Способ повышения устойчивости эритроцитов к гемолизу, индуцированному этанолом

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано при лечении алкоголизма. Задача решается путем введения во взвесь эритроцитов в растворе этанола лекарственного препарата галавита, растворенного в физиологическом растворе. Новым является использование галавита для повышения устойчивости эритроцитов к действию этанола. Изобретение обеспечивает возможность использования в клинической практике с целью повышения устойчивости мембран эритроцитов, а также расширение арсенала защитных средств биологических мембран эритроцитов от воздействия этанола. Изобретение позволяет повысить устойчивость эритроцитов крови взрослых практически здоровых людей и больных алкоголизмом и снизить их гемолиз, индуцированный этанолом, в 2 раза. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при лечении алкоголизма.

Известен способ защиты мембран эритроцитов при сахарном диабете с помощью биосинтетических инсулинов [1].

Известен также способ защиты альфа-токоферолом эритроцитов лабораторных животных от гемолиза, индуцированного термической травмой [2].

Известен также способ повышения устойчивости эритроцитов к кислотному гемолизу при добавлении в кровь растворов карнозина и N-ацетил-карнозина [3].

Адекватного прототипа по технической сущности и достигаемому результату не обнаружено.

Задача. Повышение устойчивости эритроцитов к гемолизу, индуцированному этанолом. Задача решается путем введения галавита во взвесь эритроцитов в растворе этанола.

Галавит разрешен фармакологическим комитетом к применению в медицинской практике в качестве иммуномодулирующего и противовоспалительного лекарственного средства, регистрационный №000088/02-2000 МЗ РФ.

Новым является использование галавита для повышения устойчивости эритроцитов к действию этанола.

Для оценки повреждения биологических мембран при различных патологиях часто используют эритроциты, которые являются высокочувствительной тест-системой внутренней среды организма [4]. Особенно важна такая оценка при алкоголизме, поскольку этанол является естественным метаболитом, хорошо растворяется как в гидрофильной, так и в гидрофобной областях биологических мембран и способен непосредственно воздействовать на мембраны эритроцитов, связываясь с их наружной поверхностью [5]. Хроническое воздействие этанола приводит к структурно-функциональной дезорганизация эритроцитов, снижению их гемолигической устойчивости и развитию анемии [6, 7].

В связи с этим важное значение приобретает расширение арсенала защитных средств биологических мембран эритроцитов от воздействия этанола.

Новые признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства галавита, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста. В научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено указаний на использование галавита для защиты эритроцитов от действия этанола.

Изобретение может быть использовано для стабилизации донорской крови, в лабораторных биохимических исследованиях при любых патологиях, сопровождающихся повреждением эритроцитов.

Исходя из вышеизложенного следует считать предлагаемое изобретение соответствующим критериям «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом.

Кровь от взрослых людей берут в пробирку с гепарином, кровь центрифугируют и осадок эритроцитов несколько раз отмывают физиологическим раствором. К 50 мкл плотного осадка эритроцитов добавляют 150 мкл раствора галавита (галавит растворяют в физиологическом растворе) в концентрации 100 мкг/мл (опытные пробы). К каждому образцу эритроцитов ставят контрольную пробу, в которую вместо раствора галавита вносят по 150 мкл физиологического раствора. Пробы преинкубируют при +37°С в течение 30 мин. Затем пробы осторожно перемешивают и в инкубационную смесь добавляют по 3,8 мл 10% раствора этанола, и пробы вновь инкубируют при +37°С в течение 3 часов. После инкубации пробы осторожно перемешивают, эритроциты осаждают центрифугированием, измеряют оптическую плотность супернатанта на спектрофотометре при 440 нм. Величину гемолиза эритроцитов в опытных пробах выражают в процентах по отношению к контролю, принимая оптическую плотность контрольных проб за 100% гемолиз.

Пример 1. Кровь здорового человека (мужчина, 41 год) берут в пробирку с гепарином, кровь центрифугируют и осадок эритроцитов несколько раз отмывают физиологическим раствором. К 50 мкл плотного осадка эритроцитов добавляют 150 мкл раствора галавита (галавит растворяют в физиологическом растворе) в концентрации 100 мкг/мл (опытная проба). В контрольную пробу вместо раствора галавита вносят 150 мкл физиологического раствора. Пробы преинкубируют при +37°С в течение 30 мин. Затем пробы осторожно перемешивают и в инкубационную смесь добавляют по 3,8 мл 10% раствора этанола, и пробы вновь инкубируют при +37°С в течение 3 часов. После инкубации пробы осторожно перемешивают, эритроциты осаждают центрифугированием, измеряют оптическую плотность супернатанта на спектрофотометре при 440 нм. Оптическая плотность супернатанта контрольной пробы равнялась 0,200; оптическая плотность опытной пробы (с добавлением галавита) - 0,085. Величину гемолиза эритроцитов в опытной пробе выражают в процентах по отношению к контролю, принимая гемолиз в контрольной пробе за 100%. В данном случае гемолиз в опытной пробе (добавлен галавит) составил 42,5% по отношению к контролю, что свидетельствует о повышении устойчивости эритроцитов к гемолизу при действии этанола в присутствии галавита.

Пример 2. Кровь здорового человека (женщина, 30 лет) берут в пробирку с гепарином, кровь центрифугируют и осадок эритроцитов несколько раз отмывают физиологическим раствором. К 50 мкл плотного осадка эритроцитов добавляют 150 мкл раствора галавита (галавит растворяют в физиологическом растворе) в концентрации 100 мкг/мл (опытная проба). В контрольную пробу вместо раствора галавита вносят 150 мкл физиологического раствора. Пробы преинкубируют при +37°С в течение 30 мин. Затем пробы осторожно перемешивают и в инкубационную смесь добавляют по 3,8 мл 10% раствора этанола, и пробы вновь инкубируют при +37°С в течение 3 часов. После инкубации пробы осторожно перемешивают, эритроциты осаждают центрифугированием, измеряют оптическую плотность супернатанта на спектрофотометре при 440 нм. Оптическая плотность супернатанта контрольной пробы равнялась 0,365; оптическая плотность опытной пробы (с добавлением галавита) - 0,230. Величину гемолиза эритроцитов в опытной пробе выражают в процентах по отношению к контролю, принимая гемолиз в контрольной пробе за 100%. В данном примере гемолиз в опытной пробе (добавлен галавит) составил 63,0% по отношению к контролю, то есть устойчивость эритроцитов к гемолизу, индуцированному этанолом, повышалась в присутствии галавита.

Пример 3. Кровь больного алкоголизмом (мужчина, 43 года) берут в пробирку с гепарином, кровь центрифугируют и осадок эритроцитов несколько раз отмывают физиологическим раствором. К 50 мкл плотного осадка эритроцитов добавляют 150 мкл раствора галавита (галавит растворяют в физиологическом растворе) в концентрации 100 мкг/мл (опытная проба). В контрольную пробу вместо раствора галавита вносят 150 мкл физиологического раствора. Пробы преинкубируют при +37°С в течение 30 мин. Затем пробы осторожно перемешивают и в инкубационную смесь добавляют по 3,8 мл 10% раствора этанола, и пробы вновь инкубируют при +37°С в течение 3 часов. После инкубации пробы осторожно перемешивают, эритроциты осаждают центрифугированием, измеряют оптическую плотность супернатанта на спектрофотометре при 440 нм. Оптическая плотность супернатанта контрольной пробы равнялась 0,370; оптическая плотность опытной пробы (с добавлением галавита) - 0,135. Величину гемолиза эритроцитов в опытной пробе выражают в процентах по отношению к контролю, принимая гемолиз в контрольной пробе за 100%. В данном примере гемолиз в опытной пробе (добавлен галавит) составил 36,5% по отношению к контролю, что свидетельствует о повышении устойчивости эритроцитов к гемолизу, индуцированному этанолом, в пробе с добавлением галавита.

В таблице 1 представлены результаты исследования влияния галавита на устойчивость эритроцитов к действию этанола; эритроциты взяты у 10 человек. Как видно из таблицы, процент гемолиза эритроцитов, индуцированного этанолом, в опытных пробах (инкубация с галавитом) по отношению к контрольным (инкубация с физиологическим раствором) колебался в пределах 36,5-66,7%, и только в одном образце крови из десяти гемолиз составил 86,9%. Средняя величина гемолиза опытных проб составила 55,2±4,56%.

Таблица 1. Гемолиз эритроцитов, индуцированный этанолом
№ образца крови	Оптическая плотность супернатанта	% гемолиза в опытных пробах по отношению к контролю
Контрольные пробы (физраствор)	Опытные пробы (галавит)
1*	0,200	0,085	42,5
2*	0.365	0,230	63,0
3**	0,360	0,200	55.6
4*	0,230	0,120	52,2
5*	0,300	0,155	52.7
6*	0,225	0,150	66,7
7*	0.230	0,200	86,9
8**	0,370	0,135	36,5
9**	0,365	0,160	43,8
10**	0,300	0,155	51,7
			M±m=55,2±4,56%
Примечании: * - кровь практически здоровых людей ** - кровь больных алкоголизмом

Таким образом, применение галавита позволяет повысить устойчивость эритроцитов крови взрослых практически здоровых людей и больных алкоголизмом и снизить их гемолиз, индуцированный этанолом, в 2 раза.

Список использованной литературы.

1. Балашова Т.С., Голега Е.Н., Рудько И.А., Балаболкин М.И., Кубатиев А.А. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита эритцитов у больных сахарным диабетом. Терапевтический архив. 1993. т.65. №10. С.23-27.

2. Бекярова Г.И., Маркова М.П., Каган В.Г. Защита α-токоферолом эритроцитов от гемолиза, индуцированного термической травмой. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1989. т.107. №4. С.413-415.

3. Прокопьева В.Д., Болдырев А.А., Бохан Н.А., Семке В.Я., Кулагин Е.М. Способ повышения устойчивости к гемолизу эритроцитов и восстановление их поврежденной формы. Патент на изобретение №2162698.

4. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Взгляд на закономерности изменений молекулярной организации мембраны и функциональных свойств эритроцитов при невротических расстройствах // Рос. Физиолог, журн. 2003. №2. С.129-138.

5. Иванец Н.Н., Анохина И.П., Валентик Ю.В. Современная концепция лечения больных алкоголизмом и наркоманиями // Вопросы наркологии. 1990. №3. С.13-16.

6. Бохан Н.А., Прокопьева В.Д. Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на эритроциты in vitro и in vivo. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. 166 с. (С.54-60).

7. Рослый И.М., Абрамов С.В. Биохимия и алкоголизм (III): длительная алкоголизация как механизм развития белковой дистрофии // Вопросы наркологии. 2004. №4. С.70-81.

Способ повышения устойчивости эритроцитов к гемолизу, индуцированному этанолом, заключающийся в добавлении к осадку эритроцитов препарата, защищающего эритроциты, отличающийся тем, что в качестве препарата добавляют раствор галавита, содержащий 100 мкг галавита в 1 мл физиологического раствора, пробы инкубируют при +37°С в течение 30 мин, осторожно перемешивают, в инкубационную смесь добавляют 10%-ный раствор этанола и пробы вновь инкубируют при +37°С в течение 3 ч, эритроциты осаждают центрифугированием.