Штамм бактерий salmonella enterica subsp. enterica serovar typhi b-8453 с устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам, используемый в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа

Изобретение относится к бактериологии. Предложен штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453, характеризующийся устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам, обусловленной мутацией в хромосомном гене gyrA вида Ser83Tyr. Предложенный штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под регистрационным номером B-8453. Штамм может быть использован в качестве контрольного штамма для фенотипических (детекция устойчивости низкого уровня к фторхинолонам) и молекулярных (детекция мутации в гене gyrA вида Ser83Tyr) исследований при диагностике брюшного тифа. 4 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и молекулярной детекции механизмов резистентности и может быть использовано в качестве контрольного штамма для контроля качества при диагностике брюшного тифа: на этапах фенотипических исследований (определение чувствительности к антибиотикам: выявление устойчивости низкого уровня к фторхинолонам) и молекулярных исследований (определение механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA).

По литературным данным, в различных странах мира выделяют штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, устойчивые к фторхинолонам за счет мутаций в хромосомном гене gyrA. Большинство зарубежных штаммов имеют устойчивость низкого уровня к фторхинолонам, обусловленную одной мутацией вида Ser83Phe. Штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенные в других странах, не могут быть ввезены и использованы в качестве контрольных штаммов при диагностике брюшного тифа в РФ. На территории РФ штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, характеризующиеся устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам, обусловленной мутацией в хромосомном гене gyrA вида Ser83Tyr, ранее не обнаружены, не изучены и не депонированы.

При диагностике брюшного тифа необходимо проводить постоянный контроль качества различных этапов исследования, в том числе при определении чувствительности штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к существующим антимикробным препаратам, использующимся для лечения брюшного тифа в качестве препаратов первого выбора (фторхинолонов). Для разработки новых фторхинолонов для лечения брюшного тифа необходимо точно установить механизмы устойчивости к антибиотикам молекулярными методами. Для контроля качества этих этапов исследования требуются контрольные штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi с известным уровнем устойчивости к фторхинолонам и известным механизмом устойчивости (мутациями в хромосомных генах).

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенный в Африке, который, как и штамм, предлагаемый в качестве изобретения, характеризуется устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам (Al-Emran НМ, Eibach D, Krumkamp R, et al., A Multicountry Molecular Analysis of Salmonella enterica Serovar Typhi With Reduced Susceptibility to Ciprofloxacin in Sub-Saharan Africa. Clin Infect Dis. 2016; 62 Suppl l (Suppl l):S42-6). Однако штамм-аналог имеет мутацию в хромосомном гене gyrA вида Ser83Phe и не может быть использован в качестве контрольного штамма при изучении штаммов именно с такой мутацией. Но у штаммов S.Typhi, выделяемых в РФ, такая мутация практически не встречается.

Предлагаемый в качестве изобретения штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 помогает преодолеть эти ограничения, поскольку характеризуется двумя свойствами, позволяющими использовать его как контрольный штамм (устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам и мутацией в хромосомном гене gyrA вида Ser83Tyr) и может быть использован в качестве контрольного штамма при диагностике брюшного тифа в РФ.

Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, необходимого для обеспечения достоверной диагностики и лечения брюшного тифа.

Авторами получен контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi для контроля качества различных этапов лабораторной диагностики брюшного тифа, с устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам и мутацией Ser83Tyr в гене gyrA.

Заявляемый штамм выделен от больного брюшным тифом, идентифицирован до вида Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi бактериологическими и серологическими методами. Устойчивость низкого уровня к фторхинолонам установлена стандартизованными методами диско-диффузионным и градиентных концентраций; наличие и вид мутации в гене gyrA определено при анализе данных полногеномного секвенирования штамма на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8453.

Характеристика штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 3 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Культуральные свойства: хемоорганотроф, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, растет на питательных средах (агар Эндо, висмут-сульфит-агар, гектоен-агар, XLD-arap, агар Плоскирева) при оптимальной температуре 37°С при рН 7,2, образуя характерные для бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi колонии.

Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм относится к группе O9 (D), серовару S.Typhi и имеет антигенную формулу 9,12,Vi:d:.

Основные свойства штамма:

1. Устойчивость низкого уровня к фторхинолонам:

- минимальная подавляющая концентрация налидиксовой кислоты более 256,0 мг/л, диаметр зоны задержки роста - 6 мм;

- минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина - 0,19 мг/л;

- диаметр зоны задержки роста вокруг диска с пефлоксацином - 18 мм. Стабильность свойств штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 (диаметров зон задержки роста и значений минимальных подавляющих концентраций) подтверждена путем повторения в течение 7 дней процедуры определения чувствительности к фторхинолонам диско-диффузионным методом и методом градиентных концентраций с агаром Мюллера-Хинтон, дисков и полосок с антибиотиками различных производителей: Oxoid (Великобритания), BioRad (США), HiMedia (Индия) и НИЦФ (Россия). Штамм давал стабильные результаты на агарах, дисках и полосках всех производителей при тестировании в течение 7 дней.

2. Молекулярный механизм устойчивости к фторхинолонам: одна мутация Ser83Tyr в QRDR-регионе хромосомного гена gyrA. Стабильность наличия мутации Ser83Tyr в геноме контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности, а также повторным исследованием штамма методом ПЦР в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления флуоресцентного зонда после хранения штамма в течение 6 мес при -70°С в криосреде.

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S. Typhi к антимикробным препаратам диско-диффузионным методом.

Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам диско-диффузионным методом проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течение 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали диски, пропитанные антибиотиками - налидиксовая кислота, 30 мкг и пефлоксацин 5 мкг. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали результат путем измерения зоны задержки роста культуры вокруг дисков с антибиотиками, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: диаметр зоны задержки роста вокруг диска с налидиксовой кислотой - 6 мм, вокруг диска с пефлоксацином -18 мм и относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам.

Пример 2. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S. Typhi к антимикробным препаратам методом градиентной диффузии.

Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам методом градиентной диффузии проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течение 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали градуированные полоски, пропитанные антибиотиками в градиенте концентраций: налидиксовая кислота - от 0,016 мг/л до 256,0 мг/л и ципрофлоксацин - от 0,002 мг/л до 32,0 мг/л. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали значение концентрации в месте пересечения эллипсовидной зоны задержки роста штамма с полоской, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: значение минимальной подавляющей концентрации налидиксовой кислотой составляло более 256,0 мг/л (полное отсутствие зоны задержки роста вокруг полоски), ципрофлоксацина - 0,19 мг/л. Контрольный штамм относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам, уровень устойчивости расценивался как низкий.

Пример 3. Контроль качества определения механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA по данным полногеномного секвенирования.

Детекцию мутаций в QRDR-регионе хромосомного гена gyrA проводили путем анализа данных полногеномного секвенирования. Выделение ДНК из исследуемых штаммов контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit для выделения ДНК из тканей, мазков, крови и биологических жидкостей (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество и количество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5хТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле, а также используя спектрофотометр QIAxpert при длине волны 260 нм. Подготовку библиотек проводили с использованием набора для подготовки библиотек Nextera DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera Index Kit и сменных крышек, магнитных частиц AMPure ХР Beads согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США). Поиск мутаций в хромосомных генах, отвечающих за устойчивость к фторхинолонам, у исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили с помощью веб-сервера ResFinder Датского Технического Университета, куда загружали данные в формате fasta. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проявлял заявленные свойства: в хромосомном гене gyrA стабильно обнаруживалась одна мутация вида Ser83Tyr.

Пример 4. Контроль качества определения механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA методом ПЦР в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления флуоресцентного зонда.

Выделение ДНК из исследуемых штаммов и контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проводили с использованием набора InstaGene Matrix (BioRad, США) согласно инструкции производителя. Регион гена gyrA амплифицировали с помощью специфических праймеров STGYRA1 и STGYRA12-GT (содержал внутренний гаситель флуоресценции) и флуоресцентно-меченного зонда. В состав 25 мкл ПЦР-смеси входили 2,5 ед. TaqF ДНК-полимеразы с буфером (Интерлабсервис, Россия), 2 мМ MgS04 и 3 мкл бактериальной ДНК. Амплификацию проводили на приборе CFX-96 (BioRad, США) согласно протоколу: начальная денатурация 95°С -15 мин; затем 35 циклов: 95°С -15 сек, 55°С -20 сек; финальная инкубация - 37°С - 3 мин. Анализ кривых и температуры плавления зонда проводили после завершения амплификации путем регистрации его флуоресценции при увеличении температуры на 1°С каждые 10 сек в диапазоне от 37°С до 75°С. О наличии мутаций в гене gyrA судили по снижению Тm зонда по сравнению с референтным штаммом, чувствительным к фторхинолонам, а также при сравнении значений Тm референтных штаммов с известными мутациями (Ser83Phe, Ser83Tyr, Asp87Asn). Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 имел значение Tm ниже, чем чувствительный референтный штамм. Значение Тm контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 соответствовало Tm референтных штаммов, имеющих мутации в 83 кодоне гена gyrA. Стабильность наличия мутации в геноме контрольного тест-штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 подтверждалась повторным проведением исследования на приборе другого производителя RotorGene 200 (Corbett Research, Австралия) с использованием для амплификации реагентов производства АлкорБио (Россия).

Для обеспечения достоверной диагностики брюшного тифа необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования материала. Предлагаемый штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать два этапа диагностики: этап определение чувствительности и устойчивости низкого уровня возбудителя к фторхинолонам двумя фенотипическими методами, а также этапа определения механизма устойчивости (мутации в гене gyrA вида Ser83Tyr) молекулярными методами.

Штамм бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8453, используемый в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области аналитической химии и заключается в создании пьезоэлектрического сенсора для определения лекарственных веществ фторхинолонового ряда – левофлоксацина и ципрофлоксацина.

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии. Питательная среда для выделения клебсиелл содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон мясной, дрожжевой экстракт, мезо-инозит, натрий хлористый, соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, нейтральный красный, натрий углекислый, карбенициллин, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ культивирования микроорганизма, выбранного из родов Saccharomyces sensu stricto, Kazachstania, Naumovozyma, Nakaseomyces и Vanderwaltozyma, в присутствии гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота, включающий встраивание в указанный микроорганизм молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую гуанидинобутиразу c номером EC 3.5.3.7 и функционально связанную с последовательностями промотора и терминатора, последующее культивирование указанного микроорганизма таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гуанидинобутиразу, экспрессируется в указанном микроорганизме, и культивирование указанного микроорганизма в присутствии гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для определения показаний к операции программированной санационной релапаротомии при перитоните.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения зоны характеризации аналитической пластины для проведения характеризации популяции микроорганизма в присутствии антимикробного агента методом MALDI, способ характеризации популяции микроорганизма (варианты), аналитическая пластина и средство для характеризации популяции микроорганизма, представляющее собой указанную пластину.

Изобретение относится к биотехнологии. Предлагается способ выделения и идентификации бактерий групп Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ герметизации вещества в выполненном на субстрате множестве ячеек.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ и система для очистки кокцидиальных ооцист, а также композиция очищенных кокцидиальных ооцист.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Плотная питательная среда для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов содержит мясную воду, печеночный отвар, пептон сухой ферментативный, натрий хлористый, 10%-ный раствор натрия углекислого кислого, глюкозу, глицерин, метабисульфит натрия, сыворотку крови крупного рогатого скота, агар микробиологический и питьевую воду при заданном содержании компонентов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к штамму бактерий Leptospira interrogans серогруппы Canicola серовара canicola для детекции антител к L. canocola.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 346, обладающий способностью полностью деструктировать диклофенак натрия, депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) ФГБУ ГосНИИгенетика НИЦ «Курчатовский институт» под регистрационным номером ВКПМ Ас-2106.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы. Предлагается штамм бактерий Methylococcus capsulatus, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им.

Изобретение относится к иммунобиотическому комплексу для нормализации кишечной микрофлоры организма. Указанный комплекс включает сухую микробную массу живых бактерий и биологически активные вещества (БАВ).

Изобретение относится к микробиологии. Способ производства сухих солей желчных кислот из нативной желчи крупного рогатого скота предусматривает осветление нативной желчи путем добавления активированного угля, прогреванием смеси до заданной температуры и охлаждением с последующей фильтрацией с получением осветленной желчи.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм лактобактерий Enterococcus hirae Т-8 13-2018, обладающий способностью продуцировать молочную кислоту и высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-13055.

Изобретение относится к микробиологии. Изобретение касается нового штамма (вида) микроорганизма – продуцента актифенола.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus plantarum Лб (н)37 2-2018, обладающий антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13052.

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии. Питательная среда для выделения клебсиелл содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон мясной, дрожжевой экстракт, мезо-инозит, натрий хлористый, соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, нейтральный красный, натрий углекислый, карбенициллин, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для изготовления вакцинных препаратов. Предложен способ получения вакцины гемофильной тип b конъюгированной.

Изобретение относится к бактериологии. Предложен штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453, характеризующийся устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам, обусловленной мутацией в хромосомном гене gyrA вида Ser83Tyr. Предложенный штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под регистрационным номером B-8453. Штамм может быть использован в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа. 4 пр.

Наверх