Способ оценки морфофункциональной сохранности клеток биологического материала

 

Изобретение относится к медицине, в частности к физическому анализу биологических материалов, и может быть использовано в судебно-медицинской экспертизе, медицинской диагностике, бактериологических исследованиях, при определении сохранности пищевых продуктов. Способ обеспечивает упрощение исследования и расширение объема информации о состоянии клеточной структуры материала. Воздействуют на биологический материал в одинаковых условиях переменным электрическим током с частотами 1, 10, 200 кГц с последующей оценкой сохранности клеток по их относительной проводимости и/или относительной разности проводимости материала с учетом всех частот воздействия. 2 ил.

Изобретение относится к физическому анализу биологических материалов и может быть использовано в судебной медицине, медицинской диагностике, бактериологических исследованиях, при определении сохранности пищевых продуктов.

Заявленный способ основан на результатах изучения электрических свойств биологических тканей с помощью метода импедансной плетизмографии. Отличие сопротивлений тканей, находящихся в разном морфофункциональном состоянии, внешнему источнику тока определенной частоты позволяет оценить состояние клеточного и межклеточного компонентов, степень выраженности отека и набухания органов и тканей, объем и локализацию патологического процесса. При использовании этого метода электрическую цепь внешнего источника тока образуют ткани, состоящие из клеток, межклеточного вещества и волокон, представляющих в совокупности коллоидную систему. Электрический раздражитель, одной из основных характеристик которого является частота тока, вызывает универсальную ответную реакцию. Для низкочастотного тока клетки являются изолятором и электропроводность осуществляется через межклеточную жидкость. С увеличением частоты электрического тока клетка приобретает свойство конденсатора, т.е. происходит ее частичное включение в электрическую цепь и чрезклеточное прохождение тока (Семченко В.В., Корпачев В.Г., Белобородова Е.А. // Анест. и реан. - 1980. - N 1. - С. 57-61; Сергиенко T.M. //Вопр. нейрохирург. - 1989. - N 3. - С. 47-49).

При переходе клеток из функционально активного состояния через стадию некробиотических изменений к аутолизу за определенный период времени одними из первых подвергаются патологическим изменениям клеточные мембраны (Пиголкин Ю.И., Володин С.А. //Суд.-мед. эксперт. -1995. - N 1. - С.3-6).

В медицине и судебно-медицинской экспертизе известны практические применения анализа электрофизических свойств тканей макроорганизма.

Известен способ определения жизнеспособности кишки, по которому в условиях переменного тока низкой частоты жизнеспособность оценивают по относительному изменению удельной электропроводности нормального и патологического участков кишки (авт.св. СССР N 1412740, А 61 В 10/00, 30.07.88, Бюл. N 28).

Однако при таком способе не учитывается степень аутолиза и возможность обратимости некробиотических процессов на уровне клеток и межуточного вещества.

Известен способ определения жизнеспособности биологических тканей, по которому с помощью электродов создают электрическое поле постоянного тока 4,5 В и по величине электропроводности ткани от 21 до 30 мкА определяют ее жизнеспособность (авт. св. N 942693, А 61 В 10/00, G 01 N 33/48, 15.07.82, Бюл. N 26).

Способ практически применялся в диагностике жизнеспособности биологических тканей при остром нарушении артериального кровообращения конечностей при принятии решения о целесообразности ампутации. В данном случае регистрируется либо полный некроз тканей, либо относительная ее жизнеспособность без учета морфологической структуры клеточного состава в динамике, что зачастую приводит к повторным операциям.

Известен способ установления давности механической травмы по параметрам электропроводности скелетных мышц (Пашинян Г.А., Саакян Е.С. //Суд.-мед. эксперт. - 1993. - N 4. - С.3-5). Использовалось специальное устройство, состоящее из двучастотного генератора синусоидального напряжения и фазоизбирательной системы для выделения активного и реактивного сопротивления биологических тканей. Измерения электропроводности производили с периодичностью 6, 12, 24, 48, 72 ч. После наступления смерти на поврежденных и интактных участках мышечной ткани. Установлено, что активное сопротивление мышечной ткани на низкой частоте сразу в первые часы практически не отличалось от показателей интактной мышцы, в дальнейшем показатель снижался, но до 12 ч посттравматического периода показатель имел большой разброс и носил статистически недостоверный характер. Более выраженная динамика была выявлена при исследовании показателя активного сопротивления на высокой частоте, а также реактивного сопротивления как на низкой, так и на высокой частоте. Наиболее стабильные результаты были получены при исследовании коэффициента частотной дисперсии, определяемого отношением произведения активного и реактивного сопротивления при низкой частоте к произведению активного и реактивного сопротивления мышечной ткани при высокой частоте. Способ позволяет реально устанавливать давность механических повреждений при жизни до 72 часов после наступления смерти. Способ требует специального оборудования.

Наиболее близким к заявляемому является способ оценки жизнеспособности клеток биологического материала в динамике для определения давности наступления смерти (авт.св. N 1099955, А 61 В 10/00, 30.06.84, Бюл. N 24). Способ включает последовательное воздействие в одинаковых условиях на мышечную ткань переменным током низкой частоты 10 кГц и высокой частоты 8000 кГц с последующей оценкой жизнеспособности клеток по отношению полной проводимости ткани на высокой и низкой частоте.

Преимущества способов, одномоментно учитывающих реакцию клеток на токи низкой и высокой частоты, заключаются в использовании математической модели аппроксимации показателей морфологической структуры и жизнеспособности клеток.

Однако используемая система показателей недостаточно информативна, так как учитывается сопротивление клеток, находящихся в состоянии лизиса, и не дифференцируется наличие клеток с целостной мембраной и клеток в состоянии различных фаз некробиоза.

В связи с этим в способе прототипа введена дополнительная аппроксимация по характеру травмы и температуре окружающей среды.

Морфофункциональная сохранность клеток макроорганизма зависит от многих факторов: возраст, иммунное состояние организма, расположение тканей и др.

Кроме того, недостаточно учтено, что электрическое сопротивление органов и тканей имеет резистивно-емкостную природу. При воздействии переменного тока на биологическую ткань с частотой свыше 1000 кГц практически исключается влияние емкостного сопротивления (Nyboer J. Electrical impedance plethysmography. Springfield, 1959, 164 с.). Отсутствие при проведении вычислений дифференцированного подхода к преобладанию емкостной либо омической составляющей полного сопротивления делает предложенную модель несовершенной.

Целью изобретения является упрощение способа раздельной импедансометрии и расширение объема информации о состоянии клеточной структуры материала за счет использования математической модели его электрофизиологических свойств на всех стадиях аутолиза. Поставленная цель достигается тем, что способ оценки морфофункциональной сохранности клеток биологического материала включает последовательное воздействие на него в одинаковых условиях переменным электрическим током с частотами 1, 10, 200 кГц с последующей оценкой сохранности клеток по их относительной проводимости и/или относительной разности проводимости материала с учетом всех частот воздействия.

Отличительными признаками заявляемого способа является дополнительное воздействие на биологический материал переменным током 1 кГц и использование в качестве высокочастотного воздействия 200 кГц и оценка сохранности клеток по относительной разнице проводимостей с учетом всех частот воздействия.

Известно, что при накожном расположении электродов на частотах до 500 кГц сопротивление тканей определяется преимущественно омической составляющей импеданса (Науменко А.И., Скотников В.В. Основы электроплетизмографии. - М.: Медицина, 1975. - 215 с.). Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что наиболее оптимальными сравнимыми частотами тока являются 1, 10 и 200 кГц. Принципы отбора указанных параметров основываются на фактах, что при частоте 1 кГц ток проводится только в межклеточном пространстве, тогда как мембраны неповрежденных клеток и клеток в состоянии некробиоза продолжают оставаться изоляторами. При частоте 10 кГц ток проводится в межклеточном веществе, чрез клетки с поврежденным белково-липидным слоем мембран, а также через клетки с выраженными нарушениями трансмембранного обмена. Клетки, находящиеся в начальной стадии дистрофии и характеризующиеся относительной стабильностью клеточной мембраны, остаются изоляторами. И только ток частотой 200 кГц проводится через все составляющие межэлектродного пространства.

Таким образом, разница показателей сопротивления материала при частоте переменного тока 1 кГц и 10 Гц (R1-R2) соответствует сопротивлению некробиотически измененных клеток, а разница показателей сопротивлений при токе 10 кГц и 200 кГц (R2-R3) - соответственно клеток с неизмененной мембраной. Применяя различные показатели соотношений получаемых разниц в сопротивлении биологического материала заданным частотам переменного электрического тока, можно с большой убедительностью судить о скорости и направленности аутолитических процессов. В частности, взаимоотношения показателей процесса аутолиза могут быть выражены следующим образом: R1/R3 - отношение сопротивления всех клеточных форм к сопротивлению межуточного вещества; R1-R2/R3 - отношение сопротивления клеток, находящихся в состоянии рексиса и лизиса (с нарушением цитологической целостности клеточных мембран) к сопротивлению межуточного вещества; R2-R3/R3 - отношение сопротивления клеток с неизмененной мембраной к сопротивлению межуточного вещества; R1-R2/R2-R3 - отношение сопротивления клеток, находящихся в состоянии рексиса и лизиса (с нарушениями цитологической целостности клеточных мембран) к сопротивлению клеток с неизмененной мембраной.

Закономерность изменений относительных сопротивлений клеточных структур при воздействии на них переменным током с частотой 1, 10, 200 кГц экспериментально исследовали при определении давности наступления смерти, а также определении жизнеспособности бактериальных культур.

Пример 1. Экспериментальные исследования проводили на трупах с достоверно установленным временем и причиной смерти. Наблюдали 126 трупов в возрасте от 20 до 45 лет. У 75 причиной смерти явилась тяжелая черепно-мозговая травма, у 51 - тяжелая сочетанная травма с поражением внутренних органов. Часть трупов наблюдали при 4^oC, остальные - при 18^oC. Проводили накожное исследование электрическим переменным током с частотами 1, 10, 200 кГц в трех позициях: путем наложения электродов на среднюю фалангу 5 пальца кисти правой и левой руки, на правую и левую ушные раковины, правую и левую височные области. Манипуляцию по воздействию током и измерение сопротивлений тканей проводили через каждые 0,5 час в течение 72 часов с помощью прибора ВУ В7-21, включенного в цепь генератора ГИ-153. По усредненным параметрам составляли информационные таблицы абсолютных показателей и вычисленных на их базе относительных показателей. Сопоставление показателей каждого экспериментального случая с усредненными контрольными показателями проводили с использованием программы Microsoft Excel 7.0.

Результаты анализа показали достаточно достоверное совпадение абсолютных показателей электрофизиологической активности тканей во всех трех позициях.

Более достоверная информация была получена при сопоставлении относительных показателей R1-R2/R2-R3.

На фиг. 1 представлена динамика изменений этого относительного показателя во всех трех позициях. Волнообразный характер аутолитического процесса свидетельствует о том, что постмортальные процессы в организме не сводятся только к разрушению клеточных структур, а имеют более глубокие механизмы. Клетки последовательно проходят этапы от функциональной активности через стабилизацию к дистрофии и некробиотическому разрушению.

Пример 2. В помещении морга при 18^oC труп мужчины, погибшего в результате автомобильной катастрофы, исследовали аналогично эксперименту, описанному в примере 1. 10 замеров сопротивлений тканей проводили в течение 4,5 часов. Затем по сопоставлению относительных показателей R1-R2/R2-R3 с данными информационных таблиц определили давность наступления смерти, равную 10 часам. Этот показатель совпал с записью врача "Скорой помощи".

Пример 3. Из свежевыращенной бакмассы референтного штамма Е. Coli К 12 готовили суспензию в физрастворе с плотностью 10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. С помощью электродов воздействовали на культуру переменным током с частотой 1, 10, 200 кГц и замеряли сопротивление суспензии через каждые 24 часа в течение 144 часов. В той же периодичности проводили высев на питательный агар Хоттингера, культивировали при 37^oC с последующим через 24 часа учетом образования колоний.

Жизнеспособность клеток по образованию колоний сопоставляли с относительными показателями электрофизиологической активности клеток R1/R2 и R1/R3. На фиг. 2 представлена динамика изменений относительных показателей проводимости биологического материала, где кривая 1 - изменение R1/R3, кривая 2 - количество образовывавшихся колоний в различные сроки наблюдения, кривая 3 - R1/R2.

Таким образом, экспериментальные исследования подтверждают зависимость электрофизической активности клеток биологического материала от их относительной проводимости при воздействии током переменной частоты. Использование заявляемого способа возможно и в диагностике состояния тканей макроорганизма, оценке сохранности пищевых продуктов.

Формула изобретения

Способ оценки морфофункциональной сохранности клеток биологического материала, включающий последовательное воздействие на него в одинаковых условиях переменным электрическим током низкой, 10 кГц и высокой частот и последующую оценку сохранности клеток по относительной проводимости материала на высокой и низкой частотах, отличающийся тем, что на биологический материал дополнительно воздействуют током 1 кГц, высокочастотное воздействие осуществляют при 200 кГц, а оценку сохранности клеток дополнительно проводят по относительной разнице проводимостей с учетом всех частот воздействия.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2