Способ размножения in vitro штамбовых сортов малины

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, включающий в себя чередование культуральных сред и условий освещения на этапе размножения с использованием разных фитогормонов: 6-Бензиламинопурина, зеатина и 6-Бензиламинопурина и индолилмасляной кислоты; и интенсивности освещения 1500-2000 люкс и 800-1000 люкс. Изобретение позволяет значительно повысить эффективность размножения микрорастений, что обеспечивает повышение коэффициента мультипликации, а также влияет на укоренение, увеличивая частоту укоренения в условиях in vitro. 2 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности садоводству, и может быть использовано для повышения эффективности культивирования и размножения штамбовых сортов малины.

Современные достижения в области биотехнологии растений активно применяются для получения оздоровленного, физиологически выровненного посадочного материала в количестве достаточном для производственного использования.

Штамбовые сорта малины являются одними из последних разработок селекции в конце XX века. Они характеризуются утолщенным основным побегом, от которого отрастают боковые, в основном не требуют обрезки и подвязки, практически не формирует корневых побегов. Такие особенности штамбовых малин сделали их очень привлекательными и экономически выгодными для потребителя. Однако эти же особенности приводят к тому, что данные сорта плохо размножаются как в условиях ex vitro так и в условиях in vitro и относятся к трудноразмножаемым. Решением этой проблемы является размножение с использованием микроклонального размножения. Однако и при микроклональном размножении проблема подбора in vitro условий для эффективного размножения остается актуальной. В настоящий момент не представлено эффективного способа размножения штамбовых сортов малин.

Известен способ эффективного размножения сортов малины «Размножение in vitro ремонтантных сортов малины» (Кульханова Д.С., Плаксина Т.В., Бородулина И.Д. Размножение in vitro ремонтантных сортов малины // Биологические науки, 2012, с. 42-45), где указывается, что высокие содержания цитикининов способствуют лучшему размножению малин (1,0 мкМ и 5,0 мкМ 6-БАП). Однако в статье описанные сорта малин не являются штамбовыми, при этом максимальный коэффициент мультипликации указывается 1,8-2,3, что является достаточно низким и экономически не эффективными.

Известна так же работа «Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины» (Сковородников Д.Н. Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины: автореф. дис. канд сельскохозяйственных наук. Брянская ГСХА. Брянск, 2004), в которой указано, что на этапе размножения использовались цитокинины 6-БАП в концентрации 2 мг/л и TDZ в концентрации 0,05, 0,1 и 0.2 мг/л. Однако отмечено, что коэффициент мультипликации у трудноразмножаемых форм не превышал 1,9, что является низким коэффициентом. При этом не указано, являлись ли трудноразмножаемые формы штамбовыми или нет, так же нет четкого описания фенотипических характеристик.

Наиболее близким техническим решением из описанных является «Клональное размножение растений красной малины (Rubusidaeus L.) in vitro» (Оразбаева Г.К., Майсупова И.Л., Хасанов В.Т., Швидченко В.К. Клональное размножение растений красной малины (Rubusidaeus L.) in vitro // Вестник науки КазАТУ им. С. Сейфуллина. - 2012, - №1 (72), с. 1-10). В данной работе указывается, что этап размножения идет с использованием среды MS (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) с добавлением никотиновой кислоты 0,5 мг/л, тиамина 1 мг/л, пиридоксина 0,5 мг/л, глицина 2,0 мг/л, сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л и с концентрацией гормонов 6-Бензиламинопурин 0,5 мг/л и индолилмасляную кислоту 0,1 мг/л. Интенсивность освещения для инкубации 3000-5000 люкс. При этом достигается высокий коэффициент мультипликации - 6,1. Однако все исследуемые сорта не относятся к штамбовым и являются предрасположенными к высокому коэффициенту мультипликации в условиях in vitro.

Целью предлагаемого изобретения является подбор оптимальных условий для размножения штамбовых сортов малины в условиях in vitro для получения качественного посадочного материала.

Поставленная цель достигается за счет того, что используется чередование пассажей с использованием разного сочетания в среде для размножения фитогормонов: 6-Бензиламинопурина, зеатина и 6-Бензиламинопурина и индолилмасляной кислоты и разных режимов освещения 1500-2000 люкс и 800-1000 люкс.

Суть изобретения состоит в том, предлагается цикл из четырех пассажей, который предполагает, что в питательную среду для размножения MS (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) с добавлением никотиновой кислоты 0,5 мг/л, глицина 2,0 мг/л, аскорбиновой кислоты 55,7 мг/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, агар-агара 10,8 г/л, сахарозы 30 г/л, для первых двух пассажей добавляются фитогормоны 6-Бензиламинопурин 0,7 мг/л и зеатин 0,1 мг/л, при освещении 1500-2000 люкс, а для третьего и четвертого пассажей добавляются 6-Бензиламинопурин 0,6 мг/л и индолилмасляную кислоту 0,1 мг/л при освещении 800-1000 люкс. Длительность каждого пассажа 4-6 недель в зависимости от сорта. При переносе растений на свежую питательную среду первые два пассажа, предпочтение отдается побегам, развившимся из пазушных почек, поскольку они характеризуются большей степенью ювенильности, а при переносе растений последующие третий и четвертый пассажи предпочтение отдается апикальным побегам, как наиболее крепким.

Анализ известных способов клонального микроразмножения растений, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует условию патентоспособности изобретения - «новизна»

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. В нестерильных условиях готовится питательная среда. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, инозитола, витаминов, объем доводится дистиллированной водой, рН 5,6. В колбы добавляются навески агар-агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 атм. (= 1 изб. атм.) в течение 20 минут. В остывшую до 55°С среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы регуляторов роста 6-Бензиламинопурин 0,7 мг/л и зеатин 0,1 мг/л (Среда 1) и 6-Бензиламинопурин 0,6 мг/л и индолилмасляную кислоту 0,1 мг/л (Среда 2). Полученный раствор разливается по стерильным стеклянным культуральным сосудам объемом 330 мл.

2. В стерильные сосуды со Средой 1 переносятся микропобеги размером 2-3 см по 12 шт. Все манипуляции с растительным материалом производится в стерильных условиях ламинар-бокса. В течение 4-6 недель сосуды с мультиплицирующими растениями инкубируются при люминесцентном освещении на 1500-2000 люкс. Далее микропобеги заново пересаживаются на свежую Среду 1 для размножения и также инкубируются в течение 4-6 недель при люминесцентном освещении на 1500-2000 люкс. Коэффициент мультипликации рассчитывается как среднее количество микропобегов, полученное с одного конгломерата через 4 недели после каждого пассажа.

3. Далее в стерильные сосуды со Средой 2 переносятся микропобеги со Среды 1 размером 1,5-2 см по 14 шт. В течение 4-6 недель сосуды с мультиплицирующими растениями инкубируют при люминесцентном освещении на 800-1000 люкс. Далее растения пересаживают также на Среду 2 для размножения и инкубируются при люминесцентном освещении на 800-1000 люкс. После 5 недель повторной инкубации на Среде 2 микропобеги переносят или в условия укоренения или на Среду 1 и интенсивность освещения 1500-2000 люкс для повторного прохождения цикла размножения. Оценивался коэффициент мультипликации через 4 недели после каждого пассажа

В таблицах 1 и 2 представлены результаты исследований по влиянию смены среды и интенсивности освещения на этапе размножения штамбовых сортов малины на эффективность размножения в условиях in vitro.

Штамбовые сорта малин из-за своих биологических особенностей имеют очень низкий коэффициент размножения. Вероятно, это связано с изменением синтеза цитокининов. Однако введение слишком большого количества цитокининов, а также постоянное культивирование на среде с их содержанием приводит к образованию ювенильных побегов, ткань которых очень подвержена обводнению. Такие растения не дают хороших полноценных побегов, слабо укореняются и чаще всего погибают.

Внесение ауксинов в среду наряду с цитокининами запускает механизмы старения, что приводит к образованию полноценных мультиплицирующих побегов, которые имеют большую частоту укоренения. При этом экзогенные ауксины при воздействии света разлагаются, поэтому для лучшего их воздействия необходимо снижение интенсивности освещения, которое будет оптимальным и для роста растений. Известно, что интенсивность освещения 800-1000 люкс не оказывает пагубного влияния на рост и развитие растений.

Наши исследования показывают, что использование контрольных условий: среды с ауксинами и цитокининами, а также интенсивности освещения 3000-5000 люкс для длительной мультипликации, как предлагается в наиболее близком техническом решении ведет к постепенному снижению коэффициента мультипликации (таблица 1). А при использовании разработанного нами способа размножения наблюдается увеличение коэффициента мультипликации (таблица 2).

Выяснено что на среде содержащей только цитокинины и при высокой степени освещения (Среда 1) после второго пассажа наблюдается снижение коэффициента мультипликации (таблица 2). Однако при внесении в среду ауксинов и цитокининов (Среда 2) и снижении интенсивности освещения наблюдается увеличение коэффициента мультипликации (таблица 2). При этом также постоянное культивирование на среде с ауксинами и цитокининами не представляется возможным, так как внесение ауксинов приводит к тому, что у растений увеличивается апикальное доминирование и коэффициент мультипликации падает (таблица 2). В этой связи необходимо чередование среды для культивирования с цитокининами и ауксины с цитокининами, так же интенсивность освещения, для более эффективного действия этих гормонов.

Преимуществом предложенного способа размножения является увеличение выхода качественных микропобегов на этапе размножения.

Способ эффективного размножения in vitro штамбовых сортов малины, включающий чередование четырех пассажей на питательной среде MS с добавлением никотиновой кислоты 0,5 мг/л, глицина 2,0 мг/л, аскорбиновой кислоты 55,7 мг/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, агар-агара 10,8 г/л, сахарозы 30 г/л, отличающийся тем, что первый и второй пассажи состав питательной среды дополнительно включал 6-Бензиламинопурин 0,7 мг/л и зеатин 0,1 мг/л (Среда 1) при интенсивности освещения 1500-2000 люкс, третий и четвертый пассажи состав питательной среды дополнительно включал 6-Бензиламинопурин 0,6 мг/л и индолилмасляную кислоту 0,1 мг/л (Среда 2) при интенсивности освещения 800-1000 люкс.