Лекарственные средства, содержащие ингибиторы человеческой h-sgk киназы, контролирующей клеточный объем

Настоящее изобретение касается лекарственных средств, содержащих ингибиторы человеческой h-sgk киназы, регулирующей клеточный объем, у которой лизин в положении 127 заменен на аргинин. Такие лекарственные средства пригодны для лечения болезненных состояний, при которых необходимо снижение активности эпителиального натриевого канала и/или Na⁺, К⁺, 2Сl^- сопереносчика, в частности таких заболеваний, как цирроз печени, болезнь Альцгеймера и др. Изобретение обеспечивает повышение действия средств. 2 н.п. ф-лы, 6 ил.

 

Настоящее изобретение касается лекарственных средств, содержащих ингибиторы или активаторы человеческой h-sgk киназы, контролирующей клеточный объем. Такие лекарственные средства пригодны для лечения болезненных состояний, при которых наблюдается повышенная или пониженная экспрессия h-sgk. H-sgk, а также способ ее получения, описан в европейской заявке на патент ЕР-O 861896, подробное содержание которого является составляющей предлагаемого описания.

Толкование понятий:

Повышение экспрессии h-sgk ярко выражается при таких болезнях, как: сахарный диабет, артериосклероз, болезнь Альцгеймера, цирроз печени, болезнь Крона, фиброзный панкреатит, фиброз легких и хронический бронхит. Повышенное образование h-sgk можно объяснить стимуляцией экспрессии через фактор TGFβ₁ (фиг.1). Причиной фиброзных заболеваний является высокая степень образования и слабая степень расщепления матричных протеинов. Оба явления являются результатом действия фактора TGFβ₁. В фибробластах можно приостановить повышенную экспрессию матричных протеинов посредством подавления NKCC фуросемидом (фиг.2). До сих пор было не ясно, является ли повышенная экспрессия h-sgk лишь следствием или причиной заболевания.

Данные анализа удивительным образом подтверждают, что h-sgk активирует Na⁺, K⁺, 2Cl^- соперенос (фиг.3). Отсюда можно сделать вывод, что стимуляция NKCC посредством h-sgk вызывает фиброз. Наряду с Na⁺, K⁺, 2Сl^- сопереносом посредством h-sgk активируются еще ENaC (фиг.4 и 5) и MDEG.

Стимулирующее действие h-sgk на ENaC можно приостановить с помощью ингибитора киназы, как например, стауроспорин (Sigma, D-8204 Deisenhofen) или хелеритрин (Sigma, loc.cit.) (фиг.4). Кроме этого, действие h-sgk на ENaC можно приостановить, например, с помощью трансдоминантной ингибиторной киназы (фиг.5). Поэтому ингибиторы h-sgk, такие как стауроспорин, хелеритрин или другие ингибиторы киназ, могли бы быть использованы при лечении названных выше заболеваний. В основном для этих целей пригодны все известные ингибиторы киназ. Ингибиторы киназ во многих случаях можно приобрести в торговой сети, например, фирмы Calbiochem-Novabiochem GmbH, Lisztweg 1, D-65812 Bad Soden ("1998 General Catalog"). Другие ингибиторы киназ можно приобрести из других коммерческих и некоммерческих источников, известных специалисту.

При эпилептическом приступе h-sgk многократно экспримируется. Обнаруженные нами данные показывают, что полезными являются воздействия, снижающие возбудимость нейронов, так как активация NKCC приводит к снижению внеклеточной концентрации К* и, как следствие этого, гиперполяризации и связанному с этим подавлению активности нейронов. Кроме этого, подавление MDEG должно сдерживать возбудимость нейронов. Поэтому активаторы киназы, превышающие гемато-энцефалический барьер, могли бы успешно применяться при эпилептических приступах. И наоборот, сдерживание киназы могло бы в сочетании с медикаментами, превышающими гемато-энцефалический барьер, повышать внимательность и способность к учению. Активаторы киназ давно известны специалистам, особый интерес представляют С-активаторы протеинкиназы (смотри Calbiochem-Novabiochem 1998 General Catalog, loc.cit). Другие активаторы киназ можно приобрести из других известных специалисту коммерческих и не коммерческих источников.

Поскольку Na⁺, K⁺, 2Cl^- соперенос и Na⁺-канал играют важную роль при почечной Na⁺ резорбции, а повышенная почечная Na⁺-резорбция протекает при гипертонии, следует предположить, что повышение экспрессии киназы приводит к гипертонии, а понижение экспрессии киназы к гипотонии.

Настоящее изобретение касается, таким образом, также применения ингибиторов h-sgk для получения лекарственных средств для лечения сахарного диабета, артериосклероза, болезни Альцгеймера, цирроза печени, болезни Крона, фиброзного панкреатита, фиброза легких, хронического бронхита, радиационного фиброза, склеродермии, кистозного фиброза и других фиброзных заболеваний, а также для лечения артериальной гипертонии. Кроме этого, лекарственные средства, содержащие ингибиторы или активаторы h-sgk можно использовать для регулирования нейрональной возбудимости. В особенности предпочтительно применение в качестве ингибиторов стауроспорина или хелеритрина, а также их аналогов.

Результаты

Диабетическая почка:

В обычной почке h-sgk лишь слабо экспримирована. Четкая экспрессия h-sgk обнаруживается в отдельных клетках почечного клубочка, поздних проксимальных и дистальных канальцев. В отличие от этого в диабетической почке обнаруживаются скопления клеток с массивной эспрессией h-sgk.

Артериосклероз:

В стенках артериосклеротических сосудов обнаруживается увеличение массива экспримирующих h-sgk клеток.

Болезнь Альцгеймера:

В обычном мозгу обнаружены лишь отдельные клетки, экспримирующие h-sgk. Этими клетками, очевидно, являются олигодендроглиальные клетки. При болезни Альцгеймера наблюдается значительное увеличение числа клеток, экспримирующих h-sgk.

Цирроз печени:

В обычной печени h-sgk экспримирует лишь в Купфферовских клетках. При циррозе печени ткани усеяны клетками, экспримирующими h-sgk.

Болезнь Крона:

В нормальной ткани кишечника h-sgk экспримирует исключительно в энтероцитах. При болезни Крона киназу обнаруживают также и в соединительной ткани.

Фиброзный панкреатит:

В нормальной поджелудочной железе h-sgk обнаруживают в ацинарных клетках и мигрирующих клетках. Одиночные группы h-sgk-экспримирующих одноядерных клеток обнаруживаются вокруг входа в поджелудочную железу. При фиброзном панкреатите отчетливо повышается экспрессия киназы.

Фиброз легких и хронический бронхит:

Массивная экспрессия h-sgk наблюдается при фиброзе легких и хронических бронхитах.

Стимуляция h-sgk-экспрессии посредством фактора TGFβ₁;

Экспрессия h-sgk стимулируется посредством фактора TGFβ₁ (фиг.1). Поскольку TGFβ₁ образуется в фиброзных воспаленных тканях, то этим объясняется повышенная экспрессия h-sgk в воспаленной ткани.

TGFβ₁ стимулирует экспрессию матричного протеина бигликана, процесс, который приостанавливается под влиянием ингибитора NKCC фуросемида.

TGFβ₁ стимулирует экспрессию бигликана. В присутствии NKCC-ингибитора фуросемида действие фактора TGFβ₁ на экспрессию бигликана полностью парализовано. Таким образом, фиброзное действие фактора TGFβ₁ предполагает активирование NKCC (фиг.2).

Стимулирование NKCC посредством h-sgk:

Повышенная экспрессия киназы в фиброзных тканях может иметь различное значение, не имеющее причинной связи с фиброзом. Однако эксперименты с двухэлектродной клеммой напряжения показывают, что активность NKCC массированно стимулируется h-sgk (фиг.3). Эти данные исследования, принимая во внимание чувствительность фуросемида при синтезе бигликана, однозначно доказывают причинную роль h-sgk при фиброзе.

Стимулирование ENaC посредством h-sgk:

Этот процесс можно приостановить посредством ингибиторов киназы стауроспорина и хелеритрина. Как показано на фиг.4, поток через ENaC значительно возрастает благодаря соэкспрессии с h-sgk. Киназа, таким образом, стимулирует ENaC. Под воздействием ингибиторов киназы стауроспорина и хелеритрина можно полностью приостановить активирование ENaC посредством h-sgk.

Стимулирование эпителиального ENaC посредством h-sgk может измениться прямо в противоположную сторону из-за соэкспрессиии трансдоминантной ингибиторной h-sgk киназы:

Как показано на фиг.5, стимулирующее действие h-sgk-соэкспрессии на Na⁺-поток, обусловленный ENaC, можно приостановить посредством соэкспрессиии трансдоминантной ингибиторной киназы. Эта трансдоминантно-ингибиторная киназа (смотри раздел "Толкование понятий") при катализе так изменяется, что она не может больше развивать свою функцию. Но поскольку она наслаивается на субстрат, она вытесняет активную киназу и подавляет таким образом ее действие. Трансдоминантно-ингибиторная киназа подавляет не только рост ENaC-активности посредством экзогенной h-sgk, но и, по всей видимости, угнетает стимулирование посредством эндогенной h-sgk.

MDEG полностью исключается благодаря соэкспрессии с h-sgk:

Как показано на фиг.6, экспрессия MDEG индуцирует в овоцитах сильный Na⁺-поток, который активируется путем снижения внеклеточной величины рН. Канал полностью блокируется за счет соэкспрессии с h-sgk. Отсюда напрашивается вывод, что h-sgk подавляет нейрональную возбудимость.

Примеры:

Пример 1: Гибридизация in situ

Ткани нормальной поджелудочной железы, печени, сосудов, мозга, легких, почек и кишечника, а также ткани при диабетической нефропатии, артериосклерозе, болезни Альцгеймера, циррозе печени, болезни Крона, фиброзном панкреатите и фиброзе легких в 4% параформальдегид/0,1М натрийфосфатном буфере (рН 7,2) заливают на 4 часа в парафин. Из срезов ткани удаляют парафин и проводят гибридизацию, как это описано ранее (Kandolf, R., D. Ameis, P. Kirschner A., Canu, P.H. Hofschneider, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6272-6276, 1987; HohenadI, С., К., Klingel, J. Mertsching, P.H. Hofschneider, R. Kandolf., Mol. Cell. Probes 5: 11-20, 1991; Klingel,К.., С. HohenadI, A. Canu, M. Albrecht, M. Seemann, G. Mall, R. Kandolf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:314-318, 1992).

Гибридизированная смесь содержит или кодирующую h-sgk, ³⁵S-маркированную сенс-РНК, или комплементарную к последней РНК, ³⁵S-маркированную антисенс-РНК (по мере необходимости 500 нг/мл) в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 50% (объем/объем) деионизированного формамида; 600 мМ NaCl; 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); 0,02% поливинилпирролидона; 0,02% фиколла; 0,05% телячьего сывороточного альбумина; 10% декстрансульфата; 10 мМ дитиотреитола; 200 мкг/мл денатурированной соницированной (гомогенат, полученный под воздействием ультразвука) ДНК спермы лосося и 100 μг/мл тРНК печени кролика.

Гибридизацию с РНК-пробами проводят при температуре 42°С в течение 18 часов. Носители объектов промывают, как это описано в (HohenadI et al., 1991; Klingel et al., 1992), а затем проводят инкубацию в течение 1 часа при температуре 55°С в двухстандартном цитрате натрия. Негибридизированные пробы однонитевых РНК подвергают ферментативному разложению посредством РНКазы А (20 (μг/мл) в 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0/0,5 М NaCl в течение 30 мин при температуре 37°С. Пробы ткани в течение трех недель ауторадиографируют (Klingel et al., 1992) и окрашивают гематоксилин/эозином.

Пример 2: Транскрипционное регулирование бигликана и h-sgk.

Клетки культивируют в RPMi / 5% СО₂ / 10 мМ глюкозы при температуре 37°С, рН 7,4, добавляя к 10% (объем/объем) зародышевой телячьей сыворотки (FCS). Клетки культивируют до 90% слияния и после этого гомогенезируют в тризоле (GIBCO/BRL) (примерно 0,4×10⁶ на образец). Полную РНК препарируют согласно указанию производителя. Блоты по Нортону разделяют методом электрофореза с 15 или 20 мкг/мл полной РНК с раздельным контролем в присутствии 2,4 моль/л формальдегида с использованием 10 г/л агарового геля. В вакууме (Appligene Oncor Trans DNA Express Vacuum Blotter, Appligene, Хайдельберг, Германия) РНК переносят на положительно заряженные нейлоновые мембраны (Boehringer Маннгейм, Гермния) и сшивают под воздействием ультрафиолетового света (UV Stratalinker 2400, Stratagane, Хайдельберг, Германия). Гибридизацию проводят в течение ночи с применением DIG-Easy-Hyb (Boehringer Маннгейм) при концентрации проб 25 μг/л при температуре 50°С. Дигоксигенин (DIG)-маркированные пробы получают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), как это подробно описано в (Waldegger et. al. (1997) PNAS 94: 4440-4445). Для ауторадиографии фильтры экспонируют на рентгеновскую пленку (Кодак) в среднем в течение 5 мин.

Пример 3: Эксперименты с помощью двухэлектродной клеммы напряжения и меченых атомов.

Рассечение Xenopus laevis, получение и обработка овоцитов подробно описаны в (Busch et. al. 1992). Овоциты инъецируют по 1 нг цРНК из NKCC, ENaC или MDEG с или без одновременной инъекцией h-sgk. Эксперименты с двухэлектродными клеммами напряжения и тока можно проводить через 2-8 дней после инъекции. Сдерживание фуросемидом проникновения Na+ посредством NKCC выявляют путем поглощения ²²Na+ овоцитами, которое определяют с применением сцинтилляторного счетчика. Поток Na+ (ENaC) фильтруют при частоте 10 Гц и регистрируют с помощью самописца. Эксперименты проводят обычно на второй день после инъекции цРНК. Раствор в ванне содержит: 96 мМ хлористого натрия, 2 мМ хлористого калия, 1,8 мМ хлористого кальция, 1 мМ хлористого магния и 5 мМ HEPES при величине рН 7,5 и поддерживаемом потенциале -50 мV. Во всех экспериментах величину рН устанавливают путем титрования соляной кислотой или едким натром. Скорость протекания через ванну составляет 20 мл/мин, благодаря чему обеспечивается полная смена раствора в измерительной камере в течение 10-15 с. Все данные приведены в среднеарифметических величинах ±SEM.

Пояснения к чертежам

Фиг.1 Стимулирование экспрессии h-sgk с посредством фактора TGFβ₁:

Экспрессия h-sgk стимулируется фактором TGFβ₁. Показано действие фактора TGFβ₁ по истечении 0,5-6 часов (вверху). Форболовый эфир PDD (4-альфа-форбол-12,13-дидеканоат; стимулирует протеин киназу С) и ионофор Са⁺⁺ иономицин (Sigma, loc.cit; повышает внутриклеточную концентрацию Са⁺⁺) одновременно стимулируют экспрессию h-sgk (внизу).

Фиг.2 Стимулирование экспрессии бигликана посредством фактора TGFβ₁:

Экспрессия бигликана (В) стимулируется осмотическим набуханием клетки (гипо = h, вверху, слева) и фактором TGFβ₁ (справа, вверху). В присутствии МКСС-ингибитора буметанида (b) действие фактора TGFβ₁ на экспрессию бигликана почти полностью приостановлено (контроль = с).

Фиг.3 Стимулирование NKCC посредством h-sgk:

Поглощение ²²Na⁺ овоцитами, сдерживаемое фуросемидом [поглощение (нмоль/20 мин/овоцит) = u], который экспримирует NKCC, массированно стимулируется посредством h-sgk. Овоциты, инъецированные NKCC, не характеризуются более высоким проникновением Na⁺, по сравнению с неинъецированными овоцитами (n.i.). Проникновение Na⁺ не сдерживается ингибитором NKCC фуросемидом (=F) (вверху). Экспрессия h-sgk сама по себе не приводит к стимулированию проникновения Na⁺. Соэкспрессия h-sgk с NKCC ведет к сильному увеличению проникновения Na⁺, которое полностью парализуется фуросемидом.

Фиг.4 Стимулирование ENaC посредством h-sgk:

Ток через ENaC (1) сильно возрастает благодаря соэкспрессии с h-sgk. Обработка овоцитов ингибиторами киназы стауроспорином (S) или хелеритрином (С) парализует активность Na+-канала благодаря h-sgk.

Фиг.5 Стимулирование ENaC посредством h-sgk может выглядеть противоположным образом вследствие соэкспрессии трансдоминантной ингибиторной киназы:

Овоциты, которые одновременно экспримируют ENaC и h-sgk, показывают намного больший ток (1) по сравнению с овоцитами, которые экспримируют только ENaC. Соэкспрессия трансдоминантной ингибиторной киназы приостанавливает стимулирование ENaC посредством h-sgk.

Фиг.6 Подавление MDEG посредством h-sgk:

Ток, вызванный MDEG (1), возрастает по мере увеличения продолжительности инкубирования [день (Т) 1-4]. Вследствие соэкспрессии с h-sgk ток полностью приостанавливается (пик = р; плато = pl).

1. Применение ингибитора h-sgk киназы хелеритрина или его аналога или трансдоминантно ингибиторной h-sgk киназы, у которой лизин в положении 127 заменен на аргинин, для приготовления лекарственного средства для снижения активности эпителиального натриевого канала и/или Na⁺, K⁺, 2Сl^- сопереносчика при лечении заболеваний, выбранных из группы: цирроз печени, фиброзный панкреатит, фиброз легких, радиационный фиброз, склеродермия, кистозный фиброз, хронический бронхит, артериальная гипертония, болезнь Крона и болезнь Альцгеймера.

2. Трансдоминантно ингибиторная h-sgk киназа, у которой лизин в положении 127 заменен на аргинин.