Способ получения везикул с трансмембранным градиентом ph

Изобретение относится к способу получения везикул с трансмембранным градиентом рН. Указанный способ характеризуется следующими стадиями: a) получения везикул, состоящих из по меньшей мере одного матричного вещества в водной среде, имеющей осмолярность не более чем 200 мОсм/л, где матричное вещество выбирают из группы, состоящей из амфифильных липидов, образующих липосомы, b) смешивания везикул с основным или кислым буфером, имеющим осмолярность, составляющую по меньшей мере на 200 мОсм/л выше, чем осмолярность водной среды стадии a), для применения осмотического шока к везикулам и для получения везикул, наполненных буфером, и c) разведения смеси водной среды и основного или кислого буфера, содержащего везикулы, наполненные буфером, путем добавления нейтрализующего раствора для получения везикул с трансмембранным градиентом рН, суспендированных в суспензионном буфере, где суспензионный буфер отличается от основного или кислого буфера по значению рН. Способ по изобретению обеспечивает стабильность везикул, полученных после стадии а), при стерилизации автоклавированием. 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 пр.

 

Настоящее изобретение относится к способу получения везикул с трансмембранным градиентом рН в соответствии с введением первого пункта формулы изобретения, к везикулам с трансмембранным градиентом рН в соответствии с введением п.13 и к применению таких везикул с трансмембранным градиентом рН по введению п. 14.

Внутривенное (Forster at al. Biomaterials 2012; 33:3578-3585) или интраперитонеальное (Forster et al. Sci Transl Med 2014; 6: 258ra141) введение везикул (например, липосом) с возможностью дистанционной загрузки (например, липосомы с трансмембранным градиентом рН) в последнее время были описаны как интересный подход для лечения передозировки лекарственными средствами и интоксикации эндогенными метаболитами (например, гипераммониемии). Такие липосомы содержат внутренний отдел, который содержит кислый или основной буферные агенты, и которые позволяют секвестрировать токсические соединения в их ионизированном состоянии посредством существования градиента pH между внутренним отделом и наружным окружением.

В соответствии с предшествующей областью техники липосомы с трансмембранным градиентом рН обычно получают путем гидратации в кислой или основной среде, с последующим титрованием (Nichols and Deamer Biochimica et Biophysica Acta 1976; 455:269-271), заменой среды гель-фильтрацией (Mayer et al. Biochimica et Biophysica Acta 1985; 816:294-302), или диализом (Forster at al. Biomaterials 2012; 33:3578-3585), и затем быстро используют для инкапсуляции лекарственных средств.

Стерилизацию таких везикул, в соответствии с предшествующей областью техники, проводят в окончательной композиции, содержащей инкапсулированное соединение. Однако такой подход не является адекватным, если трансмембранный градиент рН необходимо сохранять в течение длительного периода времени, как в случае биодетоксицирующих агентов, и/или если липосомы стерилизуют при высокой температуре. Действительно, с течением времени трансмембранный градиент рН снижается из-за диффузии химических веществ через липосомальную мембрану и/или деградации липидных компонентов липидного бислоя (главным образом фосфолипидов). Более того, химическая деградация липосомальных компонентов (главным образом фосфолипидов) может быть ускорена в основной или кислой среде, особенно если процесс стерилизации включает нагревание (например, автоклавирование).

Решение этой проблемы, описанное Stevens and Lee (Stevens and Lee Anticancer Res. 2003;23:439-442), состоит в получении стерильных лиофилизированных липосом, которые затем суспендируют в кислой или основной среде, с последующей нейтрализацией для получения трансмембранного градиента рН. Такой подход включает стадию лиофилизации, которая обычно предполагает получение липосом в асептических условиях, процесс, который может быть дорогим и трудно контролируемым, особенно, когда необходимо лиофилизировать большие объемы. Следовательно, такой подход является неидеальным с промышленной точки зрения. Более того, быстрое ресуспендирование высушенных липосом воспроизводимым образом может быть проблематичным, если используются большие количества липидов, как в случае применения в биодетоксикации (например, перитонеальный диализ).

В US 5393530 A описан способ удаленной нагрузки липосомальных везикул. Посредством этого трансмембранную нагрузку достигают путем смешивания липосомального раствора низкой осмолярности (осмотическая концентрация) с веществом, которое инкапсулируют. Затем смесь нагревают до температуры выше температуры перехода липидов мембран (Tc) липидов, которые создают липосомальные везикулы, для достижения дестабилизации мембраны и для включения вещества во внутреннюю часть везикул.

Bertrand et al. (ACS nano 2010; 4: 7552-7558) описывают способ получения липосом с трансмембранным градиентом рН, в котором кислый буфер инкапсулируют в липосомы на первой стадии. На второй стадии, наружный буфер вокруг липосом обменивают, так чтобы установился трансмембранный градиент рН между внутренней средой образованных липосом и внешним окружением.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение процесса получения, при котором стабильные везикулы с трансмембранным градиентом рН могут быть получены без вышеупомянутых ограничений в предшествующей области техники. В частности, будет возможным промышленное применение процесса производства.

Настоящая задача достигается посредством метода получения везикул с трансмембранным градиентом рН, имеющих характеристики п. 1.

Такой метод включает стадии, описанные далее. На первой стадии везикулы, полученные из по меньшей мере одного матричного вещества, получают в водной среде, имеющей осмолярность не более чем 200 мОсм/л. В одном варианте осуществления изобретения осмолярность водной среды равна или менее 150 мОсм/л, в частности равна или менее чем 100 мОсм/л, в частности равна или менее чем 75 мОсм/л, в частности равна или менее чем 50 мОсм/л, в частности равна или менее чем 25 мОсм/л, в частности равна или менее чем 10 мОсм/л, в частности равна или менее чем 5 мОсм/л, в частности равна или менее чем 1 мОсм/л. В одном варианте осуществления изобретения осмолярность находится в диапазоне от 1 мОсм/л до 200 мОсм/л или в диапазоне, составленном из любых из вышеуказанных осмолярностей (например от 10 мОсм/л до 150 мОсм/л и др.).

На второй стадии везикулы смешивали с основным или кислым буфером, имеющим осмолярность, составляющую по меньшей мере на 200 мОсм/л выше, чем осмолярность водной среды стадии a) для приложения к везикулам осмотического шока и для получения везикул, наполненных буфером. В одном варианте осуществления изобретения осмолярность основного или кислого буфера составляет по меньшей мере на 220 мОсм/л выше, чем осмолярность водной среды стадии a), в частности, по меньшей мере на 250 мОсм/л выше, в частности, по меньшей мере на 300 мОсм/л выше, в частности по меньшей мере на 350 мОсм/л выше, в частности по меньшей мере на 400 мОсм/л выше, в частности по меньшей мере на 450 мОсм/л выше, в частности по меньшей мере на 500 мОсм/л выше, в частности по меньшей мере на 550 мОсм/л выше. В одном варианте осуществления изобретения осмолярность основного или кислого буфера находится в диапазоне от на 200 мОсм/л до 550 мОсм/л выше, чем осмолярность водной среды стадии a) или в диапазоне, состоящем из любых из вышеуказанных осмолярностей (таких как от 220 мОсм/л до 500 мОсм/л и др.).

Следовательно, основной или кислый буфер представляет собой гиперосмотический буфер в отношении водной среды, используемой на первой стадии. В таком случае, осмотический шок применяется к везикулам немедленно. Такой осмотический шок приводит к включению в везикулы кислого или основного буфера. Следовательно, осмотический шок служит для кратковременной дестабилизации везикул с целью возможности включения буфера в везикулы. Формируются везикулы, наполненные буфером. В одном варианте осуществления изобретения гиперосмотический буфер также может содержать электролиты, которые используются для модуляции осмолярности или имеют физиологическую функцию.

Необходимо отметить, что к везикулам необходимо добавить достаточное количество основного или кислого буфера, суспендированным в водной среде, так как иначе осмотический шок не будет достигнут. Достаточное количество может быть - в зависимости от различий между осмолярностью водной среды и осмолярностью кислого или основного буфера - объемом, который соответствует по меньшей мере 0,1 крат объема водной среды, используемой на первой стадии, в частности по меньшей мере 0,3 крат, в частности по меньшей мере 0,5 крат, в частности по меньшей мере 0,8 крат, в частности по меньшей мере 1,5 крат, в частности по меньшей мере 2 крат, в частности по меньшей мере 2,5 крат, в частности по меньшей мере 3 крат и в частности по меньшей мере 5 крат в частности. В одном варианте осуществления изобретения основной или кислый буфер может быть добавлен в объеме, который равен объему водной среды. В одном варианте осуществления изобретения, объем основного или кислого буфера, который добавляют, может быть от 0,1 крат до 5 крат объема водной суспензии везикул или в любом другом диапазоне, который может быть составлен из вышеуказанных значений (таких как 0,3 крат до 3 крат, и др.).

В одном варианте осуществления изобретения значение pH гиперосмотического буфера находится в диапазоне от pH 1 до pH 6,9, в частности от pH 1,5 до pH 6,5, в частности от pH 2,0 до pH 6,0, в частности от pH 2,5 до pH 5,5, в частности от pH 3,0 до pH 5,0, в частности от pH 3,5 до pH 4,5, в частности о pH 3,0 до pH 3,5.

В одном варианте осуществления изобретения значение pH гиперосмотического буфера находится в диапазоне от pH 7,1 до pH 14, в частности от pH 7,5 до pH 13,5, в частности от pH 8,0 до pH 13,0, в частности от pH 8,5 до pH 12,5, в частности от pH 9,0 до pH 12,0, в частности от pH 9,5 до pH 11,5, в частности от pH 10,0 до pH 11,0, в частности от pH 10,5 до pH 11,0.

В одном варианте осуществления изобретения гиперосмотический буфер может содержать дополнительные химические средства, такие как комплексообразующий агент или хелатирующий агент.

На третьей стадии смесь водной среды и основного или кислого буфера, содержащую везикулы, наполненные буфером, разводят путем добавления нейтрализующего водного раствора. Смесь основного или кислого буфера и нейтрализующего раствора создает суспензионный буфер. Следовательно, после разведения получаются везикулы с трансмембранным градиентом рН, суспендированные в суспензионном буфере. Посредством этого pH суспензионного буфера отличается от основного или кислого буфера, содержащегося в везикулах, наполненных буфером. Разница pH составляет в варианте по меньшей мере 1 единицу pH, в частности по меньшей мере 1,5 единицы pH, в частности по меньшей мере 2 единицы pH, в частности по меньшей мере 2,5 единицы pH, в частности по меньшей мере 3 единицы pH, в частности по меньшей мере 3,5 единицы pH, в частности по меньшей мере 4 единицы pH, в частности по меньшей мере 4,5 единицы pH, в частности по меньшей мере 5 единиц pH, в частности по меньшей мере 5,5 единиц pH s, в частности по меньшей мере 6 единиц pH, в частности по меньшей мере 6,5 единиц pH, в частности по меньшей мере 7 единиц pH.

В одном варианте осуществления изобретения значение pH нейтрализующего раствора находится в диапазоне от pH 7,1 до pH 14, в частности от pH 7,5 до pH 13,5, в частности от pH 8,0 до pH 13,0, в частности от pH 8,5 до pH 12,5, в частности от pH 9,0 до pH 12,0, в частности от pH 9,5 до pH 11,5, в частности от pH 10,0 до pH 11,0, в частности от pH 10,5 до pH 11,0.

В одном варианте осуществления изобретения значение pH нейтрализующего раствора находится в диапазоне от pH 1 до pH 6,9, в частности от pH 1,5 до pH 6,5, в частности от pH 2,0 до pH 6,0, в частности от pH 2,5 до pH 5,5, в частности от pH 3,0 до pH 5,0, в частности от pH 3,5 до pH 4,5, в частности от pH 3,0 до pH 3,5.

Из-за различий суспензионного буфера и основного или кислого буфера достигают трансмембранного градиента рН между внутренней частью везикул и окружающим суспензионным буфером.

В одном варианте осуществления изобретения везикулы, полученные на первой стадии, стерилизуют так, чтобы получить стерилизованные везикулы или жидкий раствор, содержащий стерилизованные везикулы. Затем, такие стерилизованные везикулы используют при проведении второй стадии процесса производства, описанного выше. На этой второй стадии в варианте осуществления изобретения используют стерилизованный основной или кислый буфер. Таким образом могут быть получены полностью стерильные заполненные буфером везикулы или везикулы, полностью заполненные стерильным раствором, содержащим буфер. Стерилизацию можно проводить посредством, например, стерильной фильтрации или автоклавирования.

В другом варианте осуществления изобретения везикулы хранят в течение первого периода времени до проведения стадии смешивания везикул (или раствора, содержащего везикулы) с основным или кислым буфером. Такое хранение может быть осуществлено очень подходящим способом, если везикулы стерилизуют после первой стадии получения, так как в суспензии стерилизованных везикул не происходит совсем или происходит небольшое разрушение. Первым периодом времени может быть один день, несколько дней, одна неделя, несколько недель, один месяц или даже несколько месяцев. Необходимо отметить, что такие стерилизованные везикулы, содержащиеся в водной среде, являются стабильными структурами. Так как они еще не содержат какого-либо специфического кислого или основного буфера, как позднее при использовании везикул, не нужно опасаться потери буфера из-за разрушения или утечки везикул. Также верно, что везикулы, в одном варианте осуществления изобретения, содержат небольшое количество молекул электролитов, так как соответственно осмолярность в везикулах будет находиться в диапазоне от 1 мОсм/л до 200 мОсм/л. Кроме того, так как везикулы при хранении содержат в водной среде, не возникает недостатков, как в случае лиофилизации везикул.

Так как включение основного или кислого буфера достигается посредством сильного осмотического шока, дестабилизация везикул из-за повышенной температуры не является обязательной. В частности, необязательно нагревать везикулы до температуры, которая выше температуры перехода матричного вещества, используемого для получения везикул. Скорее удивительно было обнаружить, что стадию включения буфера в везикулы необязательно проводить выше температуры перехода липидов мембраны, если липиды используют в качестве матричного вещества.

Следовательно, в одном варианте осуществления изобретения, вторую стадию метода проводят при температуре, которая ниже температуры перехода фаз матричного вещества. Такой температурой перехода фаз может быть температура перехода липидов мембраны, если липид используется в качестве матричного вещества.

В одном варианте осуществления изобретения вторую стадию метода проводят при температуре 35°C или менее, в частности 30°C или менее, в частности, 25°C или менее, в частности 20°C или менее, в частности 15°C или менее, в частности 10°C или менее. В качестве примера подходящий диапазон температур для проведения второй стадии составляет от 15 до 35°C. Кроме того, дополнительные диапазоны температур с использованием вышеупомянутых температур, могут быть составлены, как желательно или необходимо (например, от 10 до 30°C и др.). В другом варианте осуществления изобретения весь метод получения проводят при вышеупомянутых температурах или диапазонах температур (в некоторых вариантах осуществления изобретения, исключая процесс стерилизации, в частности, если процесс стерилизации проводят как автоклавирование).

В одном варианте осуществления изобретения нейтрализующий раствор имеет осмолярность от 250 мОсм/л до 550 мОсм/л, в частности от 270 до 520 мОсм/л, в частности от 290 до 500 мОсм/л, в частности от 300 до 480 мОсм/л, в частности от 320 до 450 мОсм/л, в частности от 330 до 420 мОсм/л, в частности от 350 до 400 мОсм/л.

В одном варианте осуществления изобретения нейтрализующий раствор имеет осмолярность, которая менее чем на 200 мОсм/л выше или ниже, чем осмолярность смеси, содержащей везикулы, содержащие буфер (т.е., раствор везикул, содержащих буфер), в частности менее чем на 150 мОсм/л выше или ниже, в частности менее чем на 100 мОсм/л выше или ниже, в частности менее чем на 50 мОсм/л выше или ниже, в частности, менее чем на 20 мОсм/л выше или ниже, в частности менее чем на 10 мОсм/л вше или ниже. В одном варианте осуществления изобретения разница осмолярности между нейтрализующим раствором и смесью, содержащей везикулы, содержащие буфер, составляет от 1 мОсм/л до 200 мОсм/л, в частности от 10 мОсм/л до 150 мОсм/л, в частности от 20 мОсм/л до 100 мОсм/л, в частности от 30 мОсм/л до 80 мОсм/л, в частности от 40 мОсм/л до 60 мОсм/л.

В одном варианте осуществления изобретения осмолярность гиперосмотического буфера равна или выше чем 250 мОсм/л, в частности равна или выше чем 300 мОсм/л, в частности равна или выше чем 350 мОсм/л, в частности равна или выше чем 400 мОсм/л, в частности равна или выше чем 450 мОсм/л, в частности равна или выше чем 500 мОсм/л, в частности равна или выше чем 550 мОсм/л, в частности равна или выше чем 600 мОсм/л, в частности равна или выше чем 700 мОсм/л, в частности равна или выше чем 800 мОсм/л, в частности равна или выше чем 900 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1000 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1100 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1200 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1300 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1400 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1500 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1600 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1700 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1800 мОсм/л, в частности равна или выше чем 1900 мОсм/л, в частности равна или выше чем 2000 мОсм/л. В одном варианте осуществления изобретения осмолярность находится в диапазоне от 250 мОсм/л до 2000 мОсм/л или в диапазоне, составленном из любой из вышеупомянутых осмолярностей (например, от 300 мОсм/л до 1400 мОсм/л и др.).

В одном варианте осуществления изобретения смесь водной среды и основного или кислого буфера, в которой везикулы, наполненные буфером, суспендируют в конце стадии b), имеют осмолярность по меньшей мере 200 мОсм/л, в частности по меньшей мере 220 мОсм/л, в частности по меньшей мере 250 мОсм/л, в частности по меньшей мере 300 мОсм/л, в частности по меньшей мере 350 мОсм/л, в частности по меньшей мере 400 мОсм/л, в частности по меньшей мере 450 мОсм/л, в частности по меньшей мере 500 мОсм/л, в частности по меньшей мере 550 мОсм/л. В одном варианте осуществления изобретения осмолярность находится в диапазоне от 200 мОсм/л до 550 мОсм/л или в диапазоне, составленном из любой из вышеупомянутых осмолярностей (например, от 220 мОсм/л до 500 мОсм/л и др.).

В одном варианте осуществления изобретения нейтрализующий раствор имеет состав, который действует, не разрушая везикулы, наполненные буфером, так чтобы не дестабилизировать такие везикулы. Он может содержать нейтрализующие варианты (основные или кислые, такие как слабые основания или слабые кислоты), а также химические средства, используемые для регуляции осмолярности и/или обеспечения физиологической функции. Было обнаружено, что добавление глицерина и трис((гидроксиметил)аминометана) (TRIS) для нейтрализации раствора является особенно интересным, поскольку это позволяет включать более высокие концентрации солей кальция. Соли кальция могут быть добавлены в процесс получения для противодействия антикоагулянтным эффектам некоторых слабых кислот (например, лимонной кислоты). Особенно важно, что везикулы должны использоваться в применении in vivo. Гидроксид натрия, соли натрия (как NaCl), соли магния, соли лактата, глицерин, икодекстрин, глюкоза, сорбит, фруктоза, аминокислоты или ксилит также могут быть использованы как ингредиенты для нейтрализующего раствора.

В одном варианте осуществления изобретения значение pH суспензионного буфера, содержащего везикулы с трансмембранным градиентом рН, находится в диапазоне от 5,5 до 8,5, в частности от 6,0 до 8,0, в частности от 6,5 до 7,7, в частности от 6,8 до 7,5, в частности от 7,0 до 7,4. Следовательно, суспензионный буфер может иметь физиологическое значение pH.

В одном варианте осуществления изобретения водная среда не является ни кислой, ни основной, а имеет значение pH около 7, например, в диапазоне от 6,0 до 7,5, в частности от 6,1 до 7,4, в частности от 6,2 до 7,3, в частности от 6,3 до 7,2, в частности от 6,4 до 7,1, в частности от 6,5 до 7,3, в частности от 6,6 до 7,3, в частности от 6,7 до 7,3, в частности от 6,8 до 7,3, в частности от 6,9 до 7,1, в частности от 6,95 до 7,01, в частности значение pH 7,0. Следовательно, водная среда также может быть названа, как нейтральная водная среда.

В одном варианте осуществления изобретения водную среду выбирают из группы, состоящей из воды, водных растворов органических солей, водных растворов неорганических солей, водных растворов органических веществ и их комбинаций.

В одном варианте осуществления изобретения водную среду выбирают из группы, состоящей из водных растворов органических солей, имеющих значение pH около 7, водных растворов неорганических солей, имеющих значение pH около 7, водных растворов органических веществ, имеющих значение pH около 7, воды и их комбинаций.

Вода может, например, быть дистиллированной водой, деионизированной водой, ультрачистой водой или любым другим видом очищенной воды. При использовании органических или неорганических солей или других органических соединений, такие соли или соединения присутствуют в водной среде, в одном варианте осуществления изобретения, в низкой концентрации так, чтобы поддерживать разницу осмолярности между водной средой и гиперосмотическим буфером, вызывая осмотический шок, чье различие является достаточно большим для индукции диффузии кислого или основного гиперосмотического буфера во внутренний отдел везикул.

Водная среда представляет собой среду, которая напоминает воду (в частности в отношении pH), но которая может содержать низкую концентрацию солей или соединений, например, для буферизации значения pH в нейтральном диапазоне. В одном варианте осуществления изобретения осмолярность водной среды находится в диапазоне от 0 мОсм/л до 49 мОсм/л, в частности от 5 мОсм/л до 45 мОсм/л, в частности от 10 мОсм/л до 40 мОсм/л, в частности от 15 мОсм/л до 35 мОсм/л, в частности от 20 мОсм/л до 30 мОсм/л, в частности от 25 мОсм/л до 28 мОсм/л.

В одном варианте осуществления изобретения матричное вещество выбирают из группы, состоящей из амфифильных жидкостей и амфифильных блок-сополимеров. Если используют амфифильные липиды, образуются липосомы в виде везикул. Подходящими липосомами являются многослойные везикулы (MLV), мелкие однослойные везикулы (SUV) и крупные однослойные везикулы (LUV).

Если используют амфифильные блок сополимеры, полимерсомы образуются в виде везикул. Подходящими амфифильными блок сополимерами являются линейные двухблочные или трехблочные сополимеры. Блок сополимеры могут иметь один блок, который является гидрофобным, и один или два других блока, которые являются гидрофильными. Комб-сополимеры также являются возможными, где основной блок такого комб-полимера может быть гидрофильным и комб-ветви могут быть гидрофобными. Дендронизованные блок сополимеры также являются возможными, где дендримерная часть таких сополимеров может быть гидрофильной. Во всех случаях, гидрофильные блоки могут состоять из поли(этиленгликоля) (PEG/PEO) или поли(2-этилоксазолина). Кроме того, гидрофобные блоки могут быть сделаны во всех случаях из поли(диметилсилоксана) (PDMS), поли(капролактона) (PCL), поли(лактида) (PLA) или поли(метилметакрилата) (PMMA).

В одном варианте осуществления изобретения матричным веществом является по меньшей мере один амфифильный липид, выбираемый из группы, состоящей из дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(PEG)-2000] (DSPE-PEG), холестерина, 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (POPC), и их комбинаций.

В одном аспекте настоящее заявленное изобретение также относится к везикулам с трансмембранным градиентом рН, которые могут быть получены методом в соответствии с вышеуказанными объяснениями. Такие везикулы с трансмембранным градиентом рН отличаются по стабильности от везикул, известных из предшествующей области техники. Это обусловлено структурными различиями, возникающими в результате специфического процесса производства, описанного выше. Следовательно, везикулы, полученные в соответствии с процессом, описанным выше, пока не известны из предшествующей области техники.

В одном аспекте заявлено применение таких везикул с трансмембранным градиентом рН в качестве средств для детоксикации in vitro или in vivo (у людей или животных, в частности, млекопитающих или грызунов). Они могут быть использованы для экстракции и связывания нежелательных веществ, таких как передозированные лекарственные средства и яды (или их метаболиты) или высоких количеств эндогенных метаболитов, которые могут приводить к интоксикации. Примеры веществ, которые могут быть поглощены везикулами с трансмембранным градиентом рН, представляют собой аммиак и пропионовую кислоту. Удаление аммиака и пропионовой кислоты из раствора (или in vivo или in vitro) приводит к детоксикации такого раствора от аммиака и/или пропионовой кислоты.

Все варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем описании, могут быть скомбинированы любым желаемым образом. Варианты осуществления описанного метода могут быть перенесены на описанные везикулы и описанное применение и наоборот.

Дополнительные аспекты и подробности настоящего изобретения будут объяснены в отношении чертежей и следующих примеров. В чертежах:

Фиг. 1 показаны следы ВЭЖХ-заряд аэрозольного детектора (CAD) варианта осуществления липосомальной водной суспензии до стерилизации паром (верхняя панель) или после стерилизации паром (нижняя панель); и

Фиг. 2 показана относительная концентрация липидов варианта осуществления липосом до и после стерилизации паром.

Пример 1

Композиция липосом. Липосомы, состоящие из дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC, Lipoid), холестерина (Sigma-Aldrich) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(PEG)-2000] (DSPE-PEG, Lipoid) в 85:14:1 моль% получали путем метода гидратации пленки. 1685 мг DPPC, 146 мг холестерина и 75 мг DSPE-PEG совместно растворяли в 10 мл дихлорметана:метанола 95:5% об/об. Органический растворитель впоследствии удаляли ротационным выпариванием и липидную пленку держали в вакууме в течение ночи. Высушенную пленку гидратировали с помощью 27 мл ультрачистой воды (концентрация липидов=100 мМ) при нагревании и медленном перемешивании 45 мин при 56°C и наконец стерилизовали в герметичных бутылях путем автоклавирования 20 мин при 121°C.

Стабильность. Липосомы подвергали стерилизации паром в автоклаве для оценки их деградации применяемым нагреванием. Известно, что липосомы, заполненные кислотой или основанием, подвергаются кислому или основному гидролизу, соответственно. Настоящие полученные липосомы абсолютно не разрушаются вследствие стерилизации паром.

Как показано на фиг. 1, следы ВЭЖХ-заряд аэрозольного детектора (CAD) липосомальной водной суспензии до стерилизации паром (верхняя панель фиг. 1) и после стерилизации паром (нижняя панель фиг. 1) перекрывались.

Такие результаты подтверждались оценкой относительной концентрации липидов липосом. Как может быть видно на фиг. 2, относительная концентрация липидов оставалась стабильной после стерилизации паром по сравнению с относительной концентрацией липидов до стерилизации паром. Если наблюдали гидролиз, концентрация липидов снижалась.

Осмотический шок. Полученные таким образом липосомы инкубировали 30 мин с 27 мл цитратного буфера 400 мМ (pH 2, 700 мОсм/л), содержащего лимонную кислоту (моногидрат лимонной кислоты) 290 мМ, цитрат кальция (трехосновный тетрагидрат цитрата кальция) 55 мМ и HCl 80 мМ. Инкубацию проводили при орбитальном встряхивании, при комнатной температуре.

Создание градиента. Трансмембранный градиент рН получали путем нейтрализации внешней кислой среды с помощью 106 мл нейтрализующего раствора (pH=10,6, 410 мОсм/л), состоящего из Tris (трис(гидроксиметил)аминометана, Panreac Applichem) 280 мМ и хлорида кальция (дегидрат хлорида кальция, Merck Millipore) 50 мМ. Полученную композицию липосом 16,9 мМ, pH 7,4, 312 мОсм/л использовали для исследования потребления аммиака in vitro.

Потребление аммиака in vitro. Параллельно диффузоры (PermGear), выдержанные при 37°C, использовали для отслеживания потребления аммиака в HEPES-буферном растворе (20 мМ, 300 мОсм/л). Липосомы физически выделяли в одной стороне двухкамерной системы при помощи поликарбонатной мембраны (размер пор=100 нм, Steriltech). Концентрации липосом и аммиака в диффузорах составили 4,2 и 1,5 мМ, соответственно. В заданное время аликвоты 50 мкл забирали из отдела без липосом и концентрацию аммиака оценивали ферментным анализом (Ammonia enzymatic kit, Sigma Aldrich). Потребление аммиака количественно оценивали посредством следующих выражений (Выр. 1 и 2):

[Выр.1][Выр.2]

Через 5 ч инкубации потребление аммиака, рассчитанное по выр. 2, составило 82±5%.

ПРИМЕР 2

Композиция липосом. Липосомы, состоящие из DPPC, холестерина и DSPE-PEG, получали и стерилизовали, как описано выше (пример 1).

Осмотический шок. Полученные таким образом липосомы инкубировали 30 мин с 13,5 мл цитратного буфера 600 мМ (pH 2, 1040 мОсм/л), содержащего лимонную кислоту 490 мМ, цитрат кальция 55 мМ, хлорид натрия (Fischer Scientific) 125 мМ и HCl 135 мМ. Инкубацию проводили при орбитальном встряхивании, при комнатной температуре.

Создание градиента. Трансмембранный градиент рН получали путем разведения липосом 119,5 мл нейтрализующего раствора (pH 10,6, 440 мОсм/л), состоящего из Tris 160 мМ, хлорида кальция 35 мМ и хлорида натрия 100 мМ. Конечную композицию липосом 16,9 мМ, pH 7,5 использовали для исследования потребления аммиака in vitro.

Потребление аммиака in vitro. Потребление аммиака in vitro изучали посредством параллельных диффузоров, как описано выше (Пример 1). Через 5 ч инкубации среднее потребление аммиака в липосомах составило 92±8%.

ПРИМЕР 3

Композиция липосом. Липосомы, состоящие из DPPC, холестерина и DSPE-PEG, получали и стерилизовали, как описано выше (Пример 1).

Осмотический шок. Осмотический шок проводили путем инкубации липосом, как описано в примере 2.

Создание градиента. Трансмембранный градиент pH получали путем разведения липосом 119,5 мл нейтрализующего раствора (pH=12,7, 480 мОсм/л), состоящего из гидроксида натрия 155 мМ, глицерина, 210 мМ, хлорида кальция 20 мМ и Tris 20 мМ. Полученная композиция липосом 16,9 мМ имела pH 6 и 341 мОсм/л.

Потребление аммиака in vitro. Потребление аммиака in vitro изучали посредством параллельных диффузоров, как описано выше (пример 1). Среднее потребление аммиака через 5 ч инкубации составило 96±3%.

ПРИМЕР 4

Композиция липосом. Липосомы, состоящие из 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (POPC, Lipoid), холестерина и =DSPE-PEG в 54:45:1 моль%, получали методом гидратации пленки. 1108 мг POPC, 469 мг холестерина и 75 мг DSPE-PEG совместно растворяли в 10 мл дихлорметана:метанола 95:5% об/об. Органический растворитель впоследствии удаляли ротационным выпариванием и липидную пленку хранили в вакууме в течение ночи. Высушенную пленку гидратировали с помощью 27 мл ультрачистой воды (концентрация липидов=100 мМ) при нагревании и медленном перемешивании в течение 30 мин при 56°C и наконец стерилизовали в герметичных бутылях посредством автоклавирования 20 мин при 121°C.

Осмотический шок. Осмотический шок проводили путем инкубации липосом, как описано в примере 2.

Создание градиента. Трансмембранный градиент рН получали путем разведения липосом 119,5 мл нейтрализующего раствора (pH=12,7, 480 мОсм/л), состоящего из гидроксида натрия 150 мМ, глицерина 220 мМ, хлорида кальция 10 мМ и Tris 20 мМ. Полученная композиция липосом 16,9 мМ имела pH 7,4 и 350 мОсм/л.

Потребление аммиака in vitro. Потребление аммиака in vitro изучали посредством параллельных диффузоров, как описано выше (пример 1). После 5 ч инкубации потребление аммиака составило 53,5±8,7%.

ПРИМЕР 5

Композиция липосом. Липосомы, состоящие из DPPC, холестерина и DSPE-PEG, получали и стерилизовали, как описано выше (Пример 1).

Осмотический шок. Липосомы инкубировали с 13,5 мл буфера ацетата кальция (pH 10, 1050 мОсм/л) 30 мин при орбитальном встряхивании, при комнатной температуре. Буфер содержал ацетат кальция 350 мМ, гидроксид натрия 0,75 мМ.

Создание градиента. Липосомы разводили 33 мл раствора (pH=6,7, 380 мОсм/л), содержащего глицерин 230 мМ, хлорид натрия 50 мМ, Tris 20 мМ и уксусную кислоту 20 мМ. Полученную композицию липосом 30 мМ, pH 7, 335 мОсм/л использовали для исследований потребления пропионовой кислоты in vitro.

Потребление пропионовой кислоты in vitro. Параллельные диффузоры, выдержанные при 37°C, использовали для отслеживания потребления in vitro раствора пропионовой кислоты, меченной 1% [1-14C] пропионовой кислоты (50 мКи/ммоль, BIOTREND Chemikalien). Липосомы физически выделяли в одной стороне двухкамерной системы посредством поликарбонатной мембраны (размер отверстий=100 нм). Концентрации липосом и пропионовой кислоты в диффузорах составили 4,2 и 1,5 мМ, соответственно, после разведения HEPES-буферным солевым раствором (20 мМ, 300 мОсм/л). В заданные временные интервалы (6-30 мин, 1-2-3-4-5 ч) аликвоты по 50 мкл забирали из отдела без липосом, смешивали с 3 мл коктейля Ultima Gold (Perking Elmer) и в каждом образце оценивали радиоактивность (бета-распад) посредством подсчета сцинтилляций (LS 6500 Scintillation Counter, Beckman). Концентрацию метаболитов определяли путем сравнения распада с калибровочной кривой, чью линейность подтверждали в диапазоне от 31 мкМ до 2 мМ. Потребление пропионовой кислоты (PA) оценивали количественно посредством следующих выражений (Выр. 3 и 4):

[Выр. 3]

[Выр. 4]

После 5 ч инкубации потребление пропионовой кислоты, рассчитанное по выр. 4, составило 25±3%.

ПРИМЕР 6

Композиция липосом. Липосомы, состоящие из DPPC, холестерина и DSPE-PEG, получали и стерилизовали, как описано выше (Пример 1).

Осмотический шок. Полученные таким образом липосомы инкубировали 30 мин с 13,5 мл цитратного буфера 600 мМ (pH 2, 1050 мОсм/л), содержащего лимонную кислоту 490 мМ, цитрат кальция 15 мМ, цитрат натрия (Sigma Aldrich) 74 мМ, цитрат магния (Applichem Panreac) 6 мМ, хлорид натрия 35 мМ и HCl 178 мМ. Инкубацию проводили при орбитальном встряхивании при комнатной температуре.

Создание градиента. Трансмембранный градиент рН получали путем разведения липосом с помощью 279,5 мл нейтрализующего раствора (pH=12,6, 360 мОсм/л), состоящего из гидроксида натрия 43 мМ, ксилита (ABCR Gmbh) 260 мМ, хлорида кальция 1 мМ, Tris 20 mM, хлорида натрия 15 мМ. Полученную композицию липосом 8,4 мМ, pH 6,4, 350 мОсм/л использовали для исследования потребления аммиака in vivo.

Потребление аммиака in vivo. Шести взрослым самцам крыс Sprague-Dawley (весом около 300 г; Charles River Laboratories) позволяли 5 дней акклиматизироваться к окружению; они имели доступ к пище и воде по потребности, и они следовали циклу 12-ч день/ночь. В день эксперимента свежеприготовленный диализирующий раствор 16,7 мМ предварительно нагревали до 37°C и медленно вводили (60 мл/кг) в перитонеальную полость крыс, находящихся под анестезией изофлураном (2,5% в 0,8 мл/мин тока кислорода). Инстилляцию проводили с помощью гиподермальной иглы 20 размера. В заданное время, крыс коротко анестезировали (с использованием ингаляции изофлурана, в сходных условиях), и около 400 мкл диализата забирали посредством стерильной пункции брюшной полости с помощью силиконового катетера 22-размера (Venflon; Becton Dickinson). Аликвоты немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при-80°C для дополнительного определения содержания аммиака для ферментного анализа (Enzymatic Ammonia Assay, Sigma Aldrich). До запуска анализа, 100 мкл каждого образца разводили 50 мкл Triton-X-100 (3%) и обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Эксперимент на животных проводили в соответствии с методиками и протоколами, одобренными кантональными ветеринарными органами (Kantonales Veterinaramt Zurich). В конце эксперимента животных умерщвляли асфиксией диоксидом углерода с последующей торакотомией. Средняя концентрация аммиака, обнаруженная в образцах диализата после 4 ч обработки, составила 1,25±0,2 мМ.

1. Способ получения везикул с трансмембранным градиентом рН, включающий стадии:

а) получения везикул, состоящих из по меньшей мере одного матричного вещества в водной среде, имеющей осмолярность не более чем 200 мОсм/л, где матричное вещество выбирают из группы, состоящей из амфифильных липидов, образующих липосомы,

b) смешивания везикул с основным или кислым буфером, имеющим осмолярность, составляющую по меньшей мере на 200 мОсм/л выше, чем осмолярность водной среды стадии a), для применения осмотического шока к везикулам и для получения везикул, наполненных буфером и

с) разведения смеси водной среды и основного или кислого буфера, содержащего везикулы, наполненные буфером, путем добавления нейтрализующего раствора для получения везикул с трансмембранным градиентом рН, суспендированных в суспензионном буфере, где суспензионный буфер отличается от основного или кислого буфера по значению pH.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что везикулы, полученные на стадии a), стерилизуют для получения стерилизованных везикул перед осуществлением стадии b) с такими стерилизованными везикулами.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что везикулы, полученные на стадии а), стерилизуют автоклавированием.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что везикулы хранят до осуществления стадии b).

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию b) осуществляют при температуре, которая ниже, чем температура перехода фаз матричного вещества.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию b) осуществляют при температуре не более чем 35°C.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что осмолярность основного или кислого буфера составляет по меньшей мере 250 мОсм/л.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что значение рН водной среды на стадии а) находится в диапазоне от 6,0 до 7,5.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что осмолярность водной среды на стадии а) равна или меньше чем 50 мОсм/л.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что смесь водной среды и основного или кислого буфера, в котором суспендированы везикулы, наполненные буфером, в конце стадии b) имеет осмолярность по меньшей мере 200 мОсм/л.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что нейтрализующий раствор имеет осмолярность от 250 мОсм/л до 550 мОсм/л.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что нейтрализующий раствор включает по меньшей мере одно вещество, выбираемое из группы, состоящей из глицерина, ксилита, TRIS, глюкозы, солей магния, гидроксида натрия, солей натрия и солей кальция.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что значение pH суспензионного буфера, содержащего везикулы с трансмембранным градиентом рН, находится в диапазоне от 5,5 до 8,5.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что водную среду выбирают из группы, состоящей из воды, водных растворов органических солей, водных растворов неорганических солей, водных растворов органических веществ и их комбинаций.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что матричное вещество выбирают из группы, состоящей из дипальмитоилфосфатидилхолина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(PEG)-2000], холестерина и 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина и их комбинаций.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства, обладающего антиоксидантной, гепатозащитной и желчегонной активностью. Для этого растительный материал, состоящий из измельченной до 1 мм растительной композиции (шиповника плоды - 30 частей, кориандра посевного плоды - 10 частей, ноготков лекарственных цветки - 25 частей, девясила корневища и корни - 25 частей, одуванчика корни - 10 частей), экстрагируют двухкратно 70% спиртом и двухкратно водой при температуре 70°С при отношении 1 мас.

Изобретение относится к спортивной медицине и раскрывает способ повышения работоспособности организма при физической нагрузке. Способ включает сочетанное применение биопродуктов, выбранных из препаратов «Билар» и «Мультикомплекса MDX», в специально подобранных дозировках и воздействие низкоинтенсивным лазерным облучением с длиной волны 0,62-0,68 мкм, импульсной мощностью 3,5 Вт и частотой импульсов 1500 Гц, с экспозицией 8 минут чрескожно на область кубитальной вены.

Изобретение относится к медицине и фармации. Предложено применение гептапептида Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакса) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.

Изобретение относится к медицине и фармакологии, а именно к применению О-(((4-гидрокси-3,5-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-экзо-2-ил)бензил)окси)этил)-О-(2-гидроксиэтил)-(1→4)-α-D-глюкана с содержанием фрагментов 2,6-диизоборнил-4-метиленфенола от 0,5 до 6,0 мас.% в качестве нейропротекторного средства.

Изобретение относится к области медицинской радиологии и представляет собой способ защиты животных от высокодозового ионизирующего излучения, заключающийся в том, что мышам внутривенно вводят одноразово биологический препарат, отличающийся тем, что в качестве биологического препарата, который одноразово вводят внутривенно в период от 30 до 60 минут до 12 суток до облучения высокодозовым ионизирующим излучением 9,4 Гр, используют или препарат суммарной РНК дрожжей S.

Изобретение относится к химии и медицине, а именно к новым катионно-анионным комплексам палладия. Комплексы содержат протонированный катион и полиядерный анион палладия.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к радиационной медицине, и может быть использована для профилактики и лечения острой лучевой болезни (ОЛБ). Первый вариант способа включает введение липосомального препарата, содержащего рекомбинантный альфа-протеин человека (рчАФП) в количестве 0,1-1,0 мг/мл внутривенно однократно сразу после облучения в дозе до 10 мг/кг массы тела в пересчете на рчАФП или в той же дозе по схеме: сразу после облучения и через 1, 3, 5, 7 суток после облучения.

Изобретение относится к анионному комплексному соединению двухвалентного цинка, замещенного уксусной кислотой и 3.3'-диселенодипропионовой кислотой, а именно к диацетато(3.3'-диселенодипропионовая кислота)цинк(II) динатрийпентагидрату формулы:Na2[Zn(II)L2L']5H2O,где L - CH3COOH, L'2 - HOOCCH2CH2SeSeCH2CH2OOH.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу повышения устойчивости организма к развитию вредных эффектов комбинированного действия на него наночастиц оксидов алюминия, титана и кремния.
Изобретение относится к области медицины. Предложено применение комбинации пирогенала в дозе 12,5 мкг/кг внутримышечно за 1 час до погружения и реланиума в дозе 5 мг/кг с натрия оксибутиратом в дозе 500 мг/кг внутрижелудочно за 30 минут до погружения в холодную воду в качестве средства, снижающего летальность и ускоряющего восстановление температуры тела после прекращения охлаждения в воде.

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики. Первый объект представляет собой спрессованную таблетку, покрытую оболочкой, с отсроченным высвобождением активного ингредиента, содержащую: (а) ядро с одним или несколькими активными ингредиентами и (б) эродируемый барьер с отсроченным высвобождением, окружающий ядро и включающий воск и две или более фракции L-HPC, при этом воск и L-HPC содержатся в весовом отношении "воск:L-НРС" от 30%:70% до 70%:30%.

Изобретение относится к пероральной лекарственной форме препарата в капсулах, эффективной против ВНО (вируса натуральной оспы) и других патогенных для человека и животных ортопоксвирусов, и может быть использовано в области фармацевтики, вирусологии, медицины и ветеринарии.

Изобретение относится к способу лечения остеоартрита у субъекта, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества низкомолекулярного сенолитического агента, который селективно убивает стареющие клетки по сравнению с нестареющими клетками.

Представлена лекарственная форма, содержащая эзомепразол или его фармацевтически приемлемую соль для лечения желудочных и рефлюксных заболеваний пищевода. Лекарственная форма содержит ядро, содержащее эзомепразол, слой эндотелиального покрытия, сформированный на ядре, и слой контролирующего высвобождение покрытия, сформированный на слое эндотелиального покрытия.

Представлена фармацевтическая композиция для наружного применения, содержащая S-флурбипрофен или его фармацевтически приемлемую соль, мятное масло и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из сложного эфира, имеющего две среднецепочечные жирные кислоты, связанные с пропиленгликолем, и сложного эфира, имеющего три среднецепочечные жирные кислоты, связанные с глицерином.
Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности и к медицине, а именно к способу нейтрализации избытка желудочной кислоты у человека или низшего животного и к способу лечения расстройства желудочно-кишечного тракта у человека или низшего животного.

Описана фармацевтическая композиция ибупрофена натрия в форме таблетки или каплеты. Фармацевтическая композиция содержит ядро, состоящее из а) гранул, состоящих из дигидрата ибупрофена натрия, маннита и скользящего вещества.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической дозированной форме для применения на слизистой оболочке пищевода, носоглоточной, буккальной, гастроинтестинальной, ректальной или вагинальной слизистой оболочке.

Описана фармацевтическая композиция для применения при лечении атопического дерматита. Фармацевтическая композиция содержит дигомогамма-линоленовую кислоту (DGLA) или алкиловый эфир DGLA, эйкозатетраеновую кислоту, эйкозатриеновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту и эйкозадиеновую кислоту, инкапсулированные в капсульную оболочку.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к инстилляции (капельному введению) лекарства и, конкретно, к устройству, облегчающему введение жидкого или аэрозольного медикамента (в частности легочного сурфактанта) в легкое посредством тонкого катетера, к системе для доставки распыляемого медикамента в зону глотки или заглоточную зону пациента посредством катетера, позиционируемого посредством вышеупомянутого устройства, к способу использования вышеупомянутого устройства для позиционирования катетера для введения медикамента, и к комплекту для доставки распыляемого медикамента в зону глотки или заглоточную зону пациента.

Изобретение относится к косметологии и касается косметической маски-пленки для ухода за кожей лица, включающей гелеобразующий агент альгинат натрия, функциональные добавки и воду, где маска дополнительно содержит пленкообразователи карбоксиметилцеллюлозу, поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль ПЭГ-4000 и порошкообразный наполнитель со следующими витаминами в липосомах: витамин А или витамин Е, или витамин А и витамин Е, или витамин Е и витамин С, или ресвератрол и витамин Е, или витамин А и витамин Е, или витамин Р, витамин С и витамин Е.

Изобретение относится к способу получения везикул с трансмембранным градиентом рН. Указанный способ характеризуется следующими стадиями: a) получения везикул, состоящих из по меньшей мере одного матричного вещества в водной среде, имеющей осмолярность не более чем 200 мОсмл, где матричное вещество выбирают из группы, состоящей из амфифильных липидов, образующих липосомы, b) смешивания везикул с основным или кислым буфером, имеющим осмолярность, составляющую по меньшей мере на 200 мОсмл выше, чем осмолярность водной среды стадии a), для применения осмотического шока к везикулам и для получения везикул, наполненных буфером, и c) разведения смеси водной среды и основного или кислого буфера, содержащего везикулы, наполненные буфером, путем добавления нейтрализующего раствора для получения везикул с трансмембранным градиентом рН, суспендированных в суспензионном буфере, где суспензионный буфер отличается от основного или кислого буфера по значению рН. Способ по изобретению обеспечивает стабильность везикул, полученных после стадии а), при стерилизации автоклавированием. 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 пр.

Наверх