в уксусным ангидридом в пиридине при комнатной температуре с образованием 2-ацетата. Растворитель удаляют в вакууме при <30C. 2-Ацетат растворяют в CHCl₃, промывают водным бикарбонатом, отделенный органический слой сушат в CHCl₃ удаляют в вакууме. Превращение тиминового основания в 5-метилцитозиновое основание выполняют через стадию получения 4-(1,2,4-триазол-1-ил)ьного производного по методу К.В.Риса и В.Л.Санга (см. ссылки в предыдущей методике), используя 1,2,4-триазол и 2 эквивалента 4-хлорфенилдихлорфосфата в сухом пиридине при комнатной температуре. Гидролиз 2-ацетата выполняют насыщенным раствором аммиака в метаноле при 0^oC и получают (±)-цис-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-5-метилцитозин.

Фармацевтические препараты.

В последующих примерах препаратов "активный компонент" - это 1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-цитозин.

Пример 3. Таблетированные препараты.

Следующие препараты A, B и C получают мокрым гранулированием компонентов с раствором повидона, последующим добавлением стеарата магния и прессованием (см. табл. 1).

Следующие препараты D и E получают прямым прессованием смеси компонентов. Лактоза в препарате E - это лактоза типа прямого прессования (Дэйри Крэст - "Зепарокс").

Препарат D - мг/таблетка Активный компонент - 250
Предварительно желатинизированный крахмал - 150
Всего - 400
Препарат E - мг/таблетка
Активный компонент - 250
Лактоза - 150
Ависель - 100
Всего - 500
Препарат F (Препарат с контролированным выделением активного компонента).

Препарат получают мокрым гранулированием компонентов (ниже) с раствором повидона, последующим добавлением стеарата магния и прессованием.

Препарат F - мг/таблетка
(a) Активный компонент - 500
(b) Гидроксипропилметилцеллюлоза - 112
(c) Лактоза - 53
(d) Повидон - 28
(e) Стеарат магния - 7
Всего - 700
Выделение активного компонента происходит в течение 6 - 8 ч и завершается после 12 ч.

Пример 4. Капсулированные препараты.

Препарат A
Капсулированный препарат получают смешиванием компонентов препарата D в примере 3 и заполнением смесью твердой желатиновой капсулы из двух частей. Препарат B получают подобным образом.

Препарат B - мг/капсула
(a) Активный компонент - 250
(b) Лактоза - 143
(c) Натрий крахмалгликолат - 25
(d) Стеарат магния - 2
Всего - 420
Препарат C - мг/капсула
(a) Активный компонент - 250
(b) Макрогол 4000 - 350 - 600
Препарат - мг/капсула
Активный компонент - 250
Лецитин - 100
Арахисовое масло - 100
Всего - 450
Капсулы препарата D получают диспергированием активного компонента в лецитине и арахисовом масле и заполнением дисперсией мягких, эластичных желатиновых капсул.

Препарат E (капсулы с контролированным выделением активного компонента).

Следующие капсулированные препараты с контролированным выделением активного компонента получают экструдированием компонентов a, b и c, последующей сфероидазацией экструдата и сушкой. Высушенные гранулы покрывают мембраной d, регулирующей выделение активного компонента, и помещают в твердые желатиновые капсулы из двух частей.

Препарат Е - мг/капсула
(a) Активный компонент - 250
(b) Микрокристаллическая целлюлоза - 125
(c) Лактоза - 125
(d) Этилцеллюлоза - 13
Всего - 513
Пример 5. Инъекционные препараты.

Препарат A
Активный компонент - 0,200 г
Раствор хлористоводородной кислоты - 0,1 М
Раствор гидроксида натрия 0,1 М - Сколько понадобится до pH 4,0 - 7,0
Стерильная вода - сколько понадобится до 10 мл
Активный компонент растворяют в воде (35 - 40^oC) и устанавливают pH 4,0 - 7,0 соляной кислотой или гидроксидом натрия. Раствор разбавляют водой и фильтруют через стерильный микропористый фильтр в 10 мл стеклянный сосуд (тип 1) и закрывают стерильной пробкой и дополнительным запирающим устройством.

Препарат B
Активный компонент - 0,125
Стерильный, апирогенный фосфатный буфер с pH 7 - Сколько понадобится до 25 мл
Пример 6
Внутримышечная инъекция
Активный компонент - 0,25 г
Бензиловый спирт - 0,10 г
Гликофурол 75 - 1,45 г
Бензиловый спирт - Сколько понадобится до 3,00 мл
Активный компонент растворяют в гликофуроле. Добавляют бензиловый спирт, затем воду до 3 мл. Смесь затем фильтруют через стерильный микропористый фильтр и закрывают в стерильных 3 мл стеклянных сосудах (тип 1).

Пример 7. Сироп.

Активный компонент - 0,25 г
Раствор сорбита - 1,50 г
Глицерин - 2,00 г
Бензоат натрия - 0,005 г
Корригент, Персин 17.42.316 9 - Сколько понадобится до 5,00 мл
Активный компонент растворяют в смеси глицерина и очищенной воды. К раствору добавляют бензоат натрия, затем раствор сорбита и наконец вкусовое вещество. Добавляют очищающую воду и хорошо перемешивают.

Пример 8
Суппозиторий - мг/суппозиторий
Активный компонент - 250
Твердые жиры (Вайтэпсол Н 15-Динамит Нобель) - 1770
Всего - 2020
Одну пятую часть Вайтэпсола Н15 расплавляют в обогреваемом паром чане при ≅ 45^o. Активный компонент просеивают через сито 200 меш и добавляют к расплавленной основе при перемешивании до достижения однородной дисперсии. Поддерживая температуру 45^oC, к суспензии добавляют оставшийся Вайтэпсол Н15 и перемешивают до получения гомогенной смеси. Всю суспензию пропускают через сито 250 меш из нержавеющей стали, и, при непрерывном перемешивании, дают охладиться до 40^oC. При температуре 38 - 40^oC 2,02 г смеси заливают в 2 мл пластмассовые формы и дают суппозиториям охладиться до комнатной температуры.

Пример 9
Пессарии - мг/пессарий
Активный компонент - 250
Безводная декстроза - 380
Картофельный крахмал - 363
Стеарат магния - 7
Всего - 1000
Пример 10. Антивирусная активность против вируса гепатита B (ВГВ).

Соединения 1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-цитозин и 1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-5-метилцитозин испытывались как описано ниже.

Клеточная линия HepG₂ 2.2.15, проводящая ВГВ человека, описанная и охарактеризованная Селом и др. , PNAS 84, 1005 (1987) и J. Virol 62, 2836 (1988), как было показано, обладает многими характеристиками гепатоцита, хронически инфецированного ВГВ.

Эта клеточная линия была использована in vitro для обнаружения соединений с анти-ВГВ активностью.

При испытании соединений на антивирусную активность монослойные культуры обрабатывали соединением с концентрацией 50 - 200 мкМ в течение 10 дней. Надосадочную среду, содержащую внеклеточный вирион ДНК (частицы Дэйна), собирали на третий, шестой и десятый дни, обрабатывали протеиназом K (1 мг/мл) и додецилсульфатом натрия (1%) и культивировали при 50^oC 1 ч. ДНК экстрагировали равными объемами фенола, затем хлороформом и осаждали ацетатом аммония и пропанолом. Осадок ДНК растворяли и собирали на нитроцеллюлозе по способу Шляйхера и Шуэля (S & S, 10 Optical Ave., Keene, NH 03431, Публикация N 700, 1987), затем обрабатывали как описано Саузерном, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975). Клетки собирали и получали внутриклеточную ДНК после лизиса клеток гуанидизотиоциатом. Внутриклеточную ДНК обрабатывали также как и внеклеточную ДНК. После осаждения ацетатом аммония и пропанолом, осадок внутриклеточной ДНК растворяли, разрезали рестрикционной эндонуклеазой Hind III, наносили на гель агарозы и затем обрабатывали как описано Саузерном для определения количества репликационных промежуточных форм. Антивирусный эффект соединения определяли, регистрируя по меньшей мере 100-кратное уменьшение количества частиц Дэйна, вытесненных в культуральную среду, и подобное же уменьшение внутриклеточных репликационных интермедиатов.

Результаты приведены в табл. 2.

Влияние 1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)цитозина (соединение A) и 1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил) 5-метилцитозина (соединение B) на выработку ВГВ в клеточных культурах 2.2.15
Исследование действия (-)-цис-1-(2-(2-гидроксиметил)-1,3-оксатиолан-5-ил цитозина (ламивудина) против хронического гепатита B
В двойном-слепом испытании рандомизировали 32 пациента с хроническим гепатитом B для получения ими оральных доз в 25, 100 или 300 мг в день в течение 12 недель и наблюдения в течение следующих 24 недель для оценки отдаленных последствий. Подходящие для проведения испытания пациенты должны иметь поверхностный антиген гепатита B (HBsAg) в сыворотке в течение > 6 месяцев, HBV DNA 10 пг/мл (Abbot assay), антиген вируса гепатита B (HBeAg) в течение > 3 мес и ALT <300 ед/д; 17 пациентов (53%) в прошлом не реагировали на интерферон (IFN), а 15 - никогда ранее не подвергались противовирусному лечению (см. табл. 3)
У всех пациентом HBV DNA снижался (включая пациентов с HBV DNA 200 пг/мл или с нормальной ALT) и становился невыявляемым в соотношениях, указанных в таблице. После прекращения лечения HBV DNA обнаруживали снова у большинства пациентов, однако у 5 из 32 (16%) возврата к HBV DNA не наблюдалось (ALT возвращалась к норме у всех пациентов), а 3 из 32 (9%) теряли HBe Ag, включая 2 пациентов, устойчивых к интерферону. Более чем 2-кратное повышение ALT встречалось (в период уменьшения HBV DNA у 8 из 11) у 50%, 36% и 18% пациентов, которые получали соответственно по 25, 100 и 300 мг. Были выявлены только незначительные, но не серьезные, независящие от доз, неспецифичные отрицательные результаты. У одного пациента из группы, получавшей по 25 мг, наблюдалось увеличение ALT от 198 при базовом значении до 548 на 4 неделе и повышение амилазы от 71 до 156 на 10 неделе. На 6 неделе лечение прекращали; биопсия печени показала стеатоз, неотличимый от стеатоза, который был обнаружен при биопсии до лечения. Не обнаружено молочного ацилоза и анионных разрывов. Временные, бессимптомные повышения амилазы наблюдались у 2 пациентов, а повышения СРК встречалось у 4 пациентов во время лечения и у 2 после лечения. Был сделан вывод, что 3-месячное лечение ламивудином является хорошо переносимым, а при дозах ≥ 100 мг/день дает 100%-ное подавление HBV DNA включая пациентов, устойчивых к интерферону. Даже при отсутствии известных иммуномодуляторных эффектов, повышение A T, обусловленное лечением, встречалось у трети пациентов. Благодаря своей толерантности и наличия доказанных эффектов у части пациентов, которых лечили в течение 3 мес, Ламивудин заслуживает проведения 3-го этапа испытаний на большем контингенте в течение более 3 мес.

Формула изобретения

1. Способ лечения вирусной инфекции гепатита В у человека, включающий введение противовирусного средства, отличающийся тем, что используют соединение формулы I

где R атом водорода или С₁ С₃-алкильная группа,
или его физиологически приемлемое производное в дозе 3 120 мг/кг тела в день.

2. Способ лечения вирусной инфекции гепатита В, включающий введение противовирусного средства в форме стандартной дозы, отличающийся тем, что используют соединение формулы I

где R атом водорода или С₁ С₃-алкильная группа,
или его физиологически приемлемое производное в дозе 3 120 мг/кг в день в виде стандартной дозы, составляющей 10 1500 мг.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанная стандартная доза содержит соединение формулы I или его физиологически приемлемое производное в количестве 50 700 мг.

4. Способ по любому из пп.1 3, отличающийся тем, что соединением формулы I является 1-(2-гидроксиметил)-1,3-оксатиолан-5-ил-цитозин.

5. Способ по любому из пп.1 3, отличающийся тем, что соединение формулы I представлено в форме (-)-цисизомера.

РИСУНКИ

Рисунок 1