Противогрибковое средство "тауразид е" и способ его получения

 

Изобретение относится к фармации, а именно к созданию лекарственного средства растительного происхождения, проявляющего противогрибковое действие. Предложено средство и способ (варианты) его получения из листьев плюща Herbera. Средства, полученное предложенными способами, нетоксичны и предназначены для подавления жизнедеятельности грибов патогенных для человека. 3 с. и 7 з.п.ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к фармации, а именно к созданию лекарственного средства растительного происхождения, проявляющего противогрибковое действие.

Для лечения грибковых заболеваний применяют различные противогрибковые препараты: антибиотики, производные имидазола и триазола, производные N-метилнафталина и др. (РЛС России, 2002, вып.9).

Помимо химических средств, известны средства на основе растительного происхождения. Так для лечения микозов используются препараты, содержащие березу бородавчатую, мяту перечную, маклею сердцевидную, ромашку аптечную, чемерицу, любеля, чистотел большой и т.д. Надо отметить, что есть группа растений с противокандидозным действием: кувшинка желтая, хохлатка Лебедура и Северцева, тмин, укроп, хмель и др. (Корсун В.Ф. и др. Фитотерапия кожных болезней. Минск: Беларусь, 2001 г.).

Задачей настоящего изобретения является разработка нового нетоксичного противогрибкового средства на основе растительного компонента.

Поставленная задача решается таким образам, что предложена группа изобретений, объединенная единым изобретательским замыслом.

Предложено противогрибковое средство, представляющее собой титерпеновый гликозид формулы 3-О-α-L-рамнопиранозил (1->2)-α-L-арабинопиранозид хелерагенина, полученный из листьев плюща Неrbеrа путем экстракции 90%-ным этиловым или изопропиловым спиртом в соотношении сырье - экстрагент 1:5.

Средство предназначено для подавления жизнедеятельности грибов патогенных для человека.

Предложен способ получения противогрибкового средства, заключающийся в том, что измельченные листья плюща Herbera экстрагируют 90%-ным этиловым или изопропиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:5, экстракт упаривают, очищают от примесей путем растворения суммы гликозидов в бутаноле, насыщенном водой, затем последовательно промывают 5%-ный водным раствором аммиака и водой, упаривают, осаждают суммы гликозидов ацетоном и отделяют сумму тритерпеновых гликозидов, затем последнюю растворяют при нагревании в органическом растворителе, далее охлаждают при комнатной температуре, выдерживают до выпадения кристаллов целевого продукта, при этом сумму тритерпеновых гликозидов отделяют фильтрованием и растворение суммы третерпеновых гликозидов проводят при нагревании до кипения. В качестве органических растворителей используют этанол, бутанол или смесь хлороформа с метанолом в соотношении 5:1.

Предложенный также способ получения противогрибкового средства, заключающийся в том, что измельченные листья плюща Herbera экстрагируют 90%-ным этиловым или изопропиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:5, экстракт упаривают, очищают от примесей путем растворения суммы гликозидов в бутаноле, насыщенном водой, затем последовательно промывают 5%-ным водным раствором аммиака и водой, упаривают, осаждают сумму гликозидов ацетоном и отделяют сумму тритерпеновых гликозидов, далее ее подвергают хроматографическому фракционированию, при этом очищенную сумму гликозидов пропускают через колонку с силикагелем и элюируют смесью растворителей хдороформ-этанол в соотношении 5:1 или 10%-ным водным аммиаком, далее элюент упаривают в вакууме. Сумму тритерпеновых гликозидов отделяют фильтрованием и растворение суммы тритерпеновых гликозидов проводят при нагревании до кипения. В качестве органического растворителя используют этанол, бутанол или смесь хлороформа и метанола в соотношении 5:1.

Для достижения поставленной задачи используют листья плюща Herbera Helis, или Herbera taurica, или Herbera caucasigena, или Herbera baltica, или Herbera helix var-canariensis, или Herbera colchica, содержащие сумму тритерпеновых гликозидов:

- 3-О-α-L-арабинопиранозид хедерагенина;

- 3-О-α-L-рамнопиранозил-(1->2)-α-L-арабинопиранозид олеаноловой кислоты;

- 3-О-α-L-рамнопиранозил-(1->2)-α-L-арабинопиранозид эхиноцистовой кислоты, очищенных от фенольных соединений и индивидуального преобладающего гликозида -

- 3-О-α-L-рамнопиранозил-(1->2)-α-L-арабинопиранозид хедерагенина (Таурозида Е)

с использованием известных методов химии очистки и выделения природных гликозидов,

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример 1.

Сырье листья плюща в количестве 1 кг тщательно измельчают в гомогенизаторе и экстрагируют 5 л 90%-ного этилового или изопропилового спирта. Спиртовой экстракт упаривают досуха и получают 10 г остатка сырой суммы тритерпеновых гликозидов, содержащих значительные количества фенольных гликозидов, свободных сахаров и неорганических солей.

Смесь сырого остатка очищают от перечисленных примесей. Для этого растворяют 100 г сырой суммы гликозидов в 2 л бутанола, насыщенного водой, производят двукратную промывку бутанольного слоя 700 мл 5%-ного водного раствора аммиака, 700 мл воды упаривают до минимального объем (100 мл). Осаждение очищенной суммы гликозидов 1 л ацетона с последующим отделением 10-20 г суммы тритерпеновых гликозидов проводят фильтрованием.

Для получения обогащенной фракции таурозида Е (преобладающий тритерпеновый гликозид в очищенной сумме сапонинов) 10 г суммы гликозидов растворяют при нагревании до кипения в 70 мл этанола, бутанола или смеси хлороформ-метанол (5:1), охлаждают до комнатной температуры и выдерживают 10 часов до достижения полноты выпадения кристаллов. Их отфильтровывают и получают 2 г таурозида Е.

Для получения очищенных изолированных гликозидов (в том числе индивидуального таурозида Е), очищенную сумму гликозидов, или обогащенную фракцию таурозида Е подвергают хроматографическому фракционированию. Для этого 10 г очищенной суммы гликозидов или обогащенного таурозида Е наносят на колонку с 1 кг силикагеля и элюруют смесью растворителей хлороформ-этанол 5:1, насыщенной водой или 10%-ным водным аммиаком. Элюаты анализируют с помощью тонкослойной хроматографии и из фракций, содержащих таурозид Е путем упаривания элюента в вакууме получают 5 г чистого таурозида Е с Т.пл.235-240°С, [α] _D=+7°(с 3.2 в этаноле).

Экспериментальные данные показали, что таурозид Е не проявляет токсических свойств in vivo на мышах линии BALB/c в концентрациях 1-10 мг/кг веса животного при пероральном введении препарата на протяжении трех дней подряд.

Указанные данные были получены в результате проведения следующего эксперимента.

Мышам весом 18-20 г на протяжении трех дней подряд дважды в день с интервалом в 10 с перорально вводили водный раствор таурозида Е. Препарат вводили трем группам животных (по 6 мышей в группе) в концентрациях 1, 10 и 100 мкг препарата на мышь на введение. Объем вводимого раствора составлял по 20 мкл. В контрольной группе животным по той же схеме вводили дистиллированную воду. Через 1 ч после последнего введения животным внутрибрюшинно вводили 10¹² КОЕ E.coli К 12 в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Животных наблюдали до 21 дня. Смертность в контрольной группе составляла 16,7%. Такая же смертность наблюдалась и в опытных группах мышей, в том числе среди мышей, которым вводили максимальную из использованных доз сапонина, что расценивали как отсутствие токсического действия препарата. Введение сапонина интактным мышам, которым не вводили бактерии, не приводило к каким-либо патологическим реакциям на протяжении всего срока наблюдения.

Пример 2

Антикандидозная активность тритерпеновых сапонинов из крымского плюща in vitro.

Изучали антифунгальную активность 11 индивидуальных третерпеновых гликозидов (сапонинов), полученных из крымского плюща Herbera taurica Carr.: таурозида Е, таурозидов Н₂ и I, таурозидов Sx2, Sx3, Ax1,Ax2,Gxl-4.

Антифунгальное действие сапонинов изучали на референс-штаммах С. albicans CCM 885, С. albicans ATCC 885-663 и на культурах, выделенных у здоровых людей (ротовая полость) и больных: С. albicans - 13 штаммов, С. tropicalis - А штамма, С. krusei - 2 штамма. Клинические изоляты были получены от больных детей с диагнозами: недоношенность, гипотрофия, флегмона, поддиафрагмальный абсцесс, пневмония, энцефалит, сепсис, ангина, гастрит.

Антифунгальную активность препаратов определяли методом серийных разведений на жидкой питательной среде Сабуро с последующим посевом на твердую агаризованную среду Сабуро.

Было установлено, что в отношении штамма С. albicans №5 (выделен от здорового человека) минимальная ингибирующая (фунгицидная) концентрация (МИК) таурозида Е составила 75 мкг/мл. Для сапонинов Sx2 и Sx3 МИК была 150 мкг/мл. Для сапонинов Аx1 и Аx2, - 600-1200 мкг/мл. Для таурозидов Н2 и I, а также сапонинов Gxl-4 МИК превышала 2000 мкг/мл.

МИК таурозида Е в отношении референтных штаммов С. albicans CCM 885 и АТСС 885-663 составили соответственно 500 и 250 мкг/мл.

Далее было изучено действие таурозида Е на штаммы С. albicans, выделенные от здоровых и больных людей. МИК таурозида Е в отношении 6 изолятов С. albicans, полученных от здоровых людей, была 75-150 мкг/мл. В отношении 7 изолятов, полученных от больных, МИК таурозида Е составила соответственно: 150 мкг/мл - 3 изолята, 500 мкг/мл - 2 изолята, 1000 мкг/мл - 2 изолята.

В отношении другого вида грибов С. tropicalis МИК таурозида Е составила 150 мкг/мл для 2-х изолятов, полученных от больных, и 500 мкг/мл для двух изолятов, полученных от здоровых людей.

В отношении C. krusei, полученных от больных (2 изолята) МИК таурозида Е была 300 мкг/мл.

Было проведено сравнение чувствительности штаммов С. albicans к таурозиду Е и известным антифунгальным препаратам дифлюкан (флюконазол), низорал и клотримазол. Использовали референс-штамм С. albicans АТСС 885-663 (МИК таурозида Е 250 мкг/мл) и клинический изолят С. albicans №17 (МИК таурозида Е 150 мкг/мл). Для определения чувствительности к дифлюкану также использовали референс-штамм С. albicans CCM 885 (МИК таурозида Е 500 мкг/мл), изоляты грибов №5 (МИК таурозида Е 75 мкг/мл) и №9 (МИК таурозида Е 150 мкг/мл). К дифлюкану все 5 указанных штаммов оказались мало чувствительными во всех взятых концентрациях, включая максимальную - 1600 мкг/мл.

К низоралу грибы также оказались менее чувствительными, чем к таурозиду Е. МИК низорала для С. albicans АТСС 885-663 была 1562 мкг/мл, а для изолята №17 соответственно 12500 мкг/мл.

Чувствительности кандид к клотримазолу и таурозиду Е оказались близки. МИК клотримазола для С. albicans ATCC 885-663 была 125 мкг/мл, а для изолята.№17, - 250 мкг/мл.

Таким образом, выраженными антифунгальными свойствами in vitro обладают такие сапонины из Hedera taurica, как таурозид Е, сапонины 8x2 и 8x3, сапонины Аx1 и Аx2. Таурозид Е наиболее активен и не уступает, или превосходит по своим антифунгальным свойствам такие антимикотики, как дифлюкан (флюконазол), низорал и клотримазол.

Пример 3

Изучение влияния таурозида Е на инфекцию, вызываемую Candida albicans, на модели диссеминированного кандидоза у мышей

Использовали стандартный штамм С. albicans ATCC 885-653. Культуру грибов выращивали на твердой среде Сабуро (48 ч, 28°С). Грибы удаляли с поверхности среды стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (ИР), взвесь клеток троекратно отмывали ИР центрифугированием. Концентрацию клеток определяли по оптической плотности (ФЭК КФК-2, А, 540 нм, чувствительность-2) и высевом на среде Сабуро.

Экспериментальный кандидоз создавали у мышей линии BALB/c массой 18-20 г с помощью иммунодепрессии, вызванной введением гидрокортизона. Гормон вводили внутримышечно в дозе 100 мкг/кг в 0,1 мл раствора на мышь по схеме: за 1 сутки до заражения грибами, через 3 часа, через сутки и через двое суток после заражения. Заражение мышей кандидами проводили внутрибрюшинным введением 1 мл взвеси клеток на стерильном ИР (плотность взвеси d=0,7). На полученной модели изучали влияние таурозида Е на развитие кандидозной инфекции in vivo. Сапонин вводили перорально спаиванием через пипетку по 20 мкл на введение в концентрации 5 мг/мл 2 раза в день. Результаты учитывались по срокам гибели животных в течение 30 дней.

Использовали две группы мышей по 12 животных. В опытной группе у мышей, зараженных C. albicans, проводили терапию таурозидом Е в течение 3-х дней после введения гидрокортизона по описанной схеме. Контрольная группа заражалась С. albicans, но таурозид Е не получала. Учитывали сроки гибели животных и потерю веса в течение 30 дней после заражения.

В контрольной группе наблюдалось постепенное снижение массы тела животных до 80% первоначального веса к 9 дню эксперимента. Они начинали погибать на 6 день, 100% летальность отмечалась на 12 день.

Мыши из опытной группы, получавшие тауразид Е, до 9 дня теряли в весе так же, как и животные в контрольной группе (до 80% исходного веса). Однако начало их гибели приходилось на 14-й день. На 18-19 дни средний вес выживших животных достигал 65% их первоначального веса, после чего начинал увеличиваться, достигая 80% на 21 день и 90% исходного веса на 24 день. Такой вес сохранялся до конца эксперимента. К 20 дню эксперимента в опытной группе выжило 25% животных. Все они остались живы до конца опыта.

Таким образом, пероральное введение таурозида Е при летальном диссеминированном кандидозе задерживало начало гибели мышей на 8 дней и приводило к выживанию 25% инфицированных животных при 100% летальности в контроле. Это свидетельствует о наличии у таурозида Е протективного антикандидозного действия in vivo.

Строение таурозида Е из листьев Hedera taurica

Общеизвестна высокая физиологическая активность тритерпеновых гликозидов из растений сем. Аралиевых (Аrаliасеае) [1]. Цель настоящей серии работ - изучение сапонинов Hedera taurica (плющ крымский), единственного представителя этого семейства в Крыму.

Тритерпеновые гликозиды плюща названы в порядке возрастания их полярности таурозидами А, В, С, D, Е, F, G, Н. В данной статье описывается установление строения таурозида Е - одного из преобладающих сапонинов листьев плюща - методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С.

По результатам анализа кислотного гидролизата таурозида Е в качестве сахаров бумажной хроматографией идентифицированы рамноза и арабиноза, а в качестве агликона методом тонкослойной хроматографии - хедерагенин.

В слабопольной области ЯМР-спектра (3,0-6,5 м.д.) наблюдаются сигналы от 15 достаточно дезэкранированных протонов (табл.1). В сильнопольной области спектра на фоне метиленового возвышения (скелетные протоны хедерагенинового остатка) имеется шесть синглетных сигналов от метальных групп остатка хедерагенина и один трехпротонный дублет (1,52 м.д.) с константой спин-спинового взаимодействия (КССВ) 6,0 Гц, принадлежащий, несомненно, протонам при С-6" остатка рамнозы. Таким образом, общий вид спектра соответствует мономерному составу рамноза-арабиноза хедерагенин.

Отнесение линий в ЯМР 1H-спектре выполнено с помощью селективного гомоядерного двойного резонанса и при наблюдении ядерных эффектов Оверхаузера (ЯЭО). Два сигнала в слабопольной области спектра с 56,12 и 4,98 м.д. имеют дублетную структуру и могут принадлежать только аномерным протонам сахарных остатков, а псевдотриплетный сигнал с 55,33 м.д., очевидно, принадлежит протону при С-12 остатка хедерагенина. Эксперимент с селективным гомоядерным двойным резонансом подтверждает эти отнесения: облучение протонов с 56,12 и 4,98 м.д. в разностном спектре дает отклик в низкочастотной области спектра (подавление спин-спинового взаимодействия протонов при С-Г и С-2ʹи С-1″ и С-2″ остатков арабинозы и рамнозы), а облучение протона с 55,33 м.д. дает в разностном спектре отклик в области метиленового возвышения (развязка от протонов у С-11 хедерагенина). Из разностного спектра следует также, что протон с 53,14 м.д. имеет спин-спиновую связь только со скелетными метиленовыми протонами остатка хедерагенина, а по характеру расщепления и величинам КССВ он принадлежит протону при С-3. Аналогично сделано отнесение и сигнала с 53,61 м.д. протонам при С-23 хедерагеиинового остатка.

Последовательное применение методики двойного гомоядерного резонанса позволило определить все сигналы, относящиеся к остатку рамнозы. Характер расщепления этих сигналов и величины КССВ однозначно определяют ориентацию протонов и могут соответствовать только а- или р-рамнопиранозильному остатку.

Из второй серии сигналов, к которой принадлежит сигнал аномерного протона при 4,98 м.д., удалось определить положение и характер расщепления только протона при С-2ʹ, так как сигналы остальных протонов находятся в слаборазрешенной области спектра. При этом из больших величин КССВ Л,2 и J2,3 однозначно следует аксиальная ориентация протонов Н-Г, Н-2ʹ и Н-3ʹ, что полностью согласуется с α-арабино-конфигурацией второго сахарного остатка.

Эксперименты с использованием ЯЭО показали, что при облучении протона Н-Г арабинопиранозильного остатка положительные ЯЭО наблюдаются, кроме протона Н-2ʹ и Н-3ʹ, и для сигнала протона с 53,59 м.д. Отсюда следует, что этот сигнал должен относиться к аксиальному протону Н-5ʹа (1,3-диаксиальное взаимодействие). Тогда становится понятным и характер расщепления сигнала этого протона: большая из констант (9,0 Гц) несомненно является геминальной (Jsase), а меньшая - вицинальной (J4,5a). Малая величина J4,5a свидетельствует об аксиально-экваториальном расположении протонов Н-4ʹ и Н-5ʹа и, следовательно, об аксиальной ориентации гидроксильной группы у С-4ʹ, таким образом окончательно подтверждая принадлежность этого остатка к а-арабинопиранозе.

В разностном спектре ЯЭО при преднасыщении протона Н-1″ остатка рамнопиранозы наблюдаются сигналы протонов Н-2((усиление 6%) и Н-2 (остатка арабинозы (усиление 5%). Следовательно, протоны у С-1″ рамнозы и С-2ʹ арабинозы сближены в пространстве, что позволяет сделать однозначный вывод о последовательности соединения сахарных остатков и типе замещения в них.

Таким образом, по данным спектроскопии ПМР, углеводная часть таурозида Е представлена рамнопиранозил-(1->-2)-α-арабинопиранозой.

Большинство сигналов в слабопольной области ЯМР 13 С-спектра удалось отнести методом селективного гетероядерного двойного резонанса 13С-1Н (табл.2). Сигналы остатка хедерагенина отнесены путем сравнения со спектром хедерагенина, полученным в аналогичных условиях [2].

Поскольку в области 79-84 м.д. отсутствуют сигналы (кроме С-3 остатка хедерагенина), характерные для С-атомов сахаров в фуранорзной форме [3], то можно сделать вывод, что сахарные остатки находятся в пиранозной форме. Это подтверждается и величинами КССВ. Слабопольный сдвиг сигнала С-3 остатка хедерагенина по сравнению с незамещенным хедерагенином [2] свидетельствует о том, что гидроксильная группа именно у этого углеродного атома участвует в образовании гликозидной связи.

Химические сдвиги сигналов атомов углерода "С таупозила Е (δ, м.д., O-ТМС; C5D5N) даны в табл.1.

Съемка спектра сапонина в условиях сохранения спин-спинового взаимодействия однозначно определяет максимальное расположение заместителя (кислородного атома у С-1″) [4] и, следовательно, α-конфигурацию гликозидной связи. Для С-Г арабинопиранозильного остатка КССВ, составляющая 162,8 Гц, соответствует экваториальному расположению атома кислорода при С-Г [4], что с учетом 4С1-конформации цикла арабинопиранозы L-ряда (или 1С4 для Д-ряда) определяет α-конфигурацию гликозидного центра.

Сдвиг сигнала С-2ʹ остатка арабинопиранозы в слабопольную область на 3,8 м. д. по сравнению с незамещенным метил-α-L-арабинопиранозидом (72,2 м.д.) [2] еще раз подтверждает наличие 1-2-связи между остатками рамнозы и арабинозы.

Окончательное подтверждение структуры тауазида Е-3-O-[-α-L-рамнопиранозил-(1->2)-O-α-L -арабинопиранозил]-хедерагенин - следует из практически полного совпадения подспектра остатка рамнопиранозы в спектре сапонина со спектром метил-a-L-рамнопиранозида [2] и химических сдвигов сигналов атомов углерода остатков хедерагенина и арабинопиранозы со спектрами просапогенинов из Clematis chinenssi Osbeck [5], где упомянутые остатки имеют совершенно аналогичное ближайшее окружение и типы замещения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Спектры ЯМР получили на приборе Bruker WM-250 для растворов в дейтеропиридине при 40° с внутренним эталоном ТМС. В разностных спектрах ЯМР 1Н интенсивность сигнала преднасыщаемого протона принимали за 100% и ЯЭО усиленных сигналов относили к этой величине.

Измельченные сырые листья плюща крымского экстрагировали смесью изопропилового спирта с ацетоном (3:1). Полученную сумму экстрактивных веществ разделяли хроматографически на силикагеле Л при элюировании смесью растворителей хлороформ-метанол-вода (9:1:0,5). При этом наряду с гликозидами А, В, С, D, F выделяли преобладающий компонент - гликозид Е (1% от сырого веса листьев), Т. пл. 235-240((хлороформ-метанол, 9:1), [a]D+7° (с 3,2; этанол).

Таурозид Е (2 мг) растворяли в 0,2 мл диоксана, добавляли 0,2 мл 2 н. водного раствора трифторуксусной кислоты и нагревали 2 ч в запаянной ампуле при 100°. В гидролизате бумажной хроматографией идентифицировали арабинозу и рамнозу, Агликон идентифицировали методом ТСХ путем сравнения с заведомым образцом хедерагенина после нейтрализации гидролизата 1 н. водным раствором едкого кали и экстракции агликона хлороформом.

ВЫВОДЫ

Методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С с использованием ядерных эффектов Оверхаузера установлена структура таурозида Е - преобладающего тритерпенового гликозида листьев плюща крымского: 3-0-[α-L-рамнопиранозил-(1->-2)-O-α-L-арабинопиранозил]-хедерагенин.

Формула изобретения

1. Противогрибковое средство характеризующееся тем, что оно представляет собой тритерпеновый гликозид формулы 3-О-α-L рамнопиранозил (1->2)-α-L-арабинопиранозид хелерагенина, полученный из листьев плюща Herbera Helis, или Herbera taurica, или Herbera caucasigena, или Herbera baltica, или Herbera helix var-canariensis, или Herbera colchica путем экстракции 90% этиловым или изопропиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:5.

2. Средство по п.1, предназначенное для подавления жизнедеятельности грибов, патогенных для человека.

3. Способ получения противогрибкового средства, характеризующийся тем, что измельченные листья плюща Herbera Helis, или Herbera taurica, или Herbera caucasigena, или Herbera baltica, или Herbera helix var-canariensis, или Herbera colchica экстрагируют 90% этиловым или изопропиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент=1:5, экстракт упаривают, очищают от примесей путем растворения суммы гликозидов в бутаноле, насыщенном водой, затем последовательно промывают 5%-ным водным раствором аммиака и водой, упаривают, осаждают сумму гликозидов ацетоном и отделяют сумму тритерпеновых гликозидов, затем последнюю растворяют при нагревании в органическом растворителе, далее охлаждают при комнатной температуре, выдерживают до выпадения кристаллов целевого продукта.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что сумму тритерпеновых гликозидов отделяют фильтрованием.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что растворение суммы тритерпеновых гликозидов проводят при нагревании до кипения.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве органических растворителей используют, этанол, бутанол или смесь хлороформа с метанолом в соотношении 5:1.

7. Способ получения противогрибкового средства, характеризующийся тем, что измельченные листья плюща Herbera Helis, или Herbera taurica, или Herbera caucasigena, или Herbera baltica, рили Herbera helix varcanariensis, или Herbera colchica экстрагируют 90%-ным этиловым или изопропиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент=1:5, экстракт упаривают, очищают от примесей путем растворения суммы гликозидов в бутаноле, насыщенном водой, затем последовательно промывают 5%-ным водным раствором аммиака и водой, упаривают, осаждают сумму гликозидов ацетоном и отделяют сумму тритерпеновых гликозидов, далее ее подвергают хроматографическому фракционированию, при этом очищенную сумму гликозидов пропускают через колонку с силикагелем и элюируют смесью растворителей хлороформ:этанол в соотношении 5:1 или 10%-ным водным раствором аммиака, далее элюент упаривают в вакууме.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что сумму тритерпеновых гликозидов отделяют фильтрованием.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что растворение суммы тритерпеновых гликозидов проводят при нагревании до кипения.

10. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют этанол, бутанол или смесь хлороформа и метанола в соотношении 5:1.