Пероральная лекарственная форма препарата в капсулах для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами

Изобретение относится к пероральной лекарственной форме препарата в капсулах, эффективной против ВНО (вируса натуральной оспы) и других патогенных для человека и животных ортопоксвирусов, и может быть использовано в области фармацевтики, вирусологии, медицины и ветеринарии. Готовая лекарственная форма содержит в качестве активного соединения, обладающего антиортопоксвирусной активностью, 7-[N-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло-[3.2.2.02,4]нон-8-ен-6-карбоновую кислоту (субстанция НИОХ-14), лактозы моногидрат, аморфный диоксид кремния безводный (аэросил), магния стеарат и микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ), крахмал картофельный, натрия хлорид и воду очищенную, в указанных в формуле изобретения количествах. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала готовых лекарственных форм, используемых в медицине и ветеринарии для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 9 пр.

 

Изобретение относится к пероральной готовой лекарственной форме препарата в капсулах для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами, и может быть использовано в области фармацевтики, вирусологии, медицины и ветеринарии.

Несмотря на то, что более 30 лет назад была успешно завершена программа глобальной ликвидации оспы, вирус натуральной оспы (ВНО) остается проблемой для общественного здравоохранения. Человеческая популяция в настоящее время подвергается потенциальной опасности применения природных или рекомбинантных штаммов ВНО и вируса оспы обезьян (BOO) в качестве биологического оружия [Parker S., Chen N.G., Foster S. et al. Evaluation of disease and viral biomarkers as triggers for therapeutic intervention in respiratory mousepox - an animal model of smallpox. Antiviral Res. 2012; 94 (1): 44-53]. Последствия вспышки оспы в человеческой популяции в настоящее время могут стать даже более катастрофическими, чем в предшествующем столетии. Это связано с тем, что программа вакцинации была прекращена во всем мире в 1980 году. В результате этого к настоящему времени более половины населения Земли не имеет иммунитета против ортопоксвирусных инфекций, а повышенная мобильность людей (включая межконтинентальные авиаперелеты) повысила скорость распространения вируса по планете.

Более того, в условиях постоянного роста категорий населения с иммунодефицитными состояниями вакцинация живым вирусом осповакцины становится проблематичной по причине возможности возникновения серьезных поствакцинальных осложнений. Кроме того, вспышки оспы обезьян в популяции людей в Африке, и случаи ее распространения представляют собой серьезную угрозу населению всего мира [Борисевич С.В., Маренникова С.С., Махлай А.А. и др. Оспа обезьян: особенности распространения после отмены обязательного оспопривания. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012; 2: 69-73]. В связи с этим особую важность приобретает проблема успешного устранения поствакцинальных осложнений и вспышек ортопоксвирусных заболеваний с помощью высокоэффективных химиотерапевтических препаратов. Именно поэтому в разработку усовершенствованных мер борьбы с натуральной оспой, включая новые вакцины и противовирусные лекарства, вкладываются крупные государственные инвестиции [LeDuc J.W., Jahrling P.В. Strengthening national preparedness for smallpox: an update. Emerging Infectious Diseases. 2001; 7: 155-157].

В настоящее время спектр лечебно-профилактических препаратов, используемых для экстренной профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами, в том числе ВНО, чрезвычайно ограничен. К этим средствам относятся тиосемикарбазоны, аналоги нуклеозидов и нуклеотидов, ациклические нуклеозиды и нуклеотиды [Parker S., Handley L., Buller M. Therapeutic and prophylactic drugs to treat orthopoxvirus infections. Future Virol. 2008; 3 (6): 595-612]. Таким образом, разработка высокоэффективных противовирусных препаратов, обладающих лечебно-профилактическим действием при заражении ВНО, является важной задачей для сохранения здоровья и жизни людей.

Предшествующий уровень техники

Разработка лекарственных препаратов против натуральной оспы - сложный, длительный и дорогостоящий процесс. Сначала проводится серийное крупномасштабное тестирование антиортопоксвирусной активности полученных соединений in vitro с целью выявления наиболее сильнодействующего, так называемого лидирующего соединения. В большей части опубликованных работ описываются именно эти начальные этапы. Тем не менее, лишь небольшая часть химических соединений, которые подавляют репликацию суррогатных ортопоксвирусов (вирусы осповакцины, оспы коров, эктромелии и др.) в клеточных культурах, обладают эффективностью в отношении ВНО in vitro, а тем более в экспериментах на моделях оспы у лабораторных животных.

Так, ViroPharma и USAMRIID при скрининге более миллиона соединений идентифицировали несколько классов активных агентов. Далее активные соединения оценивались в отношении BOO, ограниченное число кандидатов было выбрано для тестирования с использованием ВНО. В итоге, для разработки на более высоком уровне, в том числе для испытаний на лабораторных животных, был отобран только один ST-246 [Yang G., Pevear D.C., Davies М.Н. et al. An Orally Bioavailable Antipoxvirus Compound (ST-246) Inhibits Extracellular Virus Formation and Protects Mice from Lethal orthopoxvirus Challenge. J. Virol. 2005; 79 (20): 13139-13149; Smee D.F. Progress in the discovery of compounds inhibiting orthopoxviruses in animal models. Antiviral Chemistry & Chemotherapy. 2008; 19: 115-124]. Дальнейшие успехи в разработке этого соединения, как прототипа изобретения, будут описаны ниже.

Известен препарат Метисазон (Марборан^®), который проявлял умеренную противовирусную активность в отношении ВНО при демонстрации 50%-го ингибирования, но вызывать 80%-е ингибирование репликации был способен только в максимальной переносимой концентрации [Baker R.O., Bray М., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 2003; 57: 13-23]. Была проведена оценка большого количества близких соединений класса тиосемикарбазонов in vitro, и несколько соединений испытывались на мышиных моделях, проявляя при этом только умеренную профилактическую активность, но ни одно из этих соединений не было отобрано для последующих испытаний на приматах.

В настоящее время проводится исследование еще двух потенциальных противооспенных соединений с активностью на стадии репликации ДНК: Цидофовир (Vistide^®) - лекарство, которое разрешено применять при лечении герпесного ретинита, и СМХ001 - липидное пролекарство цидофовира. Эти соединения проявляют активность против суррогатных ортопоксвирусов в лабораторных моделях с использованием мелких грызунов. Однако полученные данные показали, что СМХ001 не обеспечивает значительную защиту от летальной инфекции мышей вирусом эктромелии [Parker S., Chen N.G., Foster S. et al. Evaluation of disease and viral biomarkers as triggers for therapeutic intervention in respiratory mousepox - an animal model of smallpox. Antiviral Res. 2012; 94 (1): 44-53].

Было обнаружено также, что введение Цидофовира обезьянам, зараженным ВНО, до начала болезни, но не после, могло предотвращать их смерть. Однако для получения оптимальных результатов была необходима очень высокая доза Цидофовира (20 мг/кг), которая вызывала развитие острой нефротоксичности. При этом вмешательство после появления оспенных поражений в этих моделях оказалось безуспешным [Всемирная организация здравоохранения. Научный обзор исследований вируса натуральной оспы, 1999-2010 гг. http://whqlibdoc.who.int/hq/2010/WHO_HSE_GAR_BDP_2010.3_rus.pdf. Дата обращения 06.05.2019].

Известно, что гидразоны азидокетонов алициклического и алифатического ряда проявляли слабую и умеренную активность in vitro против вирусов эктромелии, осповакцины, оспы коров, оспы обезьян [Патент РФ №2376283, МПК С07С 251/76, опубл. 20.12.2009]. Недостатком перечисленных выше аналогов является их невысокая антиортопоксвирусная активность, а также отсутствие исследований их активности в отношении ВНО.

Известно также химическое соединение 7-[N'-(4-трифтор-метилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0^2,4]нон-8-ен-6-карбоновая кислота, обладающее активностью в отношении вирусов эктромелии, осповакцины и оспы коров in vitro [Патент РФ №2412160, МПК С07С 243/38, опубл. 20.02.2011]. Основополагающим недостатком синтезированного химического соединения является то, что в технологии его получения используется спирт метанол, токсичность которого примерно в 10000 раз больше, чем у этанола [Физиологическое действие и токсичность спиртов. http://alcogol.su/page.php?al=fiziologicheskoe_deistvi. Дата обращения 06.05.2019]. Использование метанола в производстве средств медицинского назначения создает опасность для работников и окружающей среды, что делает практически невозможным лицензирование предприятия по производству пероральной готовой лекарственной формы против ВНО в связи с необходимостью соблюдения всех пунктов действующих Санитарных правил [СП 2.3.3.2892-11 «Санитарно-гигиенические требования к организации и проведению работ с метанолом» от 12.07.2011 г.; СП 4079-86 «Санитарные правила для предприятий по производству лекарственных препаратов» от 14.03.1986 г.]. Тем более что согласно пункту 3.1 СП 2.3.3.2892-11, «применение метанола допускается лишь в тех производственных процессах, где он не может быть заменен другими менее токсическими веществами».

Кроме того, активность указанного соединения исследовалась только в отношении суррогатных ортопоксвирусов и только в культуре клеток, а не в отношении ВНО на лабораторных модельных животных, инфицированных ВНО, что не является доказательством его противооспенного действия при введении в организм животных или людей. Для убедительного обоснования и рекомендации данного химического соединения в качестве противооспенного средства обязательно требуется получить результаты его высокой эффективности в отношении ВНО не только in vitro, но и в экспериментах на животных. Так, в отчете Института медицины Соединенных Штатов подчеркивается, что «наиболее убедительной причиной необходимости долговременного сохранения запасов живых ВНО является их важнейшая роль в тестировании и разработке противовирусных лекарственных средств, предназначенных для применения в случае вспышки натуральной оспы» [US Institute of Medicine. Live variola virus: considerations for continuing research. National Academy Press, Washington, DC, 2009]. Несмотря на то, что в мире были идентифицированы многочисленные соединения, ингибирующие репликацию суррогатных ортопоксвирусов во многих тест-системах in vitro, лишь небольшая часть из них способна проявлять противовирусную активность в отношении ВНО in vitro, а еще меньшая - in vivo. В связи с этим демонстрация того, что данное химическое соединение проявляет высокую активность в отношении ВНО in vivo, является обязательным и необходимым условием, чтобы позиционировать и рекомендовать его в качестве противооспенного средства для лечения и профилактики натуральной оспы.

Известен препарат (субстанция) ST-246 - химическое соединение 4-трифторметил-N-(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-етеноциклопроп[f]изоиндол-2(1Н)-ил)бензамида, обладающее противовирусной активностью не только в отношении суррогатных ортопоксвирусов, но и в отношении ВНО [Huggins J., Goff A., Hens ley L. et al. Nonhuman Primates Are Protected from Smallpox Virus or Monkeypox Virus Challenges by the Antiviral Drug ST-246. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2009; 53 (6): 2620-2625]. В данной публикации приведена лечебно-профилактическая активность перорально введенного ST-246 в дозе 300 мг/кг/сут в течение 14 суток обезьянам Cynomolgus (массой 3,5 кг), которые были инфицированы посредством внутривенного введения штамма Harper ВНО в дозе 1×10⁸ БОЕ (бляшкообразующих единиц) каждому животному. Три обезьяны начинали получать ST-246 непосредственно после заражения, а три обезьяны получали ST-246 через 1 сут. после заражения, две обезьяны в контроле получали плацебо. Обе обезьяны, получавшие плацебо, были эвтаназированы в связи с тяжестью развившегося заболевания, тогда как все обезьяны, получавшие ST-246, оставались живыми при отсутствии каких-либо значимых клинических или лабораторных признаков заболевания.

Однако приведенный выше аналог имеет существенные недостатки: во-первых, заражение ВНО осуществлялось не через органы дыхания, которые являются «входными воротами» ВНО при заражении людей, а внутривенным способом, в результате чего у обезьян создавалась искусственная виремия, и тяжелое заболевание оспой развивалось значительно быстрее, чем у людей; во-вторых, использованная для заражения обезьян доза ВНО, равная 10⁸ БОЕ/животное, на несколько порядков превышает дозы ВНО, которые могут инфицировать и вызывать заболевание человека; в-третьих, по биоэтическим и экономическим причинам, а также с учетом сложности и опасности работы с инфицированными ВНО обезьянами защитная эффективность ST-246 была продемонстрирована только на небольшом количестве этих животных (по 3 обезьяны в пролеченных группах, 2 в группе плацебо).

Известно лечебно-профилактическое средство на основе химического соединения 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0^2,4]нон-8-ен-6-карбоновая кислота (НИОХ-14) в дозе от 4 до 60 мг/кг массы тела, обладающее активностью против вируса натуральной оспы (патент РФ №2543338, МПК А61К 31/16, опубл. 27.02.2013 г.). Способ получения лечебно-профилактического средства против вируса натуральной оспы, включающий последовательное растворение и взаимодействие гидразида 4-трифторбензойной кислоты и 3,3а,4,4а,5,5а,6.6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этено-циклопроп[f]-фурана в соотношении молей 1:1 в растворителе с последующим перемешиванием полученной суспензии до получения осадка, который удаляют из раствора, отфильтровывают и сушат с получением конечного продукта химического соединения 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0^2,4]нон-8-ен-6-карбоновая кислота (НИОХ-14). В качестве растворителя используют этиловый или изопропиловый спирт, процессы приготовления суспензии реагентов, отделения и фильтрации осадка осуществляют при температуре +2-10°С, а выход сухого продукта составляет 96,0%.

Однако выше указанное лечебно-профилактическое средство против ВНО является химически синтезированным соединением, представляющим собой мелкодисперсный порошок, и непригодно для использования в таком виде в клинической практике, поскольку не является дозированной готовой лекарственной формой, удобной для перорального применения и обеспечивающей доказанный необходимый лечебно-профилактический эффект.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является готовая лекарственная форма (коммерческое наименование "TROXX") против ВНО для перорального введения (патент США №9744154, МПК А61К 31/404, опубл. 29.08.2017 г.), содержащая в одной капсуле (390 мг): полиморфную форму II 4-трифторметил-N-(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этеноциллопроп-[f]изоиндол-2(1Н)-ил)-бензамид (ST-246), который на порошковой рентгенограмме имеет характерные пики при угле отражения 2-тета. 12,74, 16,03, 16,99, 19,64, 21,96, 23,80 и 25,39 градусов (200 мг), моногидрат лактозы (33,15 мг), кроскармеллоза натрия - загуститель (42,9 мг), коллоидный диоксид кремния (1,95 мг), гидроксипропоилметилцеллюлоза - пищевые волокна (13,65 мг), лаурилсульфат натрия (7,8 мг), стеарата магния (1,95 мг), микрокристаллическая целлюлоза (88,60 мг), вода (остальное).

Однако в препарате-прототипе содержится лаурилсульфат натрия, который относится к эмульгатору Е487 и исключен из СанПиНа и национального стандарта РФ по пищевым добавкам, т.к. при приеме внутрь организма и контакте со слизистой оболочкой пищеварительного тракта становится причиной образования язв, а также имеет свойство накапливаться в организме, и плохо из него выводится (https://vkusologia.ru/dobavki/stabilizatory-emulgatory/e487.html). Содержание добавки Е487 не должно превышать в препарате 1-2 мас. %, а в ГЛФ прототипа лаурилсульфат натрия содержится в количестве 4,1%. Использование в ГФЛ кроскармеллозы натрия также нежелательно. Она относится к малоизученной пищевой добавке Е468, выполняющей функцию стабилизатора, гелеобразователя и супердезинтегратора, которая вызывает диарею в кишечнике организма (http://findfood.ru/component/pishhevoj-stabilizator-E468-kroskaramelloza) или (https://vkusologia.ru/dobavki/stabilizatory-emulgatory/e468.html). Данный компонент не должен превышать 1-3 мас. %, а в ЕЛФ препарата-прототипа его содержится 22,5%, что на порядок выше рекомендуемого.

Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение спектра готовых лекарственных форм (ГЛФ), используемых в медицине и ветеринарии, эффективных против ВНО и других патогенных для человека и животных ортопоксвирусов, а также улучшения состава целевых добавок ГЛФ препарата путем уменьшения их количества и использования безвредных и проверенных компонентов.

Указанный технический результат достигается тем, что в пероральной ГЛФ в капсулах, эффективной против ВНО и других патогенных для человека и животных ортопоксвирусов, содержащей химическое соединение, обладающее антиортопоксвирусной активностью, лактозы моногидрат, диоксид кремния, магния стеарат и микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ), согласно изобретения, дополнительно содержатся крахмал картофельный, натрия хлорид и вода очищенная, в качестве химического соединения, обладающего антиортопоксвирусной активностью, содержится 7-[N-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло-[3.2.2.0^2,4]нон-8-ен-6-карбоновая кислота (субстанция НИОХ-14), в качестве диоксида кремния - аморфный диоксид кремния безводный (аэросил) при следующем количественном содержании компонентов в одной капсуле с общей массой 400 мг:

Крахмал картофельный, натрия хлорид и воду очищенную используют в виде клейстера, который вводят в выше приведенный состав капсулы.

Масса содержимого капсулы (гранулят, субстанция НИОХ-14 с наполнителями) составляет 400 мг. Действующее вещество (субстанция НИОХ-14) входит в состав капсулы в количестве 180-220 мг. Для того чтобы получить твердую лекарственную форму высокого качества и придать вес капсуле, в капсулируемую массу ввели наполнители (вспомогательные вещества): микрокристаллическую целлюлозу, лактозу, натрия хлорид, крахмал, магния стеарат, аморфный диоксид кремния безводный (аэросил).

Выбранные наполнители влияют не только на технологические свойства массы, но и на скорость высвобождения, скорость и полноту всасывания лекарственного вещества, а также его стабильность при хранении.

При влажном гранулировании в качестве связывающего вещества для обеспечения прочности гранул применен крахмальный клейстер. Связывающего вещества в капсуле 2,25% от содержимого капсулы.

Для быстрого механического разрушения гранул в жидкой среде (воде или желудочном соке), что необходимо для высвобождения и последующего всасывания лекарственного вещества, в капсулируемую массу внесли микрокристаллическую целлюлозу - вещество, разрывающее гранулы после набухания при контакте с жидкостью.

Для улучшения смачиваемости и водопроницаемости гранул внесли в капсулируемую массу лактозу и натрия хлорид, что способствует быстрому распаду и растворению гранул.

Для исключения проблемы плохой сыпучести гранулята, предотвращения слипания гранул и налипания их на оборудование при наполнении капсул, в качестве скользящего вещества и вещества, которое препятствует прилипанию, использован магния стеарат. Этим же свойством обладает и крахмал.

Хорошая сыпучесть гранулята гарантирует точность и постоянство дозировки лекарственного вещества в капсуле.

Магния стеарат использован и в качестве смазывающего вещества для уменьшения образования неровностей на гранулах.

Для снятия элекростатического заряда с гранулята, что также улучшает сыпучесть капсулируемой массы, использовали аэросил (в качестве скользящего вещества). Этим свойством обладает и магния стеарат.

По сравнению с прототипом улучшается состав вспомогательных добавок ГЛФ заявляемого препарата путем уменьшения их перечня и использования безвредных и проверенных компонентов, таких как крахмал картофельный и натрия хлорид.

На фиг. 1. представлена диаграмма цитоксичности (круг) и противовирусной активности субстанции препарата НИОХ-14 в отношении вируса натуральной оспы (квадрат) в культуре клеток Vero (программа SoftMax 4.0). Ось абсцисс - концентрация в мкг/мл, ось ординат - оптическая плотность (ОП). ТС₅₀≈300 мкг/мл. IC₅₀≈0,004 мкг/мл.

На фиг. 2. приведена диаграмма цитоксичности (круг) и противовирусной активности готовой лекарственной формы (ГЛФ, капсулы) препарата НИОХ-14 в отношении вируса натуральной оспы (ВНО, квадрат) в культуре клеток Vero (программа SoftMax 4.0). Ось абсцисс - концентрация в мкг/мл, ось ординат - оптическая плотность (ОП). ТС₅₀≈300 мкг/мл. IC₅₀≈0,004 мкг/мл.

Ниже приведены составы (примеры 1-3) пероральной готовой лекарственной формы (ГЛФ) в капсулах препарата НИОХ-14, обладающего антиортопоксвирусной активностью.

Было проведено тестирование противовирусной активности в отношении вируса осповакцины (ВОВ) и цитотоксичности ГЛФ в капсулах препарата НИОХ-14 с минимальным (пример 1), оптимальным (пример 2) и максимальным (пример 3) количеством субстанции НИОХ-14 (с использованием ДМСО для получения раствора) в культуре клеток Vero. Оценивали показатели 50%-й вирус ингибирующей концентрации (IC₅₀, мкг/мл) в отношении ВОВ (штамм Copenhagen) и 50%-й цитотоксической концентрации (ТС₅₀, мкг/мл) капсулы ГЛФ препарата НИОХ-14 в культуре клеток Vero.

Пример 1. Пероральная ГЛФ в капсулах препарата НИОХ-14, обладающего антиортопоксвирусной активностью (с минимальным количеством субстанции НИОХ-14), содержащая в одной капсуле общей массой 400 мг:

При статистической обработке показателей противовирусной активности в отношении ВОВ и цитотоксичности ГЛФ препарата НИОХ-14 с минимальным количеством субстанции НИОХ-14 (n=5) было показано, что IC₅₀=0,004±0,001 мкг/мл; TC₅₀=430±79 мкг/мл. Это согласуется с нашими предыдущими данными по исследованию активности субстанции НИОХ-14 в отношении ортопоксвирусов [Кабанов А.С., Сергеев Ал.А., Булычев Л.Е., Бормотов Н.И., Шишкина Л.Н. и др. Изучение противовирусной активности химически синтезированных соединений в отношении ортопоксвирусов в экспериментах in vitro // Проблемы особо опасных инфекций. - 2013. - вып. 2. - С. 54-59].

Пример 2. Пероральная ГЛФ в капсулах препарата НИОХ-14, обладающего антиортопоксвирусной активностью (с оптимальным количеством субстанции НИОХ-14), содержащая в одной капсуле общей массой 400 мг:

При статистической обработке показателей противовирусной активности в отношении ВОВ и цитотоксичности ГЛФ препарата НИОХ-14 с оптимальным количеством субстанции НИОХ-14 (n=5) было показано, что IC₅₀=0,004±0,001 мкг/мл; TC₅₀=480±76 мкг/мл. Это согласуется с нашими предыдущими данными по исследованию активности субстанции НИОХ-14 в отношении ортопоксвирусов [см. ссылку для Примера 1].

Пример 3. Пероральная ГЛФ в капсулах препарата НИОХ-14, обладающего антиортопоксвирусной активностью (с максимальным количеством субстанции НИОХ-14), содержащая в одной капсуле общей массой 400 мг:

При статистической обработке показателей противовирусной активности в отношении ВОВ и цитотоксичности ГЛФ препарата НИОХ-14 с максимальным количеством субстанции НИОХ-14 (n=5) было показано, что IC₅₀=0,004±0,002 мкг/мл; TC₅₀=420±76 мкг/мл. Это согласуется с нашими предыдущими данными по исследованию активности субстанции НИОХ-14 в отношении ортопоксвирусов [см. ссылку для Примера 1].

Пример 4. Технология получения готовой лекарственной формы в капсулах, эффективной против ВНО и других патогенных для человека и животных ортопоксвирусов,

Способ получения субстанции НИОХ-14, эффективной против ВНО (патент РФ №2543338), включает последовательное растворение и взаимодействие гидразида 4-трифторбензойной кислоты и 3,3а,4,4а,5,5а,6.6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этено-циклопроп[f]-фурана в соотношении молей 1:1 в растворителе по схеме (I), приведенной ниже, с последующим перемешиванием полученной суспензии до получения осадка, который удаляют из раствора, отфильтровывают и сушат с получением конечного продукта химического соединения 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0^2,4]нон-8-ен-6-карбоновой кислоты (НИОХ-14). В качестве растворителя используют этиловый или изопропиловый спирт, процессы приготовления суспензии реагентов, отделения и фильтрации осадка осуществляют при температуре +2-10°С, а выход сухого продукта составляет 96,0%.

Схема (I) получения препарата НИОХ-14:

В производстве готовой лекарственной формы «НИОХ-14 капсулы 200 мг» отсутствуют химические процессы. На всех технологических стадиях применяются только физические процессы (взвешивание, смешивание, увлажнение, высушивание, опудривание, наполнение капсул).

Процесс получения «НИОХ-14 капсулы 200 мг» разделен на два основных технологических этапа:

1. Вспомогательные и подготовительные работы общего назначения;

2. Получение «НИОХ-14 капсулы 200 мг».

Каждый из основных технологических этапов включает в себя вспомогательные стадии и стадии технологического процесса.

К вспомогательным относятся следующие стадии:

1. Входной контроль качества сырья;

2. Подготовка персонала;

3. Получение воды очищенной;

4. Приготовление моющих и дезинфицирующих растворов;

5. Подготовка помещений и оборудования;

6. Мойка и стерилизация принадлежностей для приготовления лекарственной смеси.

Технологическими стадиями являются следующие процессы:

1. Получение гранулята препарата;

2. Наполнение капсул;

3. Фасовка в банки из полимерного материала;

4. Упаковка и маркировка.

Пример 5. Определение цитотоксичности и противовирусной активности ГЛФ препарата НИОХ-14 in vitro

Материалы. Вирусы. В работе использовали вирусы осповакцины (ВОВ, штамм Copenhagen), оспы коров (ВОК, штамм Гришак), оспы мышей (эктромелии, ВЭ, штамм К-1) и натуральной оспы (ВНО, штамм India3a), полученные из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (п. Кольцово, Новосибирская обл.). Вирусы культивировали в культуре клеток Vero в среде DMEM (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, п. Кольцово, Новосибирская обл.). Концентрацию вируса в культуральной жидкости определяли методом бляшек путем титрования образцов в культуре клеток Vero, рассчитывали и выражали в lg бляшкообразующих единиц (БОЕ/мл) [Virology Methods Manual. Edited by: Brian W.J. Mahy and Hillar O. Kangro. San Diego: Academic Press; 1996; Закс Л. Статистическое оценивание. Перевод с немецкого. М.: Статистика; 1976]. Концентрация вируса в использованных в работе образцах составляла от 5,6 до 6,7 lg БОЕ/мл. Наработанные и использованные в работе серии вируса с указанным титром хранили при -70°С.

Клеточные культуры. Вирусы культивировали в культуре клеток Vero, из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (п. Кольцово, Новосибирская обл.) в среде DMEM (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, п. Кольцово, Новосибирская обл.). Клетки выращивали в среде DMEM в присутствии 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) с добавлением пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). В качестве поддерживающей среды при культивировании вируса использовали ту же среду, но с добавлением 2% сыворотки.

Метод определения цитотоксичности и противовирусной активности ГЛФ препарата НИОХ-14 in vitro. Оценку противовирусной эффективности субстанции и ГЛФ препарата проводили по адаптированной и модифицированной нами методике [Селиванов Б.А., Тихонов А.Я., Беланов Е.Ф., Бормотов Н.И. и др. Синтез и противовирусная активность 1-арил-3-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло-[5.3.2.02,6.08,10]додец-11-ен-4-ил}мочевин. Химико-фармацевтический журнал. (2017) 51(6), 13-17]. В лунки 96-луночных планшетов, содержащих монослой клеток Vero в 100 мкл среды DMEM с 2% эмбриональной сыворотки, сначала вносили по 50 мкл серийных разведений растворов субстанции или ГЛФ препарата НИОХ-14 с капсулой, а потом - по 50 мкл разведения вируса осповакцины в дозе 1000 БОЕ/лунку. Токсическая активность препаратов определялась по гибели клеток под его воздействием в лунках планшета, в которые вирус не вносили. В качестве контролей использовали монослои клеток в лунках планшета, в которые вносили вирус без препаратов (контроль вируса) и монослои клеток в лунках, в которые не вносили ни вирус, ни соединения (контроль культуры клеток).

Капсулу ГЛФ вскрывали, высыпали содержимое (200 мг субстанции + 200 мг наполнители) в один пенфлакон, саму желатиновую капсулу помещали в другой пенфлакон. К содержимому капсулы добавляли 10 мл ДМСО. К желатиновой капсуле добавляли 10 мл питательной среды DMEM без сыворотки. Смешивали полученные растворы в равных объемах. Для оценки цитотоксичности и противовирусной активности препаратов в отношении ВОВ и ВНО готовили 2 ряда последовательных разведений с 3-кратным шагом. Для оценки цитотоксичности использовали 8 разведений, начиная с концентрации 1200 мкг/мл. Получали 1200; 400; 133; 44; 14,8; 4,9; 1,64; 0,54 мкг/мл. Для оценки противовирусной активности использовали 8 разведений, начиная с 4 мкг/мл. Получали 4,00; 1,33; 0,44; 0,148; 0,049; 0,016; 0,0054; 0,0018 мкг/мл. Разведения препаратов готовили в питательной среде DMEM с 2% сыворотки, и каждое разведение вносили в объеме 50 мкл в лунки 96-луночных планшетов с клетками, содержащими 100 мкл культуральной среды. Концентрация препарата в лунках для определения цитотоксичности была 300; 100; 33,3; 11,11; 3,7; 1,23; 0,411; 0,137 мкг/мл, а для определения противовирусной активности она была 1,00; 0,33; 0,11; 0,037; 0,012; 0,0041; 0,0013; 0,00045 мкг/мл.

При оценке цитотоксичности и противовирусной активности чистой субстанции НИОХ-14 без наполнителей и компонентов капсулы концентрация препарата в лунках планшета с клетками (без вируса и с вирусом) была такой же, как и при исследовании показателей ГЛФ препарата НИОХ-14.

После инкубирования в течение 4 суток, монослой клеток прокрашивали витальным красителем нейтральным красным в течение 2 часов. После удаления красителя и отмывки лунок от его несвязавшейся фракции добавляли лизирующий буфер. Количество красителя, адсорбированное живыми клетками монослоя, оценивали по оптической плотности (ОП), которая является показателем количества неразрушенных под влиянием вируса клеток в монослое. ОП измеряли на спектрофотометре Emax (Molecular Devices, США) при длине волны 490 нм. Учет результатов проводили с использованием планшетного спектрофотометра Emax и программы SoftMax 4.0 (Molecular Devices, США), которая автоматически рассчитывала 50%-ю цитотоксическую концентрацию (ТС₅₀ в мкг/мл) и 50%-ю вирус ингибирующую (эффективную) концентрацию (IC₅₀ в мкг/мл) препаратов. По соотношению 50%-й цитотоксической и эффективной концентраций определяли индекс селективности (SI): SI=ТС₅₀/IC₅₀.

Пример 6. Исследование противовирусной активности ГЛФ препарата НИОХ-14 в отношении вируса натуральной оспы in vitro

На данном этапе работы была изучена активность субстанции и ГЛФ препарата НИОХ-14 (с использованием ДМСО для получения раствора) в отношении вируса натуральной оспы (ВНО, штамм India3a) in vitro (фиг. 1 и 2). Разведение и концентрации препаратов в лунках с клетками с вирусом и без вируса приведены в разделе материалы и методы (пример 5).

Из приведенных данных на фиг. 1 видно, что субстанция препарата НИОХ-14 в отношении ВНО проявляла активность при IC₅₀≈0,004 мкг/мл и цитотоксичность при ТС₅₀≈300 мкг/мл. При статистической обработке показателей противовирусной активности в отношении ВНО и цитотоксичности субстанции НИОХ-14 (n=5) было показано, что IC₅₀=0,004±0,001 мкг/мл; ТС₅₀=410±101 мкг/мл. Это согласуется с нашими предыдущими данными по исследованию активности субстанции данного препарата в отношении ортопоксвирусов [см. ссылку для Примера 1].

На фиг. 2 представлены результаты тестирования противовирусной активности ГЛФ препарата НИОХ-14 в отношении ВНО in vitro. Было показано, что показатели активности против ВНО и цитотоксичности ГЛФ препарата НИОХ-14 (IC₅₀≈0,004 мкг/мл при ТС₅₀≈300 мкг/мл) сравнимы с показателями эффективности и цитотоксичности субстанции НИОХ-14, ранее обнаруженной нами в экспериментах с ортопоксвирусами [см. ссылку для Примера 1]. При статистической обработке показателей цитотоксичности и противовирусной активности в отношении ВНО ГЛФ препарата НИОХ-14 (n=5) показано, что IC₅₀=0,004±0,001 мкг/мл; ТС₅₀=370±32 мкг/мл.

Кроме того, было показано, что растворы субстанции и ГЛФ (капсулы с субстанцией и вспомогательными веществами) препарата НИОХ-14 проявляют одинаковую активность в отношении ВОВ и ВНО в культуре клеток (табл. 1).

Пример 7. Изучение противооспенной эффективности готовой лекарственной формы препаратов НИОХ-14 и ST-246 в отношении вируса натуральной оспы (ВНО) в экспериментах in vivo

В экспериментах на аутбредных мышах популяции ICR массой 8-10 г, инфицированных живым ВНО (штамм Ind-3а в дозе 30 ИД₅₀), было проведено исследование специфической активности готовой лекарственной формы (ГЛФ, капсулы) препарата НИОХ-14 при пероральном введении. В группах сравнения использовали субстанцию НИОХ-14, а также ГЛФ препарата и субстанцию ST-246, приготовленные для исследовательских целей. В контрольной группе инфицированных мышей перорально вводили раствор метилцеллюлозы, использованный для приготовления суспензий препаратов.

В таблице 2 приведены данные противооспенной эффективности ГЛФ препаратов НИОХ-14 и ST-246 в отношении ВНО в экспериментах in vivo.

Было показано, что в группах животных, получавших препараты, число инфицированных мышей было в 2 раза меньше, чем в контрольной группе. При этом титры вируса в легких у мышей в группах, получавших препараты, были практически в 1000 раз меньше, чем в контрольной группе.

Кроме того, при введении субстанций НИОХ-14 и ST-246 или готовых лекарственных форм НИОХ-14 и ST-246 не было обнаружено отличий между значениями количества инфицированных мышей и титрами ВНО в легких мышей.

Пример 8. Изучение противооспенной эффективности готовой лекарственной формы препарата НИОХ-14 в отношении вируса эктромелии (ВЭ) в экспериментах in vivo.

В экспериментах на аутбредных мышах популяции ICR массой 12-14 г, инфицированных вирусом эктромелии (ВЭ, штамм К-1, в дозе 10 ЛД₅₀), было проведено исследование специфической активности готовой лекарственной формы (ГЛФ, капсулы) препарата НИОХ-14 при пероральном введении в дозе 50 мкг/г массы тела мыши. ГЛФ препарата НИОХ-14 начинали вводить за 1 сут. до заражения, через 1 и 4 сут. после заражения и далее в течение 9 сут. после первого введения препарата (суммарно 10 раз в каждой группе). В контрольной группе мышам, инфицированным ВЭ, перорально вводили раствор метилцеллюлозы, использованный для приготовления суспензий препаратов, через 1 час и далее в течение 9 сут после заражения ВЭ (суммарно 10 раз).

В таблице 3 приведены данные противооспенной эффективности ГЛФ препарата НИОХ-14 при разных сроках введения относительно времени заражения ВЭ в экспериментах in vivo.

Было показано, что в группах животных, получавших препарат за 1 сут до заражения, через 1 и 4 сут после заражения и далее в течение 9 сут после первого введения препарата, число погибших мышей было достоверно меньше, чем в контрольной группе. При этом средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей в группах, получавших препарат, была достоверно выше, чем в контрольной группе мышей, инфицированный ВЭ в дозе 10 ЛД₅о.

Пример 9. Изучение противооспенной эффективности готовой лекарственной формы препарата НИОХ-14 в отношении вируса оспы коров (ВОК) в экспериментах in vivo.

В экспериментах на аутбредных мышах популяции ICR массой 12-14 г, инфицированных вирусом оспы коров (ВОК, штамм Гришак, в дозе 10 ЛД₅₀), было проведено исследование специфической активности готовой лекарственной формы (ГЛФ, капсулы) препарата НИОХ-14 при пероральном введении в дозе 50 мкг/г массы тела мыши. ГЛФ препарата НИОХ-14 и субстанцию НИОХ-14 вводили через 1 час после заражения и далее в течение 9 сут после заражения ВОК (суммарно 10 раз в каждой группе). В контрольной группе мышам, инфицированным ВОК, перорально вводили раствор метилцеллюлозы, использованный для приготовления суспензий препаратов, через 1 час и далее в течение 9 сут после заражения ВЭ (суммарно 10 раз).

В таблице 4 приведены данные противооспенной эффективности ГЛФ препарата НИОХ-14 и субстанции НИОХ-14 в отношении ВОК в экспериментах in vivo.

Было показано, что в группах животных, получавших ГЛФ препарата НИОХ-14 и субстанцию НИОХ-14, гибели мышей не наблюдалось, что достоверно отличалось от показателя летальности мышей в контрольной группе. При этом средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей в группах, получавших препараты, была достоверно выше, чем в контрольной группе мышей, инфицированный ВОК в дозе 10 ЛД₅₀.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что создана отечественная лекарственная форма препарата, эффективная против ВНО и других ортопоксвирусов, патогенных для человека и животных, для использования в медицине и ветеринарии, что подтверждает достижение заявляемого технического результата данного изобретения заключающегося в расширении спектра готовых лекарственных форм для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами. Кроме того, по сравнению с прототипом улучшается состав целевых добавок ГЛФ заявляемого препарата путем уменьшения их количества и использования безвредных и проверенных компонентов, таких как крахмал картофельный и натрия хлорид.

1. Пероральная лекарственная форма препарата в капсулах для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами, содержащая химическое соединение, обладающее антиортопоксвирусной активностью, лактозы моногидрат, диоксид кремния, магния стеарат и микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ), отличающаяся тем, что она дополнительно содержит крахмал картофельный, натрия хлорид и воду очищенную, в качестве химического соединения, обладающего антиортопоксвирусной активностью, она содержит 7-[N-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло-[3.2.2.0^2,4]нон-8-ен-6-карбоновую кислоту (субстанция НИОХ-14), а в качестве диоксида кремния - аморфный диоксид кремния безводный (аэросил) при следующем количественном содержании компонентов в одной капсуле с общей массой 400 мг:

2. Лекарственная форма по п. 1, отличающаяся тем, что крахмал картофельный, натрия хлорид и вода очищенная введены в состав в виде клейстера.