Способ иммобилизации ферментов

 

патентио--.г -,„,-.-,:- !

О и и-с - х= и-""и E

Союз Советских

Социалистических

Республик (») 545648 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 10,03.75 (2 ) 2113303/04 с присоединением заявки №(23) Приоритет (43) Опубликовано05.02.77.Бюллетень ¹ 5 (51) Я.

С 07 5 7/02//

//A 61 К 37/48

Государственный номхтет

Соввтв Мнннстров СССР по делам нзовретений и отнрытнй (53) УДК 577.15.04.

„002.23 7.66 (088.8) (45) Дата опубликования описания 25.03.77 (72) Авторы изобретении

Л. И. Валуев, М. А. Аль-Нури, H. А. Баранова, Н. С. Егоров и Н. А. Платэ

Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет имени М. В. Ломоносова (?1) Заявитель (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЫИИ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к способу полу чения иммобилизованных ферментов, которые находят широкое применение в тонком органическом синтезе, медицине, пищевой промышленности. 5

Известны способы иммобилизации фермен- тов на .носителях, заключающиеся в механическом включении ферментов в полимерные гели (1)!

О

Известен также способ ковалентного связывания фермента с предварительной актива-, цией носителя посредством обработки последнего пиангалогенидами в щелочной среде .t2j. Однако этот способ применим только для активации носителей полисахаридной природы; а используемые для активации соединения являются отравляющими веществами.

Недостаток известных способов — химичес->0 кая инертность многих полимерных материалов, препятствующая связыванию, а также быстрое вымывание фермента в том случае, когда он находится в геле и химически с ним не связан. 25

По предлагаемому способу фермент предварительно ацилируют хлорангидридом ненасыщенной кислоты.

Процесс иммобилизации проводят путем активации фермента ацилированием хлорангидридом ненасыщенной кислоты и последующей совместной полимеризации ацилированного фермента с ненасыщенным полимеризуюшимся мономером или с ненасыщенным полимеризуюшимся мономером и сшиваюп им агенто м.

Стадию ацилирования проводят при рН

6,0-9,0., предпочтительно 7,0-8,0, при температуре обычно 0-40оС и при мольном соотношении фермент/хлорангидрид ненасыщенной кислоты 1:10-1000. Реакцию сополимеризации ацилированного фермента с ненасы,щенными мономерами проводят при 0-60сС под действием инициаторов радикального типа. В качестве хлорангидрида ненасыщенной кислоты используют хлорангидриды акриловой, метакриловой и других мононенасыщенных кислот, в качестве мономера применяют акриламид, метакриламид, И -винилпирролидон и т.п., в качестве сшивающего агента И,Ч -метиленбисакриламид, дизфиоы акриловэй и метакриловой кислот с двухатОмным и спиртами, а В качестве инициатэ ров цолимеризации — рибофпавин, перекись бензоила и др.

Ь

П э и м е р 1. Ацилированке трипсина проводят при ООС путем добавления к раствору 50 мг трипсина в 50 мл бикарбонатнога буфера при рН 8,0, 0,05 мл хлорангидрида акрпловой кислоты. После добавления @ всего количества хлорангидрида раствор перемешивают 15 мин. Затем к ацилированному TpHIICH добавляют 50 мг акриламкда к сэполимеризацию проводят в вакууме при

20ОС, испэль.зуя в качестве инициатора полк= » меризации рибэфл=-»вин, конце .грация кс тора1 ),и /л, Прэду,:-т bi| C oiioлимеэкзации раз.= деляют Гель-Фильтрацией на Сефадексе < --50 испэльзу я колонку 1,2 х 60 c."»I. люцию рас1

Воров проводят 0,01 N TpHc. ацетатн и эу- О ферэм Нр» рН 8,5. Продукты сополимериза-ции Ioc. e разделения идентифицируют спек-трэфэтэметрически, гравиметрически после осаждения ацетоном при (-)20ОС и путем Определения прэтеэлитической активности в каж-. дой фракции. Сэпэлимер ацилирэванного трип-сина с акриламидэм выходит их хроматографичэскэй холопки раньще других компонентов пэлп;-, еризуюшейся системы, причем выход сэпэлимера увеличиваетСя с увеличением вре-0 мени сэп0;п меризации. Сопэлимер ацилирэван— нэг.: трипсина с акриламидэм является линейным сэполимерэм„представляет собой твер,Ое Вешество, растворимое В воде.

Гf р и r H p 2 . .Иммобилкзацию трипсина 35 проводят пэ примеру 1. Количество добавля-емОГО K pHÑTHopú 50 мг ацилированнОГО трипсина В 50 мл бикарбонатногэ буфера. при рН

6,0 акриламида равно 100 мг.

Пример 3. Иммобилизацию трицсина 40 проводят пэ примеру 1. В качестве сэмэноМ Р В ЛСПО ..Ь..-" »3т - х:ЕСЬ . М? а»КРИЛВМ»»ца ! и 5 мг Й, " "-:::Hc,"HT»HIIeHàHpиламида.

Пример 4. Иммэбилизацию а -химотрипскна проводят по примеру 1. Фермент из геля Нс вымывается.

П р к м е р 5. Иммэбилизацию трипсина проводят Ео bipèìåpó 1. В качестве сомономера используют Я -Винилпирролидон, а в качестве инициатора пэлимеризации И, 4 Л,й

-тетрак»етнлзтилендиамин совместно с персульфатом аммония. Реакцию сополимери 3BILHH 11ровоцят при 36ОС, П р H м е р 6. Иммэбхчлизацкю фермента проводят по примеру 3. В качестве сшиваюIIIeI"o аг нта используют дкзфир зтиленглиj oiÿ H ."..я тако »»л ОВ oN кислот ы. е э мент из

2... 3 (Г О э i I ;: 1 з " б - "- т — е Р и я

Кэп:Чсп.i B. >," i ВЯ, -! - .: .= И л40ЛЕКУЛ фЕ ) мента с нолик.еонь;м носителе yl э т л и

Pi K IZ, Hi и С Я ТЕМ. NTO, С ПЕЛЬЮ ПЭВЬ1 шения стаб»libHocTH феэмента Hi si o активНОСти, ПЭСЛЕДНИй ПРЬДваРИТЕЛЬНЭ аЦИЛИРУЮт

ХЛОРаНГИДПИДЭМ НЕНаСЬ»ЦЦЕННЭй КИСЛЭТЬт ПЭ;» ОЯ -1 0D .„.у, c:-,!oc. !:- äómö;è!» c»;oi!H ; дэизаци аЦИЛИЭ,. „-;;-Гх"., О„;Э фЕРМЕНта H epcbip»HHbIP пэлимеризуюшимся мэномером.

2. .пэсоэ ID и. 1, О T л и ч а K) ш и и c —, тем, »ITa пээцесс сэ.-:.элим»ризацH»I ь3едут bi пр »с;-"тствии сшнваюшего аГента»

3. Спэсэбпоп, 1, этлича.юШ H и H I Ki iiTD ПРОЦЕСС СэгхЭЛИМЕОИЗаННН Веду-. Ири 0-60ОС

HC ЭЧНИКИ HÄ.:;ô PMP хии ПРИНЯТЬ Е BO BHH мание при експертизг:

1. Э o! T! < Т, A» r am Т., В В. А 1 9 7 0, 2 1 2, 3 62

2./ »n -, РО! с(Ь. 7,ярz "ОасХ 5., йа иve

2 -- - -, р- . З02 (прототип)С ОС ГянххтЕЛЬ А. БэнарОВ

Редактор О. Филиппова Техред A. Богдхап Корректор П. Бэринс: ая

Заказ 253/4 Тираж 569. Подписное

Lt_#_ax х х х л осударственнэго KoMH » ета »» Овета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, -35, Рау нская наб... д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4