Способ получения средства для диагностики целиакии

 

Изобретение может использоваться в медицине, клинической иммунологии. Получают глютен путем гидролиза белков пшеничной муки водой. Отстаивают 10 мин. Надосадочную жидкость инактивируют при 53^oС до получения сухого порошка. Экстрагируют его 70%-ным раствором этилового спирта. Раствор центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин. Инактивируют надосадочную жидкость при 53^oС до получения сухого порошка, содержащего глиадин. Изобретение позволяет удешевить процесс диагностики.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и касается способа получения средства, которое используется в нагрузочных иммунологических тестах для диагностики целиакии.

В доступной патентной и медицинской литературе не описан способ получения средства для диагностики целиакии.

Известен способ диагностики целиакии с помощью иммуноферментного анализа на основе Швейцарских тест-систем на выявление антител (в венозной крови) к глиадину (Ю. Г. Мухина, С.В. Бельмер, Т.В. Гасилина и др. Определение антиглиадиновых антител при целиакии у детей //Педиатрия. - 5. -1995. - С.9-12).

Недостатки: способ дорогостоящий, многоэтапный, требует специального оборудования (мультискан).

Изобретение направлено на решение задачи: упрощение, удешевление диагностики целиакии путем создания средства для этой цели.

Указанная задача достигается путем экстрагирования глютена, полученного путем гидролиза белков клейковины пшеницы, 70%-ным раствором этилового спирта, центрифугирования полученного раствора в течение 10 мин при 1000 об. /мин, инактивации надосадочной жидкости при 53^oС до получения сухого кристаллического порошка, содержащего глиадин. Полученный глиадин используют в концентрации 0,5 мкг/мл в иммунологических нагрузочных тестах для диагностики целиакии и при угнетении Т-клеточного звена иммунитета и фагоцитарной функции лейкоцитов определяют данное заболевание.

Способ осуществляют следующим образом.

Рассчитанное количество пшеничной муки соединяют с дистиллированной водой, перемешивают и отстаивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем надосадочную жидкость, свободную от балластных веществ, разливают в чашки Петри и инактивируют при 53^oС до получения сухого вещества, которое содержит глютен, экстрагируют его 70%-ным раствором этилового спирта, полученный раствор центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин. Полученную надосадочную жидкость разливают в чашки Петри, инактивируют при 53^oС до получения сухого кристаллического бесцветного порошка, содержащего глиадин. Глиадин используют в концентрации 0,5 мкг/мл в иммунологических нагрузочных тестах: тотального Е-розеткообразования, в реакциях определения фагоцитарной функции лейкоцитов.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. 90,0 г пшеничной муки высшего сорта помещают в емкость, заливают 500 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и отстаивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Надосадочную жидкость разливают в 5 чашек Петри, инактивируют при 53^oС до получения сухого вещества, содержащего плотен (белок клейковины пшеницы). Полученное вещество экстрагируют 96 мл 70%-ным этиловым спиртом, раствор центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об. /мин. Надосадочную жидкость разливают в 5 чашек Петри и инактивируют при 53^oС до получения 485 мг сухого бесцветного кристаллического порошка, содержащего глиадин. Глиадин в концентрации 0,5 мкг/мл используют в нагрузочных иммунологических тестах. Рабочую концентрацию глиадина 0,5 мкг/мл получают следующим образом. 3,0 мг сухого кристаллического глиадина разводят 3 мл буфера рН 7,2 до полного растворения. 0,5 мл полученного раствора разводят 4,5 мл буфера (рН 7,2). Готовую рабочую концентрацию глиадина 0,5 мкг/мл в объеме 0,05 мкл используют в иммунологических нагрузочных тестах: тотального Е-розеткообразования и реакциях фагоцитоза с гепаринизированной венозной кровью больных целиакией.

Клинические примеры использования полученного средства глиадина в иммунологических нагрузочных тестах.

Пример 1. Больная Б., 4 года.

Жалобы на отсутствие прибавок в массе тела в течение 2 лет, разжиженный стул со зловонным запахом до 4 раз в сутки, плохо смывающийся с горшка, вздутие живота, пониженный аппетит.

Объективно: бледность кожных покровов, хейлит, рахитические изменения грудной клетки, гипотония мышц брюшного пресса, истончение подкожно-жирового слоя, дефицит массы тела 15%, вздутие живота.

В реакциях тотального Е-розеткообразования, реакциях фагоцитоза без применения нагрузки глиадином составило: относительное количество Т-лимфоцитов -44 (на 100 клеток); абсолютное количество Т-лимфоцитов -2018 клеток (2,0•10³ мкл); процент фагоцитоза -71%.

После применения нагрузки глиадином с целью диагностики: относительное количество Т-лимфоцитов -30 (на 100 клеток); абсолютное количество Т-лимфоцитов 1376 клеток (1,37•10³ мкл); процент фагоцитоза -53%.

При проведении нагрузочных иммунологических тестов с глиадином выявлено достоверно значимое угнетение со стороны Т-лимфоцитов и процента фагоцитоза. Учитывая полученные данные, больной выставлен диагноз: Целиакия, типичная форма, средней степени тяжести.

Пример 2. Больная Б., 8 лет.

Жалобы на отсутствие прибавок в массе, росте, сниженный аппетит, периодически неустойчивый стул.

Объективно: задержка физического развития с дефицитом массы II степени. Признаки полигипоавитаминоза (хейлит, глоссит, расслоение ногтей), множественный кариес зубов.

В реакциях тотального Е-розеткообразования, реакциях фагоцитоза без применения нагрузки глиадином составило: относительное количество Т-лимфоцитов -59 (на 100 клеток); абсолютное количество Т-лимфоцитов -2303 клеток (2,3•10³ мкл); процент фагоцитоза -50%.

После применения нагрузки глиадином с целью диагностики:
относительное количество Т-лимфоцитов -48 (на 100 клеток);
абсолютное количество Т-лимфоцитов -1874 клеток (1,87•10³ мкл);
процент фагоцитоза -32%.

При использовании иммунологических нагрузочных тестов с глиадином выявлено угнетение со стороны Т-клеточного звена иммунитета и снижение процента фагоцитоза. На основании полученных данных больной был выставлен диагноз: Целиакия, атипичная форма.

Таким образом, проведение нагрузочных тестов с глиадином в реакциях тотального Е-розеткообразования, фагоцитарных реакциях показало, что у больных целиакией происходит достоверное угнетение со стороны Т-лимфоцитов и фагоцитоза, что не отмечается у здоровых детей.

Пример 3. Здоровый ребенок К., 4 года.

Жалоб нет.

В реакциях тотального Е-розеткообразования, реакциях фагоцитоза без применения нагрузки глиадином составило:
относительное количество Т-лимфоцитов -38 (на 100 клеток);
абсолютное количество Т-лимфоцитов -1356 клеток (1,35•10³ мкл);
процент фагоцитоза -82%.

После применения нагрузки глиадином с целью диагностики:
относительное количество Т-лимфоцитов -39 (на 100 клеток);
абсолютное количество Т-лимфоцитов -1392 клеток (1,39•10³ мкл);
процент фагоцитоза -84%.

Диагноз: Целиакия не обнаружена.

Угнетения со стороны Т-лимфоцитов и снижение процента фагоцитоза не обнаружено.

Пример 4. Здоровый ребенок Г., 9 лет.

Жалоб не предъявляет.

В реакциях тотального Е-розеткообразования, реакциях фагоцитоза без применения нагрузки глиадином составило:
относительное количество Т-лимфоцитов -56 (на 100 клеток);
абсолютное количество Т-лимфоцитов -2311 клеток (2,3•10³ мкл);
процент фагоцитоза -75%.

После применения нагрузки глиадином с целью диагностики:
относительное количество Т-лимфоцитов -54 (на 100 клеток);
абсолютное количество Т-лимфоцитов -2229 клеток (2,2•10³ мкл);
процент фагоцитоза -81%.

Диагноз: Целиакии не обнаружено.

Угнетения со стороны Т-лимфоцитов и снижение процента фагоцитоза не выявлено.

Положительный эффект от использования предлагаемого способа состоит в удешевлении и упрощении способа диагностики целиакии при высокой достоверности. Впервые создано доступное средство для диагностики заболевания.

Формула изобретения

Способ получения средства для диагностики целиакии, отличающийся тем, что получают глютен путем гидролиза белков пшеничной муки, которую соединяют с водой, отстаивают в течение 10 мин, надосадочную жидкость инактивируют при 53^oС до получения сухого порошка, который экстрагируют 70%-ным раствором этилового спирта, полученный раствор центрифугируют 10 мин при 1000 об. /мин, повторно инактивируют надосадочную жидкость при 53^oС до получения сухого порошка, содержащего глиадин.