Способ определения зрелости сперматозоидов

Авторы патента:

G01N33/52 - использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги

Владельцы патента RU 2262107:

Уральский НИИ охраны материнства и младенчества (RU)

Изобретение относится к области медицины. Способ определения проводят по степени конденсации хроматина сперматозоидов на основе интенсивности флуоресценции ДНК сперматозоидов до и после принудительной деконденсации гепарином методом проточной цитометрии, с использованием в качестве флуорохрома этидия бромида. Проводят измерение флуоресценции ДНК на проточном цитофлуориметре в красной области спектра (λ=620 нм), используя программу CELLLQuest, скорость сортировки 300 клеток в секунду. Используя статистический метод Колмогорова-Смирнова, проводят сравнение гистограмм с определением индекса подобия двух кривых n. При изначальной максимальной конденсации хроматина, характерной для зрелых сперматозоидов, индекс подобия n будет высоким (>48,5). При низкой изначальной конденсации хроматина, характерной для незрелых сперматозоидов, индекс подобия n будет низким (<48,5). Способ обеспечивает точность определения.

Область применения: Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике.

Уровень техники

Аналоги

1. Flow cytometry-fluorescence measurements for characterizing sperm (Ewenson et al.) [1]. При осуществлении данного метода происходит распределение сперматозоидов на группы в зависимости от степени конденсации их хроматина, на что указывает его способность связываться с флуорохромом (акридиновым оранжевым). Метод носит описательный характер, учитывается число сперматозоидов с конденсированным хроматином, но не выделяется степень конденсации.

2. Изучение деконденсации хроматина в сперматозоидах кролика (Кузнецова И.В., Лущиков С.Б., Кузнецов А.В.) [2]. Данный метод предлагает количественную оценку процесса деконденсации хроматина сперматозоидов, происходящего под воздействием различных реагентов. Метод носит описательный характер, требует проведения сложного преаналитического этапа и одновременного применения сложных диагностических аппаратов (электронный микроскоп, спектрофлуориметр, люминесцентный микроскоп).

Прототип

Прототипом предложенного способа является метод Воробьевой О.А. и др. [3, 4]. Авторы оценивают степень конденсации хроматина, сравнивая интенсивность флуоресценции хроматина сперматозоидов до и после принудительной деконденсации гепарином. Однако четкий математический анализ, необходимый для динамического наблюдения за пациентом или для сравнения разных пациентов, в данной методике отсутствует.

Сущность изобретения

Цель изобретения заключается в разработке способа определения зрелости сперматозоидов путем оценки степени конденсации хроматина сперматозоидов.

Способ осуществляют следующим образом:

Проводят исследование эякулята, полученного способом мастурбации после 4-6-дневного периода полового воздержания. Для приготовления пробы в две пробирки, содержащие по 100 мкл спермы, добавляют по 500 мкл трис-буфера, пробирки центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, после чего удаляют надосадочную жидкость и осадок ресуспендируют в 250 мкл трис-буфера. В обе пробирки добавляют по 500 мкл детергента, содержащего тритон Х-100, и непрерывно встряхивают 30 секунд. В одну из пробирок добавляют 50 мкл гепарина (5000 ед/мл), инкубируют 20 мин при комнатной температуре. Добавляют в обе пробирки по 1500 мкл нитратного буфера и по 1 мкл этидия бромида.

Измеряют флуоресценцию ДНК на проточном цитофлуориметре в красной области спектра (λ=620 нм), используя программу CELLQuest. Скорость сортировки составляет 300 клеток в секунду. Степень конденсации хроматина сперматозоидов характеризуют гистограммы распределения клеток до и после обработки гепарином. Сравнение гистограмм проводят, используя статистический метод Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия двух кривых n.

При изначальной максимальной конденсации хроматина, характерной для нормальных зрелых сперматозоидов, насильственная деконденсация гепарином приведет к значительным изменениям флуоресценции ДНК, кривые на графике будут значительно различаться и показатель n будет высоким. При аномальной организации структуры хроматина сперматозоидов насильственная деконденсация приводит к меньшим изменениям флуоресценции ДНК и показатель n будет низким.

Установлено, что значение n>48,5 свидетельствует о зрелом состоянии сперматозоидов (норма), а значение n<48,5 характеризует незрелость сперматозоидов (патология).

Пример 1. Мартынов С.В. проходил обследование по поводу бесплодного брака. При первом обследовании выявлена астенотератозооспермия, показатель n составил - 24,7 (65/03 от 2.10.03), что характеризует незрелость сперматозоидов. Проведено лечение, после которого результаты спермограммы соответствуют нормозооспермии, показатель n=62,69 (8/04 от 29.01.04), что характеризует зрелое состояние сперматозоидов. В настоящее время супруга Мартынова С.В. беременна.

Пример 2. Зубарев В.М., проходит обследование по поводу бесплодного брака. При первом обследовании выявлена астенотератозооспермия, показатель n составил 19,3 (от 08.04.03). Проведено лечение, после которого результаты спермограммы соответствуют нижним границам нормы, а показатель n=24,27 (720/03 от 16.10.03). Назначен повторный курс лечения.

Примеры показывают, что индекс подобия двух кривых интенсивности флуоресценции ДНК сперматозоидов n может служить дополнительным критерием для диагностики и оценки качества лечения пациента. Достоверно установлено, что при n большем 48,5 состояние сперматозоидов соответствует норме, а при n меньшем 48,5 состояние сперматозоидов незрелое, пациенту требуется лечение.

Источники информации

1. U.S. Patent, Date of patent: Dec. 17, 1985. Patent Number: 4559309.

2. Кузнецова И.В., Лущиков С.Б., Кузнецов А.В. Изучение деконденсации хроматина в сперматозоидах кролика. Проблемы репродукции, 4, 1995, 8-12.

3. Воробьева О.А., Филатов М.В., Леонтьева О.А., Семенова Е.В. Влияние аномальной организации хроматина сперматозоидов на развитие эмбрионов человека. Проблемы репродукции, 4, 1997, 23-26.

4. Воробьева О.А., Филатов М.В., Леонтьева О.А. Влияние аномальной организации хроматина сперматозоидов на развитие эмбрионов человека. Проблемы репродукции, 1, 1998, 14-18.

Способ определения зрелости сперматозоидов путем оценки степени конденсации хроматина сперматозоидов при исследовании эякулята, отличающийся тем, что сравнивают интенсивность флуоресценции ДНК сперматозоидов до и после насильственной деконденсации хроматина гепарином посредством статической обработки методом Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия кривых интенсивности флуоресценции n, при значении которого меньше 48,5 судят о незрелом состоянии сперматозоидов, а при значении n больше 48,5 судят о зрелости сперматозоидов.

Изобретение относится к медицине, к лазеротерапии, и может быть использовано для подбора индивидуального курса лазеротерапии для детей. .

Способ неинвазивной диагностики степени выраженности фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом // 2261441

Изобретение относится к медицине, а именно к клинике внутренних болезней. .

Способ дифференциальной диагностики компенсированной и декомпенсированной формы хронического тонзиллита // 2261048

Изобретение относится к области медицины, в частности к оториноларингологии. .

Способ оценки эффективности лечения транскраниальной магнитной стимуляцией (тмс) депрессивных расстройств // 2260804

Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии. .

Способ прогнозирования затяжного течения пневмонии у больных с патологией печени // 2260803

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии. .

Способ ранней диагностики холедохолитиаза // 2256922

Изобретение относится к медицине и может быть применено в качестве способа ранней диагностики холедохолитиаза. .

Способ прогнозирования течения хронического лимфолейкоза // 2256921

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии. .

Способ определения гликогена в экстракте из органов и тканей пчел // 2256320

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности биохимии животных. .

Способ выявления в ткани нервных волокон адренергической и холинергической природы // 2256179

Изобретение относится к области клинической диагностики и может быть использовано для морфологического исследования вегетативных нервных структур в тканях организма, удаленных во время оперативного вмешательства.

Способ прогнозирования течения длительно незаживающей язвы желудка и двенадцатиперстной кишки // 2255661

Изобретение относится к области медицины, в частности к гастроэнтерологии. .

Способ диагностики дефицита магния при внутренней патологии // 2263316

Изобретение относится к области клинической медицины и лабораторной диагностики

Способ диагностики алкогольного поражения сердца у больных с тяжелым отравлением этанолом // 2264626

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и наркологии, и может быть использовано в диагностике алкогольного поражения сердца у больных с тяжелым отравлением этанолом

Способ прогноза клинического течения хламидийного конъюнктивита // 2264627

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано в медицинской практике для прогноза течения хламидийного конъюнктивита

Способ предотвращения кратковременного взятия проб устройством, заполняемым действием капиллярной силы или капиллярным затеканием // 2264861

Способ определения алюминия в биологических объектах // 2265842

Изобретение относится к химико-токсикологическому контролю при санитарно-гигиенической оценке продуктов животноводства, а также для прижизненной и посмертной диагностики случайных отравлений животных соединениями алюминия, а именно к способу определения алюминия в биологических объектах, заключающемуся в минерализации анализируемого образца азотной, серной и хлорной кислотами, выдерживании смеси при комнатной температуре, кипячении до полного ее обесцвечивания, охлаждении, нейтрализации, добавлении реакционной ацетатной буферной смеси, с последующим измерением оптической плотности и определением концентрации алюминия по калибровочному графику, отличающийся тем, что для минерализации образца азотную, серную и хлорную кислоту добавляют к образцу одновременно, смесь выдерживают при комнатной температуре 15-20 мин, затем нагревают в закрытой колбе при постепенном повышении температуры, смесь кипятят до полного обесцвечивания, используют ацетатную буферную смесь, содержащую 10% раствор гидроксиламина солянокислого, 0,3% эриохромцианина R, 10% растворы NaOH и СН3СООН при рН 5,4, а измерение оптической плотности проводят при длине волны =535 нм

Способ фотометрического определения йода в моче // 2265847

Изобретение относится к биохимии, а именно к лабораторным методам исследований

Способ прогнозирования течения ишемии мозга // 2265848

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии

Реагентные системы для детектирования восстановленного кофактора // 2266543

Унифицированный способ количественного определения флавоноидов в траве и экстракционных препаратах очанки // 2266544

Изобретение относится к области фармации, а именно к унифицированному способу количественного определения суммы флавоноидов в траве трех видов очанок: очанки коротковолосистой, очанки мелкоцветной, очанки Рейтера и экстракционных препаратах очанки коротковолосистой

Способ прижизненного определения острой фазы стафилококкового среднего отита в эксперименте // 2267129

Изобретение относится к экспериментальному разделу медицины, к способу прижизненного определения острой фазы стафилококкового среднего отита в эксперименте при проведении исследований