2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1н-пиррол-3-карбоксамид и 2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-[2-(фениламино)бензамидо]-4,5-дигидро-1н-пиррол-3-карбоксамид, ингибирующие процесс полимеризации тубулина и обладающие цитотоксической и противоопухолевой активностями в отношении эпителиальных опухолей человека

Изобретение относится к применению производных пиррола: 2-амино-1-бензамидо-5-(2-(нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (I) и 2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-(2-фениламино)-бензамидо)-4,5-дигидро-1H-пиррол-карбоксамида (II), в качестве цитотоксического и противоопухолевого средства. Соединения I и II эффективно ингибируют полимеризацию тубулина и являются тубулин-деполимеризующими агентами, способствуют селективному накоплению клеток в G₂/M-фазах клеточного цикла, имеют высокую аффинность к колхициновому сайту, индуцируют повышение уровня экспрессии расщепленных форм каспазы-3, поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы и фосфогистона 2AX, а также подавляют рост опухолей. Токсичность соединений I и II меньше, чем у паклитаксела. Технический результат – эффективная цитотоксическая и противоопухолевая активность. 2 н.п. ф-лы, 7 ил.

 

Изобретение относится к области органической химии, производным пиррола, а именно, новым биологически активным - 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамиду I формулы:

2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-[2-(фениламино)-бензамидо]-4,5-дигидро-1H-пиррол-карбоксамиду II формулы:

которые могут найти применение в качестве цитостатического средства в медицине.

Синтез заявленных соединений I и II осуществляется рециклизацией гидразонов 2,3-фурандионов III, IV под действием цианоацетамида в абсолютном толуоле или диоксане в присутствии основного катализатора триэтиламина по схеме [1]:

Методика получения 2-амино-1-бензамидо-5-(2-нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида (I). Смесь .0.86 г (0.0025 моль) N-[5-(нафталин-2-ил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден]бензогидразида (III), 0.21 г (0.0025 моль) цианоацетамида и 0.25 г (0.0025 моль) триэтиламина кипятили в 60 мл абсолютного диоксана в течение 30 минут. Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из этанола. Получали 0.60 г (56%) бесцветного кристаллического вещества (I) с Т_пл 281-282°С. C₂₄H₁₈N₄O₄. ИК-спектр, ν/см^-1, вазелиновое масло: 3482 (NH), 3181 (NH), 1666 (С=О), 1615 (C=C); Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), δ, м.д.: 6.85 с (1Н, СН), 7.59 м (13Н, Н_аром), 8.41 с (1Н, NH), 8.67 с (1Н, NH), 9.11 уш. с (1Н, NH), 10.91 с (1Н, NH). Спектр ЯМР ¹³С, δ, м.д., ДМСО-d₆: 66.85, 88.24, 103.98, 123.77, 127.40, 128.07, 128.22, 129.26, 130.23, 131.39, 131.59, 132.43, 132.53, 135.02, 135.61, 142.19, 165.84, 166.18, 167.34, 176.43, 190.64

Масс-спектр, m/z (I_отн, %): 426 [M]⁺ (24.0), 349 [M – С₆Н₅ ]⁺ (12.0), 271 [M - нафталин-2-илСО]⁺ (18.0), 155 [нафталин-2-илСО]⁺ (49.0), 105 [С₆Н₅СО]⁺ (100.0), 77 [С₆Н₅]⁺ (23.0).

Методика получения 2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-[2-(фениламино)бензамидо]-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (II) . Смесь .0.68 г (0.0025 моль) N-[5-трет-бутил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден]-2-(фениламино)бензогидразида (IV), 0.21 г (0.0025 моль) цианоацетамида и 0.25 г (0.0025 моль) триэтиламина кипятили в 60 мл абсолютного толуола в течение 20 минут. Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из этанола. Получали 0.75 г (67%) желтого кристаллического вещества (II) с Т_пл 265-267°С. C₂₄H₂₅N₅O₄ ИК спектр, ν, см^-1: 3450, 3310, 1685, 1647, 1598. Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), δ, м.д.: 1.14 с (9Н, 3 Me), 6.39 с (1Н, СН), 6.46 с (1Н, СН), 7.37 м (9Н, Н_аром.), 7.11 с (1Н, NH), 7.13 с (1Н, NH), 7.77 с (1Н, NH), 7.79 с (1Н, NH), 7.92 с (1Н, NH), 7.94 с (1Н, NH). m/z (I, %): 447 (100.0) [M]+, 196 (74.0) [2PhNHPhCO)]+, 168 (5.5) [2PhNHPh)]+.

Спектральные данные и физико-химические свойства аминопиррола II полностью совпадают с данными ранее полученного соединения [1].

Ближайшим структурным аналогом к заявленному соединению являются соединения - этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1Н-пирролидин-3-карбоновых кислот общей формулы V, проявляющие противоопухолевую активность [2].

В качестве эталона сравнения нами взят противоопухолевый препарат - паклитаксел [3], ЛД 50 которого составляет 48 мг/кг.

В тесте острой токсичности ЛД 50 оба заявляемых соединения имеют токсичность более 1000 мг/кг. 2-Амино-1-бензамидо-5-(2-(нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамид I имеет ЛД 50 равную 1640 мг/кг, а 2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-[2-(фениламино)-бензамидо]-4,5-дигидро-1H-пиррол-карбоксамид II имеет ЛД 50, равную 1820 мг/кг.

Таким образом, токсичность соединений I и II гораздо меньше, чем у прототипа биологической активности - паклитаксела.

Было отмечено, что при инкубации эпителиальных опухолевых клеточных линий (HCC1806 и MDA-MD-231 - рак молочной железы, Н1299 немелкоклеточный рак легкого, PC-3 рак предстательной железы) с соединениями I и II в течение 12 часов, клетки приобретают округлую форму схожую с результатом их инкубирования с паклитакселом. На фиг.1 отражены результаты световой микроскопии опухолевых клеток рака молочной железы линии HCC1806: цифра 1 отражает контрольные клетки; цифры 2 и 3 - клетки, которые подвергались воздействию прототипов биологической активности (паклитаксела и винбластина, соответственно); цифры 4 и 5 - клетки, инкубированные с соединениями I и II, соответственно.

В связи с этим, было предпринято изучение воздействия соединений на процесс полимеризации тубулина, показавшее, что соединения I и II эффективно ингибируют полимеризацию тубулина и являются тубулин-деполимеризующими агентами. На фиг.2 отражено влияние соединений I и II, а также паклитаксела и винбластина на процесс полимеризации тубулина. (CaCl₂ -отрицательный контроль).

Данный факт был подтвержден результатами иммунофлюоресцентного окрашивания опухолевых клеток линии HCC1806, культивированных в присутствии данных соединений, а также химиопрепаратов, усиливающих (паклитаксел) и ингибирующих (винбластин) сборку микротрубочек. Паттерн окрашивания тубулина в клетках, культивированных с соединениями I и II, был аналогичен таковому в клетках, культивированных с винбластином, что доказывало, что соединения I и II эффективно нарушают работу сети микротрубочек тубулина. На фиг.3 показан характер окрашивание белка альфа-тубулина в опухолевых клетках линии HCC1806, инкубированных с соединениями I и II, а также химиопрепаратами паклитакселом и винбластином.

Принимая во внимание важную роль белка тубулина в регуляции клеточного цикла и прохождении его М-фазы, с помощью метода проточной цитометрии было предпринято исследование по изучению распределения фаз клеточного цикла в опухолевых клетках рака молочной железы, культивированных с данными соединениями и химиопрепаратами (винбластин и паклитаксел). Было показано селективное накопление клеток в G₂/M-фазах клеточного цикла. На фиг.4 показано распределение фаз клеточного цикла в опухолевых клетках линии HCC1806, инкубированных с соединениями I и II, а также химиопрепаратами паклитакселом и винбластином.

Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на предмет экспрессии гистона 3, фосфорилированного по остатку Ser10 (pH3Ser10), являющегося маркером клеток, находящихся в состоянии митоза, подтвердили селективное накопление клеток в М-фазе. На фиг.5 показано, как соединения I и II вызывают дозо-зависимое накопление опухолевых клеток HCC1806, экспрессирующих гистон 3, фосфорилированный по остаткам серина в положении 10 (маркер М-фазы клеточного цикла). Учитывая способность известных химиопрепаратов, влияющих на процесс деполимеризации тубулина, связываться в данным белком через специфические сайты, был проведен молекулярный докинг, показавший высокую аффинность данных соединений к колхициновому сайту.

Определение цитотоксической активности соединений I и II проводилось in vitro посредством вестерн-блоттинга. Было обнаружено, что данные соединения индуцируют повышение уровне экспрессии расщепленных форм каспазы-3 и поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы, используемых как маркеры апоптоза в опухолевых клеточных линиях рака молочной железы НСС1806 (Фиг. 6А), MDA-MB-231 (Фиг. 6Б), немелкоклеточного рака легкого Н1299 (Фиг. 6В) и предстательной железы (Фиг. 6Г), обработанных соединениями I и II. Аналогичная закономерность была выявлена в отношении уровня экспрессии фосфорилированной формы гистона H2AX, что указывало на несостоятельность процессов репарации ДНК в опухолевых клетках, инкубированных с данными соединениями.

В завершение, противоопухолевая активность соединений I и II была оценена на ксенографтных опухолях молочной железы с использованием клеточной линии HCC1806. Модели ксенографтных опухолей были ранее успешно использованы нами как при оценке противоопухолевой активности синтезированных соединений [4], так и некоторых таргетных препаратов, в частности, ингибиторов FGFR-сигнального пути [5]. При введении лабораторным животным соединений I и II была обнаружена их способность подавлять скорость роста ксенографтных опухолей и приводить к значительному уменьшению их размера (по сравнению с размерами опухолей до начала введения животным данных соединений). Важно отметить, что противоопухолевый эффект соединений был более выраженным по сравнению с паклитакселом, несмотря на то, что концентрация химиопрепарата была в 5 раз выше по сравнению с использованными соединениями. На Фиг.7 показано как соединения I и II (2 мг/кг), а также паклитаксел (10 мг/кг), (положительный контроль) ингибируют рост ксенографтных опухолей НСС1806.

Таким образом, соединения I и II обладают как выраженной цитотоксической, так и противоопухолевой активностью в сравнении с прототипами - эталонами сравнения паклитакселом и винбластином.

Список литературы

1. Кизимова И.А., Игидов Н.М., Киселев М.А., Дмитриев М.В., Чащина С.В., Сюткина А.И. Синтез новых производных 2-аминопирролов реакцией 3-ацилгидразонов 2,3-фурандионов с CH-нуклеофилами // Журнал общей химии. - 2020. - Т. 90. - №. 2. - С. 192-198.

2. Патент № 2607920 Российская Федерация, МПК C07D417/00, А61К31/195. Этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1Н-пирролидин-3-карбоновых кислот, проявляющие противоопухолевую активность, и способ их получения: № 2015120527: заявл. 29.05.2015: опубл. 11.01.2017 / С.С. Зыкова, Н.М. Игидов, М.В. Киселев, С.В. Бойчук, А.Р. Галембикова.

3. Патент № 2059631, МПК C07D305/14, A61K31/195. Производные таксола и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью: № 91 5010248 : заявл. 29.11.1991: опубл. 10.05.1996 / Валентино Дж. Стелла, Абрахам Е. Мэтью.

4. Boichuk S., Galembikova A, Dunaev P, Micheeva E., Novikova M., Khromova N, Kopnin P. Ethyl-2-amino-pyrrole-3-carboxylates (EAPCs) are active against imatinib (IM)-resistant gastrointestinal stromal tumors (GIST) in vitro and in vivo. Anti-Cancer Drugs. 2019 Jun;30(5):475-484.

5. Boichuk, S.; Galembikova, A.; Mikheeva, E.; Bikinieva, F.; Aukhadieva, A.; Dunaev, P.; Khalikov, D.; Petrov, S.; Kurtasanov, R.; Valeeva, E.; Kireev, I.; Dugina, V.; Lushnikova, A.; Novikova, M.; Kopnin, P. Inhibition of FGF2-Mediated Signaling in GIST-Promising Approach for Overcoming Resistance to Imatinib. Cancers 2020, 12, 1674. doi: 10.3390/cancers12061674.

1. Применение 2-амино-1-бензамидо-5-(2-(нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида формулы I

в качестве вещества, имеющего цитотоксическую и противоопухолевую активность.

2. Применение 2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-(2-фениламино)-бензамидо)-4,5-дигидро-1H-пиррол-карбоксамида формулы II

в качестве вещества, имеющего цитотоксическую и противоопухолевую активность.