Способ очистки калликреина

 

* !

ОГ1ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Х ПАТЕНТУ

<п1 482934

Союз Советских

Социалистических

Республик, фФ

° г т „с; (61) Зависимый от патента— (22) Заявлено 27.10.72 (21) 1841245/28-13 (51) М. Кл. А 61k 19/ОО

С 07g 7/00 (23) Приоритет — (32) 03.11.71 (31) P 2154556.2 (33) ФРГ

Опубликовано 30.08.75. Бюллетень Хе 32

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 615.45:615 .779.94 (088.8) Дата опубликования описания 01.12.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Карл Кутцбах и Гюнтер Шмидт-Кастнер (ФРГ) Иностранная фирма

«Байер АГ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ КАЛЛИКРЕИНА

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности.

Известен способ очистки препаратов калликреина, заключающийся в том, что частично очищенный препарат хром атографиру ют на основнозамещенной целлюлозе, например

ДЕАЕ-целлюлозе, с последующей кристаллизацией.

Однако такой способ обеспечивает недостаточно высокую чистоту и выход препарата.

С целью устранения указанного недостатка по предлагаемому способу проводят дополнительную очистку на макропористом катионите, например СМ-сефадексе, с последующей кристаллизацией и разделением на активные компоненты при необходимости.

Калликреин представляет собой смесь из двух изоэнзимов. Электрофорезом или хроматографией с анионообменными смолами калликреин разделяют на два компонента — компонент калликреина А и компонент калликреина Б.

Чистый калликреин получают, обессоливая полученный из осадка свинцовых или цинковых солей элюат; обессоленный раствор хроматографируют с пригодным макропористым анионитом, например с диэтиламиноэтилэфирной целлюлозой (ДЕАЕ) или с ДЕАЕ-сефадексом, обрабатывают этот раствор частично очищенного калликреина пригодным макропористым катионитом, например СМ-сефадексом, и калликреин в случае необходимости кристаллизуют.

Компоненты А и Б чистого калликреина получают при обессоливании полученного из осадка свинцовых или цинковых солей элюат; обессоленный раствор хроматографируют с 0 макропор истым анионитом, например с

ДЕАЕ-целлюлозой или с ДЕЛЕ-сефадексом.

Раствор частично очищенного калликреина обрабатывают макропористым катионитом, например СМ-сефадексом, известными метоi5 дами разделяют калликреин на компоненты

А и Ь, и кристаллизуют последние, добавляя сульфат аммония.

Кристаллизованные таким образом компоненты калликреина своей специфической активностью превосходят известные препараты и являются свободными от действующих антигенно посторонних протеинов и пирогенов.

Обессоливание полученного элюата осуществляют диализом или гельфильтрацией. Для хроматографии с макропористыми анионитами необходимы замещенные гели с достаточной величиной пор. Этот очистительный процесс проводят на колонках с ДЕЛЕ-сефадек482934 сом. Адсобрцию осуществляют при значении рН 4,8 — 8,0.

Элюирование осуществляют повышением концентрации соли при постоянном значении рН, или снижением значения рН при постоянной концентрации соли, или комбинацией обоих способов. Изменение рН и концентрации соли осуществляют беспрерывно, как градиентное проявление, или постепенно. Применяют все известные буферные соли, но предпочитают летучие буферные соли, например формиат аммония, ацетат аммония, пропионат аммония или соответствующие соли алкиламмония, например формиат триэтиламмония. Адсорбируют калликреин из 0,2 M ацетата аммония со значением рН 5,0 на

ДЕЛЕ-сефадексс в виде колонны, неактивный протеин промывают 0,25 М ацетатом аммония со значением рН 5,0 и затем элюируют обогащенный калликреин 0,3 М ацетатом аммония со значением рН 4,5.

Обогащенный таким образом калликреин подвергают дальнейшей очистке обработкой макропористыми катионитами. Получают препараты чистотой 90/o. В качестве макропористых катионитов применяют кислозамещенные целлюлозы или кислозамещенные гели, например, из декстранов с поперечными связями или полиакриламида, с достаточной величиной пор.

Обработку раствора обогащенного калликреина катионитом осуществляют посредством размешивания его с катионитом или фильтрования через слои катионита. Во время размешивания или фильтрации удерживаются сопутствующие вещества гелей, в то время как калликреин беспрепятственно проходит через фильтрующий слой.

Применяемые для фильтрации или перемешивания макропористые катиониты подвергают предварительной обработке известными приемами. Для фильтрации их вмешивают в разбавленные буферные растворы и подают в виде суспензии, например, в колонны с большим диаметром. Для получения буферных растворов применяют известные буферные соли, но предпочитают летучие буферные соли, например формиат аммония, ацетат аммония, пропионат аммония, или соли алкиламмония, например формиат триэтиламмония. Значение рН буферных растворов выбирают между 4,5 и 8,5.

Для получения кристаллического калликреина кристаллизуют калликреин высокой чистоты прибавлением сульфата аммония в твердом виде или в виде концентрированного раствора при значении рН 4,0 — 8,0. Кристаллизацию начинают при насыщении сульфатом аммония 45 /, по истечении нескольких дней при температуре 15 — 25 С. Кристаллы выделяют из маточного раствора центрифугированием или фильтрованием, промывают

50 /о -ным насыщенным раствором сульфата аммония и растворяют в разбавленных солевых растворах или в воде. 6

Для получения кристаллических компонентов А и Б калликреина разделяют очищенный калликреин известными методами — хроматографией с ДЕАЕ-сефадексом. Компоненты калликреина высокой частоты кристаллизуют отдельно прибавлением сульфата аммония в твердом виде или в виде концентрированного раствора при значении рН 4,0 — 8,0. Кристаллизацию начинают при насыщении сульфатом

10 аммония 45 /o по истечении нескольких дней при температуре 15 — 25 С. Кристаллы имеют форму игл, соединяющихся в пучки.

Кристаллы выделяют из маточного раствора центрифугированием или фильтрованием, про15 мывают 50 /О -ным насыщенным р аствором сульфата аммония и растворяют в разбавленных соленых растворах или в воде. Кристаллы состоят из чистого, электрофоретически однородного калликреина А и Б.

Раствор кристаллов калликреина и компонентов калликреина характеризуется УФспектром при значении рН 7 с максимумом при 282 нм, минимумом при 251 нм, с 2 плечами при 277 и 290 нм и соотношением экстинкции при 280 и 260 нм 1,78.

Кристаллический калликреин и кристаллические компоненты А и Б применяют в качестве эффективных составных частей лекарственных средств.

Пример 1. 200 л полученного из поджелудочной железы свиней и подверженного диализу элюата осадка свинцовой соли, содержащего 10,8 млн. ед, калликреина, сгущают в тонкопленочном выпарном аппарате до

15 л и затем обессоливают гель-фильтрацией в колонне сефадекса Г-25. Значение рН обессоленного раствора устанавливают 5,0 и отфильтровывают образовавшийся при этом осадок. Затем прибавляют твердый ацетат

4о аммония до удельной электропроводности

12 ms (микросименс). Этот раствор подают на колонну ДЕАЕ сефадекса А-50, уравновешенного с 0,2 М ацетатом аммония со значением рН 5,0, калликреин при этом адсорбируется. Затем элюируют колонну сперва

40 л и 0,25 М ацетатом аммония со значением рН 5,0, а потом 0,3 М ацетатом аммония со значением рН 4, 5. Калликреин проявляется в элюате после того, как значение рН снижается до 4,5. Активные фракции содержат .9,35 млн. ед. калликреина (86,5 /о). Раствор концентрируют в вакууме и обессоливают в колонне сефадекса G-25. Лиофилизованная проба имеет специфическую активность

414 ед. калликреина/мг.

Пример 2. Обессоленный раствор объемом 300 мл фильтруют в колонне CM-сефадекса G-50, уравновешенного с 0,01 М ацетатом аммония со значением рН 5,0. В элюате появляется калликреин, затем неактивные загрязнения. Фракция калликреина (930 мл) содержит 5,5 млн. ед. калликреина (59 /О). Лиофилизованная проба имеет специфическую активность 1060 ед. калликреина/мг или

1220 ед. калликреина/мг протеина, 482934

Предмет изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Н. Спиридонова Техред 3. Тараненко

Корректор Л Орлова

Заказ 2946120 Изд. М 1768 Тираж 559 Подписное

11НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, OK-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Способ очистки калликреина путем хроматографии частично очищенного препарата на м акр опористом анионите, например ДЕАЕцеллюлозе, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты и выхода целевого продукта, проводят дополнительную очистку на макропористом катионите, например, См-сефадексе, с последующей кристаллизацией и разделением на активные компоненты при необходимости.