Препарат, обладающий противовирусным и иммунокорригирующим действием

Изобретение относится к биофармакологии, иммунологии, медицине, в частности к производству лечебно-профилактических препаратов на основе лейкоцитарного интерферона и природных цитокинов. Препарат на основе комплекса природных цитокинов получен путем индукции лейкоцитов человека вирусом болезни Ньюкасла штамм «Н», причем указанный комплекс природных цитокинов получен путем не менее двух обработок лейкоцитов до стадии индукции вирусом тем же природным комплексом цитокинов, полученных на предыдущей стадии индукции, очищенный от чужеродных белков индуктора, содержащий в одной ампуле не менее 10⁴ ME противовирусной активности человеческого интерферона-альфа и клеточные цитокины, фосфатный буфер для поддержания рН 6,9-7,5, хлорид натрия и маннит, целевой продукт лиофилизируют для получения инъекционного препарата. Изобретение позволяет увеличить активность препарата и сохранить природный комплекс цитокинов. 2 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к биофармакологии, иммунологии, в частности к производству лечебно-профилактических препаратов на основе лейкоцитарного интерферона.

Лейкоцитарный интерферон или интерферон-альфа, секретируемый лейкоцитами в ответ на действие индуктора, является одним из важнейших факторов защиты организма от вирусных инфекций, а также активирующим действием на иммунную систему организма. При этом известно, что лейкоциты в комплексе с белком интерферон-альфа продуцируют и другие активные белки-цитокины, и этот комплекс биологически активных белков, секретируемых лейкоцитами под воздействием индукторов различной природы, является высокоэффективным иммунокорректором, открывает новые возможности в лечении вирусных, бактериальных, смешанных инфекций и некоторых онкологических заболеваний (1).

Известен препарат «Локферон» для лечения и профилактики вирусных заболеваний, который содержит человеческий лейкоцитарный интерферон, синтезированный лейкоцитами крови под воздействием индуктора - штамм вируса парагриппа 1 Сендай ГКВ №2339, сконцентрированный и очищенный микро- и ультрафильтрацией, содержащий не менее 8000 ME в ампуле противовирусной активности интерферон-альфа и клеточные медиаторы с м.м. 10-100 кД, овальбумин - не более 1 нг/мл, свободный от антибиотиков и гепарина и содержащий хлорид натрия до конечной концентрации 0,9 мас.%, и стабилизатор, например лактозу или поливинилпирролидон или маннит (2). Однако этот препарат недостаточно высоко очищен и используется для местного применения.

Известен препарат очищенный человеческий лейкоцитарный интерферон для инъекций (ЧЛИ) с активностью от 100 тыс ME до 1 млн ME/мг белка интерферона-альфа (3). Однако после концентрации интерферона-альфа он почти не содержит других цитокинов.

Известен препарат человеческий лейкоцитарный интерферон, полученный индукцией лейкоцитов под действием вируса болезни Ньюкасла, содержащий и другие биологически активные белки и имеющий противовирусную активность интерферона-альфа 1000 ME в ампуле (4). Однако содержание интерферона-альфа и других цитокинов в препарате низкое, а в случае дальнейшей очистки становится еще ниже. Этот препарат принят в качестве ближайшего аналога.

Техническим результатом изобретения является повышение активности препарата, содержащего интерферон-альфа в комплексе с природными цитокинами, и расширение спектра лекарственных препаратов иммунокорригирующего действия.

Сущность изобретения заключается в создании препарата, обладающего противовирусным и иммунокорригирующим действием, на основе комплекса природных цитокинов, полученных путем индукции лейкоцитов человека вирусом болезни Ньюкасла штамм «Н», при этом он содержит комплекс природных цитокинов, полученных путем последовательной неоднократной (не менее двух) обработки различных партий лейкоцитов человека до стадий индукции вирусом тем же природным комплексом цитокинов, полученных на предыдущей стадии индукции и синтеза, очищенный от чужеродных белков индуктора, содержащий в одной ампуле не менее 10⁴ МЕ противовирусной активности человеческого интерферона-альфа и клеточные цитокины, а также хлорид натрия - до конечной концентрации 0,6-0,9%, фосфатный буфер для поддержания рН 6,9-7,5 и стабилизатор - маннит в конечной концентрации 1 мг/мл.

Согласно изобретению использование комплекса интерферона-альфа с другими природными цитокинами с постоянно высокой активностью, полученного при индукции лейкоцитов с помощью вируса, для последующей обработки лейкоцитов до стадии обработки вирусом-индуктором, так называемый прайминг-эффект, позволяет получить более выраженный последующий прайминг-эффект и увеличить выход интерферона-альфа и других природных цитокинов. После нескольких процедур повышения биологической активности комплекса цитокинов наступает стабилизация на высоком уровне цитокинпродуцирующей активности клеток, индуцированных вирусом. Полученный таким образом препарат с дальнейшей очисткой после удаления низкомолекулярных соединений и метаболитов без фракционирования и переосаждения сохраняет комплекс природных цитокинов с составом, максимально приближенным к природному, что обеспечивает высокий биологический и клинический эффект. Под воздействием вируса лейкоциты продуцируют ряд медиаторов иммунного ответа - цитокины, обеспечивающие активацию основных эффекторов - макрофагов/моноцитов, Т-лимфоцитов, нейтрофилов, ЕК-клеток, цитотоксических макрофагов и др. При этом спектр цитокинов, определяемых в препарате, не ограничен только ИФН-альфа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-альфа, фактором ингибиции миграции макрофагов (МИФ), а содержит и другие цитокины в их естественном соотношении.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Для получения препарата на первом этапе для прайминга используют препарат, содержащий цитокины и нативный человеческий лейкоцитарный интерферон-альфа с активностью 1000-2000 МЕ/мл в необходимом разведении и после биосинтеза с использованием в качестве индуктора - вируса болезни Ньюкасла штамм «Н» получен препарат с активностью интерферона-альфа 4000 МЕ/мл.

Второй и последующие этапы.

Предыдущий препарат с первой стадии с активностью интерферона 4000 МЕ/мл используют для прайминга в стандартном разведении до введения вируса-индуктора и после биосинтеза выход интерферона-альфа составляет уже 8000 МЕ/мл, этот препарат используют для новой праймирующей обработки клеток - продуцентов интерферона-альфа в стандартном разведении и после биосинтеза выход интерферона-альфа составляет уже 16000 МЕ/мл. Этот препарат вновь используют для прайминга в стандартном разведении и после биосинтеза выход интерферона-альфа составляет уже 32000 МЕ/мл. Последний препарат вновь используют для прайминга в стандартном разведении, но после биосинтеза выход интерферона-альфа снова равен 32000 МЕ/мл. Если при следующем цикле активность по интерферону-альфа опять составляет 32000 МЕ/мл, то такой препарат постоянно используют для праймирующей обработки клеток-продуцентов. Что позволяет получать препарат с высокой активностью по интерферону-альфа, т.е. не менее 10⁴/амп вместе с другими цитокинами. Далее препарат стерилизуют, очищают от чужеродных белков вируса-индуктора, готовят лекарственную форму, стерилизуют с помощью фильтрации, лиофилизируют для получения препарата для инъекций.

Пример 2

Первый этап. Для прайминга используют нативный человеческий интерферон-альфа с активностью 1000 МЕ/мл в соответствующем разведении, который кроме интерферона-альфа (ИФН-альфа) содержит 0,4 нг/мл фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа) и после биосинтеза получен выход ИФН-альфа с активностью 3000 МЕ/мл и содержанием ФНО-альфа 0,87 нг/мл. Полученный препарат используют для следующей обработки новой порции клеток-продуцентов в необходимом разведении до введения вируса-индуктора и после биосинтеза выход интерферона-альфа составляет уже 8000 МЕ/мл, а для ФНО-альфа 2.0 нг/мл. Полученный препарат вновь используют для праймирующей обработки клеток-продуцентов и после биосинтеза в ответ на вирусную индукцию выход составляет для интерферона-альфа уже 16000 МЕ/мл, а для ФНО-альфа 6,3 нг/мл. Этот препарат вновь используют для праймирующей обработки клеток-продуцентов перед вирусиндуцированным синтезом цитокинов и выход ИФН-альфа составляет уже 32000 МЕ/мл и ФНО-альфа 6,4-8,4 нг/мл. Дальнейшие повторные циклы не приводят к повышению биосинтетической активности клеток-продуцентов и такой препарат используют для дальнейшего получения и очистки препарата с конечной стерилизацией, лиофилизацией и определением биологической активности. Препарат проверяется на токсичность, специфическую безвредность, стерильность.

Исследования по специфической активности. Препарат должен содержать не менее 10⁴ МЕ/амп противовирусной активности интерферона-альфа.

Определение проводят в первично-трипсинизированной культуре клеток кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, диплоидных или перевиваемых линиях клеток, чувствительных к интерферону-альфа (препарат ОСО активности 42-28-90-93П в этих культурах должен иметь титр в пределах от 500 и до 4000 ед.).

Получение перевиваемых клеток человека.

Клетки выращивают в лунках планшетов или пробирках. При работе на перевиваемых линиях клеток (например, М-19 и др.) их выращивают в матрацах по ТУ 64-3-181-76, вместимостью 1 л на среде №1.

В матрац со сформировавшимся монослоем вводят (50±5) мл Версена по ФС 42-65 ВС-93 в концентрации 0,02%, подогретого до (37±1)°С, или смеси 0,02% раствора Версена и трипсина по ФС 42-131 ВС-88 в концентрации 0,25% в соотношении 1:1, подогретой до указанной выше температуры. Спустя 5-8 мин после набухания клеток, оцениваемого визуально, среду из матраца сливают, а матрац помещают в термостат на 10-20 мин, пока клетки не начнут отслаиваться от стекла. Затем в матрац вводят 100 мл среды №1, энергично встряхивают и среду многократно пипетируют до получения гомогенной суспензии. Отбирают образец для подсчета количества клеток.

Взвесь разводят средой №1 до концентрации 3×10⁵ клеток в 1 мл и разливают по 0,1 мл в лунки планшетов. Планшеты инкубируют в атмосфере (5,0±0,5)% СО₂ и (70±5)% влажности при температуре (37±1)°С.

Получение перевиваемой культуры диплоидных клеток кожно-мышечной ткани эмбрионов человека.

Суспензию, содержащую 10⁶ первично-трипсинизированных клеток в 1,0 мг среды №1, переносят в матрац из нейтрального стекла вместимостью 100 мл и инкубируют 3 суток при (37±1)°С. Образующийся монослой просматривают под микроскопом при 100^х и при отсутствии каких-либо дегенеративных изменений снимают клетки со стекла. Для этого из матраца сливают ростовую среду и заливают монослой небольшим количеством (не более 5 мл) 0,25% раствора трипсина, подогретого до (37±1)°С. Матрац выдерживают (15±5) мин в термостате до появления первых признаков сползания клеток со стекла. Раствор трипсина сливают, в матрац заливают 20 мл среды №1, несколько раз его резко встряхивают и пипетируют клеточную суспензию непосредственно в матраце. Затем клеточную суспензию делят на 2 матраца вместимостью 100 мл, которые также инкубируют 3 суток при (37±1)°С.

После формирования монослоя операцию снятия клеток со стекла повторяют, переводя культуру в матрацы большей вместимости. При каждом пассировании клетки, выросшие в одном матраце, пересевают на два, чем и достигается их накопление.

Для определения активности интерферона может использоваться культура клеток от 10 до 25 пассажей. Монослой клеток, выросший в матраце, вместимостью 1 л снимают со стекла с помощью трипсина, как описано выше, и суспендируют в 40 мл среды №1. Для титрования клетки рассеивают по 0,1 мл в лунки микропланшета и инкубируют при (37±1)°С в атмосфере (5,0±0,5)% СО₂ и (70±5)% влажности. Через 1-2 суток клетки образуют монослой и могут использоваться для титрования. При определении активности готовят разведения (средой №1, обычно двукратные) исследуемых образцов и ОСО активности 42-28-91-93 (активность которого выражена в международных единицах - ME) до значений, близких к предполагаемому титру. На каждое разведение используют не менее 4 лунок (пробирок) с культурой. Из лунок (пробирок) удаляют среду и вносят соответственно 0,1 или 1,0 мл разведении образцов. В качестве контроля оставляют также 4 лунки (пробирки) и заменяют в них среду на свежую. Кроме того, 16 лунок (пробирок) оставляют для контроля дозы индикаторного вируса. Культуры инкубируют в течение суток при (37±1)°С, (культуру в планшетах в атмосфере (5,0±0,5)% СО₂ и (70±5)% влажности). Затем в каждую лунку с разведением испытуемого образца или ОСО вносят определенную заранее дозу индикаторного вируса везикулярного стоматита (ВВС) штамм "Индиана", соответствующую для данной культуры 100 ТЦД₅₀ в 0,1 мл. Одновременно определяют правильность дозы вируса, заражая оставленные лунки разведениями рабочей дозы ВВС 10^-1, 10^-2 и 10^-3 - средой №1. На каждое разведение расходуют не менее 4-х лунок (пробирок). Зараженные культуры инкубируют дальше в описанном выше режиме в течение 1-2 суток, после чего просматриваются под микроскопом при увеличении 100^х.

Учет результатов рекомендуется проводить, когда доза введенного ВВС соответствует 100 ТЦД₅₀ - при выраженной вирусной дегенерации монослоя в разведении рабочей дозы 10^-2. При этом в контроле монослой клеток должен оставаться неизменным и не иметь признаков дегенерации.

За титр интерферона принимают разведение, при котором не менее 50% клеток остаются защищенными от цитопатического действия вируса. Пересчет активности в ME осуществляется по формуле

Исследования по токсичности. Препарат должен быть нетоксичным. Контроль на отсутствие токсичности определяют одновременно на клеточных культурах и на животных.

а) Используют монослойные культуры клеток фибробластов человека, диплоидные фибробласты М-19, М-21 по или перевиваемые линии, применяемые при определении биологической активности интерферона.

Клетки выращивают в 96-луночных планшетах с плоским дном. В лунки с 1-3 суточной культурой со сформировавшимся монослоем вносят по 0,1 (или 1,0 мл) разведения 10^-1 препарата в среде №1 следующего состава - среда №199 или среда Игла с 5-10% сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина по и 50 ед/мл стрептомицина.

Для каждой испытуемой серии используют не менее 3-х лунок.

В лунки с контрольной культурой вносят соответствующее количество среды №1 без препарата. Культуры инкубируют 3-е суток при (37,0±1,0)°С, на планшетах в атмосфере с (5,0±0,5)% СО₂ по ГОСТ 8050-86, при влажности (70±5)%, после чего просматривают под микроскопом при увеличении 100^х.

Клеточный монослой должен оставаться неповрежденным, не иметь признаков дегенерации и не отличаться от контроля.

В случае появления дегенерации в испытуемых лунках контроль повторяют, а при повторном появлении дегенерации клеток, при нормальном монослое в контрольных культурах, препарат бракуют.

б) При контроле токсичности на животных трем кроликам массой 1,5-2,0 кг вводят в ушную вену препарат из расчета 0,5 мл на 1 кг. При наблюдении в течение 7 суток кролики должны оставаться оставаться здоровыми и не терять в весе.

Параллельно препарат по 0,5 мл вводят внутрибрюшинно беспородным белым мышам массой 17-20 г со скоростью 0,1 мл/мин. При наблюдении в течение 7 суток мыши должны оставаться здоровыми и не терять в весе.

Каждую серию контролируют не менее чем на 5 мышах.

Исследования по специфической безвредности. Препарат не должен содержать инфекционного вируса-индуктора. Полноту инактивации вируса контролируют двумя методами с использованием куриных эмбрионов и культуры фибробластов куриных эмбрионов.

а) При контроле на куриных эмбрионах используют 10-дневные куриные эмбрионы, которым вводят 0,2 мл препарата в аллантоисную полость шприцем. На каждую серию расходуют не менее 5 куриных эмбрионов.

После инкубации зараженных эмбрионов в течение 2-х суток при (37±1)°С их просматривают через овоскоп.Эмбрионы должны оставаться живыми. Из каждого эмбриона отдельно отсасывают аллантоисную жидкость и, не объединяя, проверяют на наличие вируса в реакции гемагглютинации с эритроцитами петуха. Для этого в лунках полистироловых пластин по ТУ 6-06-1609-77 готовят последовательные двукратные разведения аллантоисной жидкости на растворе натрия хлорида по ГОСТ 4233-77 в концентрации 0,9%, затем в каждую лунку вводят равные объемы 0,5%-ной суспензии петушиных эритроцитов на 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Результаты учитывают через 20-30 мин после оседания эритроцитов в контрольных лунках, содержащих взвесь эритроцитов и равный объем раствора хлорида натрия.

Не должно быть признаков гемагглютинации. При гибели хотя бы одного эмбриона или наличии гемагглютинации контроль повторяют на удвоенном количестве эмбрионов. В случае повторной гибели эмбрионов или положительной реакции гемегглютинации препарат бракуется.

б) Контроль на фибробластах куриного эмбриона проводят в монослойной культуре, которую выращивают в планшетах на среде №1. Посевная доза должна составлять 5×10⁴ клеток в 0,1 мл на лунку.

Культуру клеток в планшетах инкубируют при температуре (37±1)°С в атмосфере СО₂ (5,0±0,5)% и влажности (70±5)% до образования монослоя (2-3 суток), затем среду №1 сливают и вносят в лунки 0,1 мл 10^-1 разведения лейкинферона из ампулы в среде №1. На каждый препарат используют 4 лунки (пробирки). В контрольную культуру (4 лунки или пробирки) вводят соответствующее количество (0,1 мл) среды №1. Культуру инкубируют еще 3 суток, затем просматривают под микроскопом при увеличении 100^х. Монослой должен оставаться неповрежденным, без признаков цитопатического действия.

Если есть признаки дегенерации, контроль повторяют.

При повторном выявлении цитопатического действия препарата и нормальном состоянии монослоя в контрольной культуре препарат бракуют.

Определение фактора некроза опухоли (ФНО).

Для определения ФНО используется иммуноферментный метод или цитотоксический тест в линии клеток кожно-мышечной ткани мышей L-929.

При определении иммуноферментным методом используются моноклональные антитела к ФНО биотинилированные и конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином. Техника постановки реакции описана ниже для определения неспецифических примесей.

При определении ФНО в цитотоксическом тесте культуру мышиных клеток L-929 выращивают со строгим соблюдением условий стерильности в матрацах из нейтрального стекла по в ростовой среде №1.

С помощью камеры Горяева подсчитывают под микроскопом в суспензии количество клеток и разводят ее средой №1 до концентрации 6×10⁴ клеток в 1 мл. Посевная доза на матрац емкостью 1 л равна 6×10⁶ клеток или 100 мл приготовленной суспензии. Клетки инкубируют при t° 37±0,5°С. Монослой контролируют под инвертированным микроскопом любой модели под увеличением 100^х. В культуре не должно быть признаков бактериального пророста и нетипичных для фибробластов включений. При снятии клеток со стекла монослой заливают 50,0 мл 0,25%-ного трипсина, подогретого до (37±0,5)°С, и выдерживают (6±1) мин, контролируя набухание клеток, которое оценивается визуально. Затем раствор трипсина сливают и помещают матрац в термостат при (37±1)°С на (8±2) мин, чтобы клетки начали отслаиваться от стекла, что также контролируется визуально. В матрац вводят 50,0 мл среды №1 и энергично его встряхивают. Это должно обеспечить сползание клеток в среду. Среду многократно пипетируют 1-2 мин до получения гомогенной клеточной суспензии, промывая струей ростовую поверхность. Для накопления культуры при каждом последующем пассировании клетки, выросшие в одном матраце, пересевают на три-четыре. С помощью камеры Горяева подсчитывают под микроскопом при увеличении 100^х количество клеток, разводят средой №1 до концентрации 3×10⁵ клеток в 1 мл и разливают в 96-луночные планшеты с плоским дном по ТУ 64-2-278-79 по 0,1 мл в каждую лунку с помощью автоматической микропипетки любой модели. Микропланшеты инкубируют в СО₂-инкубаторе при (37±1)°С и уровне CO₂-5% до формирования монослоя, который контролируют под инвертированным микроскопом при увеличении 100^х. Обычно через 1-2 суток роста клетки образуют монослой и могут использоваться для определения ФНО.

При определении ФНО в поддерживающей среде №2 готовят двукратные разведения исследуемых образцов и ОСО ФНО до значений, близких к предполагаемому титру.

Состав среды №2: среда №199 с 2% НЕС (прогретая), актиномицин-Д фирмы Сигма (США) в концентрации 0,5 мкг/мл.

На каждое разведение используют не менее 4 лунок с культурой. Из лунок удаляют среду №1 и вносят по 0,1 мл разведении образцов в среде №2. В качестве контроля оставляют 4 лунки и заменяют в них среду №1 на среду №2 по 0,1 мл в лунку. Планшеты инкубируют в описанном выше режиме в течение 1 суток, после чего проводят учет результатов под инвертированным микроскопом при увеличении 100^х. Под действием ФНО в результате его цитотоксической активности клетки отмирают, а монослой разрушается. За титр ФНО принимают разведение исследуемого препарата, при котором не менее 50% клеток погибает вследствие цитотоксического действия. Препарат должен вызывать цитотоксическое действие в культуре L-929 в разведении не ниже, чем 1:100, что соответствует 50 нг/мл ФНО.

Препарат не должен содержать примеси яичного альбумина. Для определения используют метод иммуноферментного анализа (ИФА) с чувствительностью не ниже 1 нг/мл.

В препарате должны отсутствовать поверхностный антиген вируса гепатита В, антитела к вирусу гепатита С, антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ 1, 2).

Препарат обладает выраженной противовирусной и иммунокорригирующей активностью, проявляет способность стимулировать пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (главным образом Т-хелперов(СД4+), хотя может корригировать и Т-клетки с СД8+ кластером, например, при острой лучевой болезни, онкологических заболеваниях. Препарат стимулирует кроветворение и может использоваться для преодоления лекарственной цитопении (анемии, лейко-, лимфо- и тромбоцитопении), без каких-либо других прапаратов. Противовоспалительное действие проявляется ускорением нормализиции показателей каллекреин-кининовой системы, содержания поздних белков острой фазы воспаления.

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой активностью по интерферону-альфа и широким спектром природных цитокинов за счет приемов, которые позволяют сохранить присутствующий в лейкоцитах и секретируемый ими комплекс биологически активных белков.

Список литературы

1. В.П.Кузнецов, Д.Л.Беляев и др. «Профилактика и лечение гриппа и других ОРВИ препаратами интерферона». В сб. научных трудов «Вирусные инфекции», г. Екатеринбург, 1993, с.51-62.

2. RU 2108804 C1, опубл. 20.04.1998.

3. И.А.Завалишин, Б.Т.Хайдаров, М.Н.Захарова, Л.С.Адарчева и др. «Опыт применения человеческого лейкоцитарного интерферона при ремиттирующем течении рассеянного склероза», Неврологический вестник, Казань, «Медицина», 1997, т.XXIX, вып.1-2, с.58-61.

4. В.П.Кузнецов, Д.Л.Беляев, А.А.Бабаянц «Концепция иммунокоррекции при многофакторных иммунодефицитных состояниях, инфекционных и онкологических заболеваниях», Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, Москва, 1996, №5, с.104-110.

1. Препарат, обладающий противовирусным и иммунокорригирующим действием на основе комплекса природных цитокинов, полученных путем индукции лейкоцитов человека вирусом болезни Ньюкасла штамм «Н» с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что препарат содержит комплекс цитокинов, полученных путем не менее двухкратной обработки лейкоцитов до стадии индукции вирусом тем же природным комплексом цитокинов, полученным на предыдущей стадии индукции, очищенный от чужеродных белков индуктора, содержащий в одной ампуле не менее 10⁴ ME противовирусной активности человеческого интерферона-альфа и клеточные цитокины, фосфатный буфер для поддержания рН 6,9-7,5, хлорид натрия - до конечной концентрации 0,6-0,9% и стабилизатор.

2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что целевой продукт лиофилизируют для получения инъекционного препарата.

3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют маннит в конечной концентрации 1 мг/мл.