Способ количественного определения остаточного содержания стероидных гормонов в рыбе

Авторы патента:

Хотимченко Сергей Анатольевич (RU)

Багрянцева Ольга Викторовна (RU)

Соколов Илья Евгеньевич (RU)

Колобанов Алексей Иванович (RU)

Гурэу Зинаида Геннадиевна (RU)

G01N33/12 - мяса, рыбы

Владельцы патента RU 2776013:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи" (RU)

Изобретение относится к пищевой промышленности. Предложен способ количественного определения остаточного содержания стероидных гормонов - эстрона, дигидротестостерона, метилтестостерона и местанонолона в рыбе, заключающийся в гомогенизации мяса рыб, добавлении в образцы дистиллированной воды с их обработкой в ультразвуковой ванне для более полного извлечения гормонов из гомогенизатов, экстракции гормонов из образцов 1% раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле, очистке аликвоты селикагелем с привитыми октадецильными группами С₁₈ и анионообменным сорбентом на основе первичных и вторичных аминов PSA, дериватизации гормонов раствором гидроксиламина, упаривании образцов на роторном испарителе. Далее проводят перерастворение образцов в ацетонитриле, хроматографическое разделение с использованием хроматографической колонки 2,1×75 мм зернением 3,5 мкм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом С₁₈, в качестве градиента подвижной фазы используют смесь вода-метанол с добавлением 0,1% муравьиной кислоты. Затем проводят анализ содержания гормонов в образцах на тройном квадрупольном масс-детекторе с источником ионизации электроспрей в положительном режиме. Способ обеспечивает увеличение чувствительности метода определения. 3 ил., 4 табл., 3 пр.

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к области оценки безопасности пищевой продукции, а именно к методам количественного определения содержания в рыбе гормонов и может быть использовано в процессе экспертизы и государственного надзора за безопасностью рыбы.

Официально утвержденного способа определения стероидных гормонов в моллюсках в Российской Федерации в настоящее время нет.

Аналогом предлагаемого способа является метод определения метилтестостерона в рыбе {Cyprinus carpio). Этот способ заключается в предварительном удалении жира из тканей, добавлении фосфатного буфера, экстракции метил-трет-бутилового эфиром, твердофазной экстракции на колонке, заполненной обращено-фазовым сорбентом и последующим иммуноферментным анализом [Risto, U., Zehra, Н. М., Biljana, S.D., Elizabeta, D.S., Aleksandra, Т., & Velimir, S. (2013). Validation of screening method for determination of methyltestosterone in fish. Maced. Vet. Rev, 36, 19-23]. Недостатком способа является низкая чувствительность (564,43 нг/кг) и возможность определения в образцах рыбы только одного гормона - метилтестостерона.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является метод определения остаточного содержания гормонов в рыбе и рыбных продуктах (Tilapia, Rainbow trout, Salmon). Этот способ заключается в гомогенизации материала, экстракции гормонов ацетонитрилом, очистке органического раствора гексаном, твердофазной экстракцией с использованием картриджей, заполненных ионно-обменными (четвертичный аминный сорбент) и нормально-фазовыми сорбентами (синтетический аморфный силикат магния), хроматографическом разделении с использованием ВЭЖХ системы на колонке 2,0×150 мм зернением 5 мкм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом С8 в изократическом режиме на основе воды и ацетонитрила с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и последующем масс-спектрометрическом анализе с источником ионизации электроспреем в положительном режиме [Watson, L., Potter, R., Murphy, С, & Gibbs, R. (2015). The development and single-laboratory validation of a method for the determination of steroid residues in fish and fish products. Journal of AOAC International, 98(3), 580-587; https://doi.org/10.5740/jaoacint.14-281]. Недостатком способа являются использование сложной схемы пробоподготовки с применением картриджей, возможность определения только одного вида стероидного гормона, низкая чувствительность метода детектирования (от 0,05 до 25 нг/г).

Техническим результатом предлагаемого способа является увеличение чувствительности метода до 20 нг/кг за счет получения производных гормонов (оксимов) эстрона, дигидротестостерона, метилтестостерона и местанонолона, полученных путем дериватизации гидроксиламином и их определения в тканях рыб в положительном режиме ионизации по ионам [M+NH+H]⁺с использованием ВЭЖХ-МС/МС метода.

Указанный технический результат достигается гомогенизацией мяса рыб, добавлением в образцы дистиллированной воды и их обработкой в ультразвуковой ванне для более полного извлечения гормонов из гомогенизатов, экстракцией гормонов из образцов 1% раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле, очисткой аликвоты селикагелем с привитыми октадецильными группами С18 и анионообменным сорбентом на основе первичных и вторичных аминов PSA, дериватизацией гормонов раствором гидроксиламина, упариванием образцов на роторном испарителе, перерастворением образцов в ацетонитриле, хроматографическим разделением с использованием хроматографической колонки 2,1×75 мм зернением 3,5 мкм, заполненной обращено-фазовым сорбентом С18 при температуре 40°С, где в качестве градиента подвижной фазы используют смесь вода-метанол с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и последующим анализом содержания гормонов в образцах на тройном квадрупольном масс-детекторе с источником ионизации электроспрей в положительном режиме (ВЭЖХ-МС/МС анализ).

ОПИСАНИЕ СПОСОБА

Для приготовления калибровочных стандартов мясо рыб (радужная форель, карп, толстолобик), не содержащее гормоны в пределах обнаружения метода, гомогенизируют, добавляют стандартные растворы гормонов в ацетонитриле с перемешиванием в течение 1 минуты на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, повторно перемешивают в течение 1 минуты с последующим замораживанием. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 6 контрольных точек.

Для осуществления пробоподготовки навеску измельченного образца или калибровочного стандарта массой 5 г, помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³. Вносят 10 см³дистиллированной воды, перемешивают и помещают в ультразвуковую ванну на 10 минут. Добавляют 10 см³ 1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и перемешивают в течение 30 минут на лабораторном мультиротаторе. В пробу добавляют 1 г NaCl и 4 г MgSO₄. После добавления солей, раствор тщательно перемешивают в течение 5 минут. Затем пробу центрифугируют в течение 10 минут со скоростью 10000 g. Аликвоту экстракта объемом 6 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в центрифужную пробирку объемом 15 см³, содержащую 150 мг С18 и 150 мг PSA. Перемешивают в течение 1 минуты на перемешивающем устройстве типа «вортекс» и центрифугируют в течение 10 минут со скоростью 18000 g. Аликвоту экстракта объемом 5 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в остродонную колбу объемом 15 см³ и упаривают на роторном испарителе. После упаривания с помощью пипеточного дозатора помещают 0,5 см³ раствора гидроксиламина в метаноле с концентрацией 100 ммоль и перемешивают в течение 1 минуты на перемешивающем устройстве типа «вортекс». Дериватизацию проводят с помощью термостатируемого шейкера при температуре 40°С в течение 20 минут. Полученный раствор повторно упаривают на роторном испарителе, с помощью пипеточного дозатора помещают 0,1 см³ ацетонитрила и перемешивают в течение 1 минуты на перемешивающем устройстве типа «вортекс». Аликвоту экстракта объемом 0,06 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в полипропиленовую вставку для проведения ВЭЖХ-МС/МС анализа.

Для осуществления хроматографического анализа используют ВЭЖХ систему «Agilent 1200 Series» с хроматографической колонкой «Agilent ZORBAX XDB-C18 2.1×75 mm 3.5 μm» длиной 75 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненной обращенно-фазным сорбентом С18 с двойным энд-кэппированием, зернением 3,5 мкм, температура хроматографической колонки 40°С. В качестве градиента подвижной фазы используют смесь растворителей, включающую компонент А: раствор - 0,1% муравьиной кислоты в воде, и компонент В: раствор - 0,1% муравьиной кислоты в метаноле.

Для осуществления масс-спектрометрической детекции используют подключенный к выходу из хроматографической колонки тройной квадрупольный масс-спектрометр «Thermo Fisher Scientific TSQ Quantum Access МАХ». Параметры масс-спектрометрического детектора:

- Источник ионизации: электроспрей в положительном режиме ионизации (ESI+);

- Режим работы: детектирование проводится методом «регистрации множественных реакций» (MRM). Для гормонов измеряется сигнал двух фрагментных ионов (m/z). Первый, более интенсивный пик, служит для количественного определения концентрации гормонов в рыбе, второй используется для подтверждения правильности определения (Таблица 1);

- Напряжение на капилляре электроспрея (Spray Voltage): 3 кВ;

- Sheath Gas Pressure: 35 относительных единиц;

- Aux Gas Pressure: 10 относительных единиц;

- Температура капилляра интерфейса (Capillary Temperature): 300°С;

- Температура испарителя (Vaporizer Temperature): 350°С;

- Хроматографическая колонка стальная длиной 75 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом С18 с двойным энд-кэппированием (двойной блокировкой концевых групп), зернением 3,5 мкм;

- Температура колонки: 40°С;

- Скорость потока элюента: 0,4 см³/мин;

- Объем вводимой пробы: 0,01 см³;

- Режим элюирования (градиентный), время анализа 13 минут (Таблица 2).

Построение градуировочной кривой проводится по отношению площади хроматографического пика фрагментного иона (S., I*сек) к массовой концентрации (пг/см³) в 6 калибровочных стандартах. Зависимость линейная, взвешивание равное.

Построение графиков может проводиться при помощи встроенной программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи программы Excel (Microsoft Office).

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой каждого фрагментного иона не менее 0,98.

Массовую долю гормонов (в виде индивидуальных веществ) в пробе (X, нг/кг) вычисляют по формуле:

где Сх - массовая концентрация гормона, пг/см³;

Vp - объем раствора для экстракции; в данном случае 10 см³;

М - масса анализируемой пробы; в данном случае 5 г.

Нижний предел количественного определения гормонов при использовании предлагаемого способа составляет 20 нг/кг. Ошибка измерения не более 15%. Пределы и точность определения гормонов, достаточны для целей экспертизы и государственного надзора за безопасностью продукции аквакультуры.

Пример 1

Количественное определение остаточного количества гормонов в мясе радужной форели.

Для елах обнаружения метода, гомогенизируют, добавляют исходные растворы гормонов в априготовления калибровочных стандартов мясо радужной форели, не содержащее гормоны в предцетонитриле с перемешиванием в течение 1 минуты на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, повторно перемешивают в течение 1 минуты с последующим замораживанием. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 6 контрольных точек.

Аликвоту экстракта объемом 5 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в остродонную колбу объемом 15 см³ и упаривают на роторном испарителе. После упаривания с помощью пипеточного дозатора помещают 0,5 см³ раствора гидроксиламина в метаноле с концентрацией 100 ммоль и перемешивают в течение 1 минуты на перемешивающем устройстве типа «вортекс». Дериватизацию проводят с помощью термостатируемого шейкера при температуре 40°С в течение 20 минут. Затем полученный раствор повторно упаривают на роторном испарителе, с помощью пипеточного дозатора помещают 0,1 см³ ацетонитрила и перемешивают в течение 1 минуты на перемешивающем устройстве типа «вортекс». Аликвоту экстракта объемом 0,06 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в полипропиленовую вставку для проведения ВЭЖХ-МС/МС анализа.

Для осуществления хроматографического анализа используют ВЭЖХ систему «Agilent 1200 Series» с хроматографической колонкой «Agilent ZORBAX XDB-C18 2.1×75mm 3.5 μm» длиной 75 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненной обращенно-фазным сорбентом С18 с двойным энд-кэппированием, зернением 3,5 мкм, температура хроматографической колонки 40°С. В качестве градиента подвижной фазы используют смесь растворителей, включающую компонент А: раствор - 0,1% муравьиной кислоты в воде, и компонент В: раствор - 0,1% муравьиной кислоты в метаноле.

- Источник ионизации: электроспрей в положительном режиме ионизации (ESI+);

- Режим работы: детектирование проводится методом «регистрации множественных реакций» (MRM). Для гормонов измеряется сигнал двух фрагментных ионов (m/z). Первый, более интенсивный пик, служит для количественного определения концентрации гормонов в радужной форели, второй используется для подтверждения правильности определения (Таблица 1);

- Напряжение на капилляре электроспрея (Spray Voltage): 3 кВ;

- Sheath Gas Pressure: 35 относительных единиц;

- Aux Gas Pressure: 10 относительных единиц;

- Температура капилляра интерфейса (Capillary Temperature): 300°С;

- Температура испарителя (Vaporizer Temperature): 350°С;

- Температура колонки: 40°С;

- Скорость потока элюента: 0,4 см³/мин;

- Объем вводимой пробы: 0,01 см³;

- Режим элюирования (градиентный), время анализа 13 минут (Таблица 2).

Концентрации эстрона, дигидротестостерона и метилтестостерона в образце мяса радужной форели составляют 40 нг/кг, а местанолона - 50 нг/кг.

Результаты:

Площади пиков (АА) на хроматограмме 55008, 42256, 50921, 5181 соответствуют содержанию эстрона, дигидротестостерона и метилтестостерона в образце мяса радужной форели 40±15% нг/кг, а местанолона - 50±5% нг/кг (фиг. 1).

Пример 2

Количественное определение остаточного количества гормонов в мясе карпа.

Приготовление калибровочных стандартов для построения градуировочных кривых, пробоподготовка, оборудование и режимы проведения хроматографического анализа, построение градуировочных кривых и регистрация хроматограмм, нижний предел количественного определения гормонов, ошибки измерения как в примере 1.

Концентрации эстрона, дигидротестостерона и метилтестостерона в образце мяса карпа составляют 40 нг/кг, а местанолона - 50 нг/кг.

Результаты:

Площади пиков (АА) на хроматограмме 58496, 39323, 49405, 4894 соответствуют содержанию эстрона, дигидротестостерона и метилтестостерона в образце мяса карпа 40±15% нг/кг, а местанолона - 50±15% нг/кг (фиг. 2).

Пример 3

Количественное определение остаточного количества гормонов в мясе толстолобика.

Концентрации эстрона, дигидротестостерона и метилтестостерона в образце мяса толстолобика составляют 40 нг/кг, а местанолона - 50 нг/кг.

Результаты:

Площади пиков (АА) на хроматограмме 55390, 39405, 53579, 5119 соответствуют содержанию эстрона, дигидротестостерона и метилтестостерона в образце мяса толстолобика 40±15% нг/кг, а местанолона - 50±15% нг/кг (фиг. 3).

Способ количественного определения остаточного содержания стероидных гормонов – эстрона, дигидротестостерона, метилтестостерона и местанонолона в рыбе, заключающийся в гомогенизации мяса рыб, добавлении в образцы дистиллированной воды с их обработкой в ультразвуковой ванне для более полного извлечения гормонов из гомогенизатов, экстракции гормонов из образцов 1% раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле, очистке аликвоты селикагелем с привитыми октадецильными группами С₁₈ и анионообменным сорбентом на основе первичных и вторичных аминов PSA, дериватизации гормонов раствором гидроксиламина, упаривании образцов на роторном испарителе, перерастворении образцов в ацетонитриле, хроматографическом разделении с использованием хроматографической колонки 2,1×75 мм зернением 3,5 мкм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом С₁₈ при температуре 40°С, где в качестве градиента подвижной фазы используют смесь вода-метанол с добавлением 0,1% муравьиной кислоты, и последующем анализе содержания гормонов в образцах на тройном квадрупольном масс-детекторе с источником ионизации электроспрей в положительном режиме (ВЭЖХ-МС/МС анализ).

Изобретение относится к мясной промышленности и направлено на определение технологической пригодности мясного сырья для производства мясной продукции, в частности к способу оценки качества свинины. Способ включает отбор проб и изготовление гистологических срезов из средней части мышцы m.

Способ проведения экспресс-анализа свежести мясных продуктов питания и устройство фотолюминесцентного анализатора для его осуществления // 2768698

Изобретение относится к области пищевой промышленности и технике контроля производственных процессов и может быть использовано для экспресс оценки свежести мяса за счет определения их характерного времени хранения без предварительного взятия пробы. Предложен способ определения свежести мяса, который включает проведение экспресс-анализа путем облучения контролируемого образца мяса монохроматическим излучением лазера и последующим анализом возникающего флуоресцентного излучения в полосе флуоресценции, по результатам которого судят о состоянии мяса, при этом сначала формируют и сохраняют в базу данных эталонные спектры фотолюминесценции образцов свежего мяса, затем производят измерение контролируемого образца мяса, путем облучения его лазером с длиной волны 405 нм, которое направляют через набор полосовых фильтров в диапазоне 600-800 нм и систему фокусировки в виде линзы таким образом, чтобы отраженное от контролируемого образца мяса излучение попадало на спектрометр, который располагают внутри кожуха, блокирующего проникновение паразитного электромагнитного излучения видимого диапазона сторонних излучателей, полученное спектрометром излучение детектируют и определяют количественное значение интенсивностей фотолюминесцентных линий протопорфирина IX, как индикатора бактериальной обсемененности контролируемого мяса, лежащих в области красных длин волн 600-800 нм, полученные данные направляют на сравнение интенсивностей этих линий фотолюминесценции с интенсивностью эталонного фотолюминесцентного спектра из базы данных эталонных спектров, причем устанавливают свежесть контролируемого образца мяса исходя из соответствия полученных значений интенсивностей для этих линий фотолюминесценции контролируемого образца мяса значениям интенсивностей этих линий фотолюминесценции, заложенным в данных эталонных спектрах.

Способ раздельного определения неорганического и органического мышьяка в морепродуктах // 2760237

Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ раздельного определения органического и неорганического мышьяка в морепродуктах заключается в отборе образцов, их обработке с получением гомогенизированного влажного или сухого образца, которые помещают в пробирки, проведении экстракции каждого образца раствором 3% по массе перекиси водорода в 0,055 М соляной кислоте на деионизованной воде, на водяной бане с шейкером при температуре 95°С в течение 45 мин, затем охлаждении до комнатной температуры, центрифугировании в течение 10 минут при 4000 об/мин, затем перенесении супернатантов в полипропиленовые пробирки с доведением деионизованной водой до объема 10 см3, определении содержания общего мышьяка в 5 см3 отобранного образца супернатанта, разделении мышьяка на органическую и неорганическую фракции в 3 см3 оставшегося количества отобранного образца, причем дополнительно во время проведения экстракции образец подвергают ручному встряхиванию пробирки через каждые 10 мин, а определение количества общего мышьяка, органического и неорганического мышьяка проводят на квадрупольном масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически.

Способ измерения массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот в биологических средах методом газожидкостной хроматографии // 2758932

Изобретение относится к различным областям народного хозяйства (медицине, химической и фармацевтической промышленности), где есть потребность в измерении массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в биологических средах, в том числе животных и растительных тканях методом газожидкостной хроматографии.

Способ проведения экологического мониторинга с помощью аквакультуры // 2758337

Изобретение относится к области экологии, охраны окружающей среды и касается способа проведения экологического мониторинга акватории пролива Бьеркезунд Финского залива. Сущность способа заключается в том, что осуществляют отбор проб морской воды, донных отложений, фито- и зоопланктона по меньшей мере из 2 различных точек.

Способ экспресс-детекции жизнеспособных микроорганизмов в мясе и мясных продуктах // 2755766

Изобретение относится к пищевой промышленности и касается способа экспресс-детекции жизнеспособных микроорганизмов в мясе и мясных продуктах, включающего отбор проб из них, приготовление навески и нанесение на предметное стекло с последующим окрашиванием и микроскопированием, где навески проб гомогенизируют растиранием в стерильной фарфоровой ступке или стерильном стакане гомогенизатора, вносят 1 г гомогенизированного продукта в стерильную центрифужную пробирку с 0,9% физиологического раствора, перемешивают мешалкой, а затем центрифугируют, и наносят образец продукта на 3 предметных стекла по 2 образца, к которым добавляют разведенный дистиллированной водой флуоресцентный краситель Live/Dead Backlight, окрашенные образцы накрывают покровным стеклом и выдерживают в темноте, с последующим микроскопированием их в люминесцентном микроскопе с синим светофильтром при увеличении не менее ×320, просматривают не менее 25 полей зрения, делают их фотосъемку без вспышки в режиме повышенной контрастности, переносят изображение в компьютер, подсчитывают в полях зрения всех видов образцов только количество живых/зеленых и мертвых/оранжево-красных микроорганизмов, делят на количество полей зрения с получением средней арифметической величины.

Способ обнаружения trichinella // 2746448

Изобретение относится к способу обнаружения Trichinella в образце экстрактов тканей. Способ предусматривает отбор образца исследуемого материала, его механическое измельчение, центрифугирование или фильтрацию с получением экстракта с последующим проведением иммунного анализа, включающего иммунную реакцию между антигеном и антителом для обнаружения антигена Trichinella.

Способ установления глубины проникновения рассола в цельномышечные куски мяса индейки // 2740386

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к изучению этапа посола мяса индейки в технологическом процессе производства цельномышечных изделий. Определение глубины проникновения рассола в цельномышечные куски мяса индейки проводят путем посола мяса в солевом растворе с добавлением флуоресцирующего вещества, в качестве которого используют уранин, и его выдерживание в холодильнике при температуре 0±4°С, проведение поперечных срезов и по свечению уранина под воздействием источника УФ спектра фиксирование глубины проникновения рассола.

Способ измерений массовых концентраций мышьяка, кадмия, свинца, ртути в мясных и мясосодержащих продуктах методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой // 2738166

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для проведения лабораторных исследований безопасности мясных и мясосодержащих продуктов на предмет наличия тяжелых металлов. При осуществлении способа после отбора пробы выполняют пробоподготовку для чего добавляют к ней 10 см3 концентрированной азотной кислоты из расчета на 0,8-1,2 г пробы.

Метод изготовления микропрепаратов // 2714044

Изобретение относится к области ветеринарно-санитарной экспертизы и контроля качества и термического состояния мяса животных и птицы. Метод изготовления микропрепаратов для идентификации охлажденного и дефростированного мяса убойных животных и птицы путем микроскопии структурного строения мышечных волокон характеризуется тем, что из исследуемого образца охлажденного или замороженного мяса вырезают 5 продольных срезов размером 1 см длиной и 2 мм толщиной, раскладывают их на нижнем стекле компрессориума с промежутками не менее 1 см, накрывают срезы верхним стеклом, отводя его относительно нижнего стекла максимально на себя, прижимают стекла с усилием друг к другу, после чего сдвигают их в обратном направлении, сохраняя сжатие до исходного положения, стекла фиксируют винтами, придавая мышечным срезам тонкую конфигурацию, после чего раскручивают винты, снимают раздавленные срезы и помещают их на дно фарфоровой чашки, подвергают их окрашиванию, окрашенные срезы помещают на предметное стекло, на срезы добавляют по 1-2 капли 50% водного раствора глицерина и фиксируют мышечную ткань покровным стеклом, слегка придавливая его, после чего оценивают термическое состояние мяса по наличию механических повреждений мышечных волокон.