Способ выделения гемнонапептидафрагмента 14-22 цитохрома с

 

< ) 578305

ОЛИСАНИЕ

Й ЗОБРЕТЕ Й ИЯ

Союз Советских

Социалистич Вских

Республик

ЛЕТ.Р | ДУУ <:Д|4ДЕЕД|а .ТЩ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 24.06.76 (21) 2381878/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.10.77. Бюллетень ¹ 40 (45) Дата опубликования оппсанпя 04.01.78 (51) М.Кл. С 07С 103/52

С 07 G 7/026, Государственный комитет

Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Р, П. Евстигнеева, А. Ф. Миронов и Г. А. Васильева

Московский ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМНО НАП Е ПТ ИДА

ФРАГМЕНТА 14 — 22 ЦИТОХРОМА С

Изобретение относится к улучшенному способу выделения гемнонапептида-фрагмента

14 — 22 цитохрома С, соединения, нашедшего применение в клинической практике.

Известные способы выделения гемнонапептида-фрагмента 14 — 22 цитохрома С из сердца лошади заключаются в ферментативном расщеплении цитохрома С трипсином (1).

Реакцию проводят при рН 8,4 (0,1 и. водном растворе NaOH) при 30 С в течение 40 ч прн соотношении трипсина и цитохрома С 1:10.

После очистки с помощью ионообменной хроматографии на IRC=50 в Н+ -форме н на колонках с сефадексом G — 25 выход гемнонапептида составляет 45%.

Однако известный способ требует непрерывного контроля рН (рН вЂ” оптимум фермента поддерживается с помощью автотнтратора) и продолжителен по времени.

Цель изобретения — усовершенстгованис известного способа выделения гемнонапептпда ферментативным расщеплением цнтохрома

С из сердца лошади трипсином, увеличение

его выхода и сокращение времени процесса.

Это достигается описываемым способом выделения гемнонапептида-фрагмента 14—

22 цитохрома С при ферментативном расщеплении трипоином цитохрома С из сердца лошади, заключающимся в том, что ферментативное расщепление цитохрома С проводят в

2 водном 0,1 н. растворе NH4HCO3 при весовом соотношении трипсина и цитохрома С

1: 100. Предпочтительным условием проведения процесса является осуществление ферментативного расщепления при температуре

37 С.

В результате предлагаемого способа время ферментативного расщепления сокращается с 40 до 2 ч, выход увеличивается до

10 91%, применение водного раствора бикарбоната аммония позволяет поддерживать необходимую величину рН (8,45) на протяжении процесса расщепления без помощи автотитратора.

15 Пример. Гемнонапептид-фрагмент 14—

22 цитохрома С пз сердца лошади.

1 г цитохрома С растворяют в 50 мл

0,1 н. раствора 1У1Н4НСОз, рН 8,45, добавляют

10 мг трипспна, термостатируют при 3 С. Через 2 ч раствор наносят на колонку с ионообменной смолой КРК-1 в Н вЂ” -форме (5ХЗсм).

Промывают 600 мл 0,25 М пириднн-ацетатного буфера с рН 5,6, дистиллированной водой.

Элюируют гемпептпд 1 н, ппридином. Элюат

2s (30 мл) наносят на колонку (4,5Х11 см) с сефадексом G-25 (superfine), Очистку на сефадексе G-25 проводят дважды. Лиофилизуют.

Выход лиофильно высушенного препарата

120 мг (91%), R< 0,7 (бумажная хромато578305

Формула изобретения

Состав !тель В. Волкова

Текрсд И. Карандашова

Редактор А. Соловьева

Коррект:>р О. Тюринй

Заказ 8339

Изд, ¹ 872 Тираж 563 Подписное

НПО Гостдар-твенного ком !тета Совета Мин!!стрсв СССР ио делам изобретений и открыт)ш

113935, Москва, Я(-35, Раушская нао., д. 4/5

МОТ, Загорский филиал

1 р!1(1)п!! В спстсм!. !1-оутспп). - -- ) If ñ), сисlя кислотаа — вода, 4:1:5) .

Электрофорез в полиакриламидном геле

12,5%-ной концентрации, трисфос!ратный буфер, рН 6,9, в присутствии 1 „SDS.

АMHHDKHc IDTH |É состаB ги jpo. IHзаTа нонапептида подтвер>кден данными амн!юкислотного анализа.

1. Способ выделения гемнопапептпда-фрагмента 14 — 22 цитохрома С прп фермснтатп»ном расщеплении трипсипом цптохрома С пз сердца лошади прп нагревании В»одном щс;Io÷IIoì растворе, отличающийся тем, что, " целью увеличения выхода и упрощения процесса, последний проводят в 0,1 н. вод5 ном растворе NH4HCO> при весовом соотнои!ени!! трипсинз и цитохрома С 1: 100.

2. Способ по п. 1, отл и ч а ю щи и с я тем, что процесс проводят при 37 С.

Источники информации, принятые во внимание прп экспертизе

1. Васильева Г. Л. и др. Синтез гемнонапептпда-фрагмента цитохрома С млекопитающих. — )Курцал общей xlliIHII, 1973, 43, 1849.