Способ получения декапептида или его солей

 

эо-.. г . ò í

ОП И "Х-НзИ Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 576920

К ПАУЕНУУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 15,06.73 (21) 1932201/04 (23) Приоритет — (32) (51) М. Кл.С 07 C 103/52

//А 61 К 37/02

Гасударственный комитет

Совета Мнннстров СССР оо делам изабретеннй н OTKpblTHH (33)-(53) УДК 547.964.4.07 (088.8) (43) Опубликовано 15.10.77. Бюллетень № 38 (45) Дата опубликования описания 22.11.77

Иностранцы

Ханс Юли Иммер (Швейцария) Вернер Роберт Нелсон и Манфред Карл Гец (Канада) Иностранная фирма

Эйерст Маккенна знд Харрисон Лимитед

Канада) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ aEKAllEHTHllA ИЛИ EIО COJ)EA

Изобретение относится к у"овершенствованию способа получения декапептида — гормона, способствующего выделению лютеостимулируюшего гормона (ЛГ) и фолликулостимулируюшего гормона (ФСГ), который может найти применение в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве.

Гормон декапептид, способствующий выделению ЛГ и ФСГ, можно синтезировать различными методами (1) (2) (3). Например, Сивертссон с соавторами (1) использовал сочетания классических 1и методов с методом твердофаэного синтеза пептидов, Гейгер с сотр. (2) применил в синтезе гормона строго классические методы, Мацуо с со гр. (3) описал синтез с применением твердофазного метода, l5

Твердофазные способы синтеза требуют наличие большого количества защитных групп, и при их применении невозможно получить чистые продукты на промежуточных стадиях. Все это приводит к усложнению процесса и получить конечный продукт достаточной степени чистоты не удастся.

Метод Гейгера (2) наиболее близок к предла аемому. Он состоит в конденсации двух фрагментов — шпю|пила (11нр - Гис - 011) с соответствуюок|нп - и ппк1м. ме1" и м - " (, 1108t " среде 25 безводного органического растворителя при охлаждении. Однако при осуществлении этого метода является возможна рацемизация на конечной стадии и применяемый в качестве конденсируюшего средства в пяти различных реакциях сочетания 1оксибензотриазол (HOBt) является очень дорогостоящим средством.

Кроме того, Гейгер использует для получения дипептида Пир-Гис — ОН в качестве исходного матер иала коммерчески недоступный продукт

Гли-(M6) -OH с дорогой защитной группой Mbh (4,4 - диметоксибензгидрил).

И наконец, применяемая для очистки конечного продукта, гель-хроматография на сефадексе, эффективность которой тем выше, чем больше разница в размерах молекул, не дает в данном случае хороших результатов, поскольку октапептид трудно отделить от декапептида.

Лля упрощения процесса синтеза декапептида, снижения числа блокирующих групп до минимума и получения продукта высокой степ ни чистоты трифторацетат гидразида гексапептн га формулы

N - (N - (N - (N - (N - (5 - кето - 1 - .Ipoj . 1. - )

Гис) - l - Три) — 1 - Сер) - 1. - 1к» - l ли (VI) во безводном инертном растворителе обра атывают а

576920 о раствор гродолжают перемешивать при -20 С в течение 30мип1при 0 C 30мини при температуреледяной бани 18 ч. Раствор фильтруют и осадок промывают ( сухим диметилформамидом (дважды по 2 мл), Объединенные фильтраты концентрируют в вакууме при 40 С. Остаток растворяют в метаноле (5 мл) и медленно добавляют диэтиловый эфир (500 мл). Выпавший осадок отделяют, высушивают и подвергают очистке путем распределительной хроматографии на химически модифицированном сшитом декстране (Сефадекс Н-20) с применением нижнего слоя системы и-бутанол — уксусная кислота- вода (8:4:40). Объединенные фракции концентрируют досуха в вакууме при 45 С, растворяют в метаноле (5 мл) и добавляют к диэтиловому эфиру (250 мл) . Осадок собирают фильтрованием, 25 высушивают и получают целевое соединение (а) — 53,50 (с -1,0 1%-ная уксусная кислота), выделяемого в виде хлоргидрата.

Найдено,%: С 52,25, Н 6,23, N 19,32,0 19,10, С! 2,95.

С55Н75И17015 2Н О НС!

Вычислено,%: С 52,67, Н 6,43, N18,99, О 19,14, Cl. 2,83.

При проведении осаждения в строго безводных условиях и в присутствии хлористого водорода целевое соединение получают в виде дихлоргидрата.

Найдено,%: С 52,10, Н 5,92, N 18,85, О 17,20, Cl 5,75.

С5 5 Н7 5 М17 013 ° 2НС!

Вычислено,%: С 52,62, H 6,18, N 18,96, О 16,57, CI 5,64.

При аминокислотном анализе определен следующий состав аминокислот:

Гистидин

Аргинин

Серии

1,0 — 1,04

Пронин

Глицин

0,96 — 1,03

0 95 — 0,93

2,01 — 1,98

0,90 — 0,86

Лейцин

0,86 — 1,02

Глутаминовая кислота

1,12 — 1,04

1,07 — 1,04

Тирозин

Электрофорез при рН1,6 в 8 -нем водном растворе муравьиной кислоты при 3500 В дает только одно пятно, что указывает на однородность соединения.

Аналогично, но с применением трет-бутилнитрита вместо изоамилнитрита также получают целевое соединение.

Аналогично, но с применением других неорганических кислот, например бромистоводороднйй или серной кислоты в тетрагидрофуране вместо хлористого водорода, получают соответственно бромгидрат или сульфат целевого соединения.

При желании указанный хлоргидрат об рабатывают амберлитом JA = 400 или JA = 410, предварительно превращенном в соль с фармацевтически приемлемой кислотой. После элюирования получают соответствующую соль целевого соединения. з сильной минеральной кислотой и органическим нитритом при температуре от -30 до -10 С, затем с реакционную смесь подщелачивают сильным органическим основанием и добавлятдт раствор диацетата N - (N - (й - (й - 1. - Лей) - 1. -Арг (- L - Про)-Гли ЙН (V) в безвотпюм инертном растворителе с последующим перемешиванием при температуре от

-30 до -0 С и выделением целевого продукта в свободном ви1. е или в виде солей. ! о

Пример 1, Хлоргидрат дигидрата 5 - кето - L- пролил - ° гистисдил - 1.- триптофил- - серил-l - тироэилглицил- - лейцил - - аргинил - 1.-прол. яглицинамида (I) . Берут 0,840 г (0,762 ммоля) трифторацетата гидразида 11! - fN- (й- fN- (й- (5-, - кето - L - пролил) - I - гистидил) - - триптофил)" ! - серил) - 1. - тирозил) - глицина (IV), растворяют при 0 С в смеси 3,7 мл сухого диметилформамида, сухого диметилсульфоксида и 2,77 мл

1,65 н. раствора хлористого водорода в сухом тетрагидрофуране.

К смеси, охлажденной до -20 С, добавляют при перемешивании 10 ный раствор изоамилнитрита в сухом 11иметилформамиде (1,12 мл, 0,83 ммоля), перемешивание продолжают 30 мин при -20 С. 25

Затем к реакционной массе, охлажденной до -25 С, медленно добавляют 0,7 мл триэтиламипа до получения слабоне5лочного раствора рН 8-9). Поддерживая температуру -20 С, при перемешивании добавляют раствор диацетата N - (N - (N - (N -L- лейцил) - - аргинил) - - пропил) - глицинамида (V), (0,427 r, 0,762 ммбля) в сухом диметилформамиде (4,5 мл) и триэтиламине (0,28 мл) . Полученный

Указанный хлоргидрат можно также обрабатывать в водном растворе солью щелочного металла и танина, альгиновой или яблочной кислоты и соответствующие таннаты, альгинат или памоат гормона выделяют фильтрованием или центрифугированием, Кроме того, соединение 1 может быть переведено в цинковый комплекс.

Цинковый комплекс 5 - кето - - пролил - Lгистидил - - трицтофил - - серил - L тирозилглицил - - лейцил - - аргинилпролилглицила мида.

К раствору дихлоргидрата декапептида 1, полученного по методике, описанной в примере 1 (100 мл), в воде (0,8 мл) при комнатной температуре добавляют 0,19 мл раствора ацетата цинка

Zn (ОСОСН5) z "2HzO 0,1 г (мл).

576920

К смеси по каплям и при перемешивании добавляют 2 н. раствор едкого натра (0,1 мл) . Каждая капля раствора едкого патра вызывает образование тяжелого осадка, который перемешивают до его исчезновения и образования прозрачного раствора.

Процесс завершают добавлением 0,1 н. раствора едкого патра при рН 8,0 - 8,2, когда больше не происходит растворения осадка. Конец осаждения определяют по добавлению одной капли раствора едкого патра к прозрачному верхнему слою. После выдерживания в холодильнике в течение ночи указанное в заголовке соединение отделяют фильтрованием, промывают водой (0,1 мл) и высушивают в глубоком вакууме. УФ вЂ” поглощение: 289 нм (Е1см 42), 279 нм (Е!см 56) и 222 нм (Е1с

374). Для пояснения, в приведенных далее примерах описаны способы синтеза промежуточных продуктов - трифторацетата гексапептидгидразида (примеры — 1-8, 16, 17) и диацетата тетрапептида (примеры 9-15).

Пример 1. Бензиловый эфир N - (N - (5--кето ° 1 - пролил) - 1 - гистиридил) - L - триптофана

Гидразид N - (5 - кето - 1. - пролил) - Lгистидина (0,840 r, 3 ммоля) растворяют в смеси (при 0 С) сухого диметилформамида (14 мл), сухого диметилсульфоксида (10,5 мл) и 2,4 н. раствора безводного газообразного хлористого водорода в сухом тетрагидрофуране (7,5 мл) .

Раствор охлаждают до -20 С и лри перемешивании добавляют изоамилнитрит (0,57 мл) . Реакционную массу перемешивают в течение 30 мин при -20 С, затем охлаждают до -24 С. Медленно добавляют триэтиламин (3,2 мл) до получения слабощелочного раствора (pH 8-9) . При неремешивании и температуре - 20 С добавляют раствор бензилового эфира 1 - триптофана (0,970 г, 3,3 ммоля) в сухом диметилформамиде (3,0мл). Реакционную массу перемешивают при -20 С в течение 30 мин и при

0 С в течение 30 мин, а затем при температуре ледяной бани в течение 18ч. Раствор фильтруют, осадок промывают сухим диметилформамидом (дважды по 2 мл). Объединенные фильтраты концентрируют в вакууме при 40 С. Остаток растворяют в метаноле (10 мл), медленно добавляют диэтиловый эфир (300 мл) и образующийся осадок отделяют фильтрованием. Осадок снова растворяют в метаноле (10 мл) и осаждают добавлением диэтилового эфира (300 мл). Осадок перекристаллизовывают из метанола и получают целевое соединение в виде тонкого белого порошка, т.пл. 250 — 252 С, (а),, + 1,6 (с = 1,0, ДМФ).

Аналогично, но с йрименением вместо изоамилнитрита трет. бутилнитрита или с применением метилового, этилового, изопропилового или ибутилового эфира триптофана получают соответствующие метиловый, этиловый, изопропиловый или и-бутиловый эфир указанного в заголовке соединения.

Пример 2. Гидраэид N - (N - (5 - кето - ) ° . пролил) - 1 - гистиднл) - .- триптофана (II).

Гидрат гидразина (99%, 1,5 мл) медленно при перемешивании добавляют к раствору бензилового эфира N - (1ч - (3 - кето - 1. - пропил) - L-гистидил) - L - триптофана (пример 1, 0,868 r/ в безводном метаноле (150 мл) при -10 С. После перемешивания в течение 3 ч прн температуре ледяной бани раствор дополнительно перемешивают в течение 40ч при комнатной температуре. Смесь отфильтровьвают и кристаллический осадок перекристаллизовьвают иэ метанола с получением указанного в заголовке соединения в виде мелких игл, т.пл. 165-169 С, (а) з — 24,6 (с =

=1,0, ДМФ).

Аналогично, но с применением в качестве исходного материала метилового, этилового, изопропилового или и - бутилового эфира вместо бензилового эфира, также получают указанное в заголовке соединение.

Пример 3. N - (N - (5 - кето - L -пролил)1 - гистидил) - I - триптофан.

Смесь бензилового эфира N - (N - (5 - кето - б-пролил) - L - гистидил) - L - триптофана (пример 1, 0,300 г, 0,555 ммолей) и 5% палладированного угля (0,060 г) в ледяной уксусной кислоте (80 мл) быстро перемешивают в среде азота в течение 16 ч при комнатной температуре. Смесь фильтруют через диатомовую землю (Целит) и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в метаноле (10 мл) и к раствору медленно добавдяют диэгиловый эфир (100 мл) при тщательном nepel мешивании. Выпавший осадок собирают, растворяют в метаноле (10 мл) и переосаждают, медленно добавляя диэтиловый эфир (100 мл) . Осадок собирают, растворяют в метаноле, обрабатывают углем (0,20 г) и фильтруют через диатомовую землю (Целит). Фильтрат упаривают с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого белого стекловидного вещества, применяемого без изменения на последующей стадии.

Пример 4. N - Бензиловый эфир N - (О-бензил - N - карбокси - L- тирозил) - глицина.

К раствору метилового эфира N - бензилового эфира N - (o- - бенэил - N - карбокси - 1.-тирозил) — глицина (21, 0,0042 моля) в метокси45 этаноле (25 мл) добавляют водный раствор гидроокиси натрия (1 н,, 5 мл) при тщательном перемешивании, После полного растворения осадка (примерно через 1 ч) добавляют водный раствор соляной кислоты (1 н., 5,25 мл) при охлаждении.

5О Осадок промывают водой и перекристаллизовываютизсмеси метанола.с водой с получением у к аз а ни о го в заголовке соединения с т.пл. 166-167 С, (а), — 22,6 (с = 1,0 ДМФ) .

Аналогично, но с применением этилового, пропилового, изопропилового или и - бутилового эфира исходного соединения вместо метилового эфира или с применением в качестве растворителя метанола, этанола, пропанола, бутанола или 2о0 -этоксиэтанола (Целлозольв) вместо метоксиэта576920 иола, также получают укаэанное в загол: и:- единение.

Пример 5. трет.Бутиловый эфир

-карбоксигидразида N - бензилового эфира и - (О-оензил - N - карбокси - 1 - тирозил) - глицина, Раствор N - бензилового эфира N - (О - бензил-N - карбокси - I - тирозил) - глицина 1пример 4, 2,312 г, 0,005 молей) в сухом тетрагидрофуране (О 7 мл, 0,005 молей) охлаждают до -10 С. При перемешивании добавляют этиловый эфир хлормуравьиной кислоты (0,48 мл, 0,005 молей), а через 10 мин - трет. бутиловый эфир гидраэинкарбоновой кислоты (725 мл, 0,005 молей) и смесь выдерживают в течение 30 мин при 0 С, а затем 5 ч при комнатной температуре. После упаривания растворителя остаток обрабатывают этилацетатом (100 мл), отфильтровывают и фильтрат промывают последовательно водой (2х20 мл), водным раствором аммиака (Зх20 мл) и насьцценным раствором хлористого натрия (2х25 мл) . Этилацетатный слой высушивают, упаривают при понижеш1ом давлении и остаток перекристаллизовывают иэ смеси бензола с гексаном с получением указанного в заголовке соединениЯ с т.пл. 88-90 С.

Пример 6. трет. Бутиловый эфир 2

-карбоксигидразида N - L - тирозилглицина.

К раствору трет-бутилового эфира 2 - карбоксигидразида-й - бензилового эфира N - (0-бензил - N - карбокси - L - тирозил) - глицина (пример 5, 2,88 г, 0,005 моля) в сухом метаноле (40 мл) добавляют палладированный уголь (5%, 200 мг). Гидрирование осуществляют в гидрогенизаторе с подсоединенной к нему емкостью с перемешиваемым раствором гидроокиси натрия (4 н., 40 мл) для поглощения двуокиси углерода. Через

4 ч катализатор отфильтровывают через диатомовую землю, фильтрат упаривают в вакууме при

30 С и получают указанное в заголовке соединение в виде маслянистого остатка, применяемый на последующей стадии без очистки, Аналогично, но с применением в качестве катализатора платины вместо палладия, также получают указанное в заголовке соединение.

Пример 7. трет.Бутиловый эфир 2 карбоксигидразида N - бензилового эфира N - (N-(N - карбокси - I - серил) - I - тирозил) - глицина.

К раствору 2,4 - динитрофенилового эфира N-бенэилового эфира N - карбокси - L - серина (1,6 г, 0,004 моля) в сухом диметилформамиде (10 мл), охлажденному до 0 С, добавляют раствор трет.бутилового эфира 2 - карбоксигидразида N

- тирозилглицина (пример 6, 1,689 r, 0,005 моля) в сухом диметилформамиде, Реакционную смесь выдерживают при 0 С в течение трех дней. После упаривания растворителя остаток обрабатывают смесью хлороформа, метанола и пиридина (100: 25: 1) и хроматографируют с применением

100-кратного количества двуокиси кремния.

Чистый материал растворяют в небольшом количестве метанола и осаждают добавлением эфира с ио.

10 иучешгем чистого соединения, укаэанного В эагoJIQBке, с т.пл. 65-95" С, (а) — 13,1 С. (с — 1,0, ЛМФ).

Пример 8. трет. Бутиловый эфир 2карбоксигидразида N . (1ч - L - серил - - тирозил)- глицина (III), Смесь трет. бутилового эфира 2 - карбоксигидразида N - бензилового эфира N - карбокси - L-серил - 1 - тирозилглицина (пример 7, 0,96 г) и 5% палладированного угля (0,090 г) в метаноле (35 мл) быстро перемешивают в атмосфере водорода и в течение 7 ч при комнатной температуре по методике, описанной в примере 6 (нри этом поглощается 49 мл водорода). Смесь фильтруют через диатомовую землю (Целит) и фильтрат концентрируют в вакууме, Остаток перекристаллизовывают из смеси метанола с диэтиловым эфиром и получают указанное в заголовке соединение с т.пл. 132-135 С. (n) 2, --5,4" (с = 1,0/ЛМФ).

Аналогично, но с применением в качестве катализатора платины вместо палладия также получают указанное в заголовке соединение.

Пример 9. N - Бензиловый эфир - 2- ((N-карбокси - 1 - пролил) - амино) ацетамида.

К раствору N - бензилового эфира N - карбокси

25 - L - пролина (12,5 r, 0,05 моля) и хлоргидрата этилового эфира глицина (7,26 г, 0,052 моля) в хлороформе (100 мл) при перемешивании и 0 С добавляют триэтиламин (7,28 мл, 0,052 моля), затем дициклогексилкарбодиимид (10,7 г, 0,052 мо30 ля). После перемешивания в течение 16 ч при 0"С осадок отфильтровывают и фильтрат промывают последовательно водой (50 мл), соляной кислотой (1 н., 50 мл), водой (50 мл) и насыщенным раствором хлористого натрия (50 мл), высушивают

ЗS над сульфатом магния и упаривают. Остаток обрабатывают метанолом, насыщенным аммиаком при

0 С (150 мл) и выдерживают при этой температуре в течение 48 ч. После упаривания растворителя в вакууме остаток перекристаллизовывают из

40 смеси метанола с эфиром и получают указанное в заголовке соединение с т.пл. 112-115 С, которое после перекристаллиэации из смеси метанола с изопропиловым эфиром имеет т.пл. 116-120 С, (а) — 43 8 (с = 1 0 МеОН)

Пример 10. Хлоргидрат 2 - ((N -пролил). амино) - ацетамида.

Раствор N - бензилового эфира 2 - ((N- карбокси- L -пролил) - амино) ацетамида (пример 9, 9,610 мг, 2 ммоля) в ледяной уксусной кислоте (8 мл), содержащей хлористый водород (2 ммоля), перемешивают с палладированным углем (5%, 50 мг) в атмосфере водорода по методике, описанной в примере 6 (до поглощения одного моля водорода) . Фильтруют, фильтрат

55 упаривают досуха, остаток высушивают в вакууме. Получают указанное в заголовке соединение, применяемое без изменения на последующей стадии.

Аналогично, но при использовании в качестве

60 кагализагора платины вместо палпадия, также

57692() получают указаш»се в заголовке соединение, 1 акже аналогично, но с применением бромистсго водорода ини серной кислот»1 вместо соляной кислоты, получают соответственно бромгидрат или сульфат указанного в заголовке соединения.

Пример 11. N - трет.Бутинсвый эфир N - (1<)— — (N - карбокси - N - нитро - 1 - аргинин)

-ПРОЛИЛ) - ГJ!HllH!iBMHJIB.

К раствору N - трет. (JyTHJtoftof0 эфира N-карбокси -N - нитроаргинина (607 мг, 1,9 ммслей) и N - оксисукцинимида (437 мг, 3,8 ммоня) при

-10 С добавляют дициклогексилкарбодиимид (388 мг, 1,9 ммоня). Смесь перемешивают в течение 1 ч при -10 С, 2 ч при 0 С и ч при комнатной температуре, К раствору хлоргидрата 2 - ((1

-пролил)- амино) ацетамида, полученного по способу, описанному в примере 10, в димети<пформамиде (4 мл), добавляют триэтиламин (0,38 мн) и эту смесь добавляют к раствору активированного сложного эфира, описанного выше, при температуре 20 около 0 С. Реак»»ионную массу перемешивают в течение 14 ч при 0 С, а затем в течение 24 ч при комнатной температуре и упаривают досуха llpH пониженном давлении. Остаток растворяют в смеси хлороформа и метанола (100:15) и хрсматографируют на 100 г двуокиси кремния. Чисто . указанное в заголовке соединение выделяю г из абсолютного этанола в виде гелесбразно) с осади,, спекающегося при температуре примерно !65 С, () э — 25,80 (C = 1,0 ДМЮ

Аналогично, но с применением бромп»драта нли сульфата 2 - ((1<) - пролил) амино) апетамида вместо хлоргидрата получа10» также указанное в заголовке соединение.

Пример 12. N - Fpef. Бутиловый эфир - 11(N - карбокси - N - нитро - I - арги)»1»лj - L— пролила.

К раствору хлоргидрата метинсвогс эфира::

-пролина (5,85 г, 35,4 ммоля) и N - трет. бутннсвсг0 эфира N - карбокси - iN - нитрсаргинина (9,4 ., 40

29,4 ммоля) в ацетонитриле (10 мн) и диме)1::лформамиде (25 мн) добавляют т)энэ)31ламн1» (4,95 мл). Смесь охлаждают до -10 С, добавляют дициклогексилкарбодиимид (7,25 г 35,2 ммоня) и выдерживают затем 5 ч при 0" С и 0 ч при ком (BT"

НОй тЕМПЕратурЕ, ЗатЕМ фИЛЬтруЮт И фпньтрат ó!Tàривают досуха при пониженном давлeH;!H. Полученный остаток обрабатывают эп»лацетатом (300 мл) и промывают последовательно раствором лимонной кислоты (1ОЯ-ной, дважды Jtc 90 мн), 50 раствором аммиака (I H., трижды пс 90 мн) и насышенным раствором x! IopHcTOFO натрия (90 мл) . 1"-аствор су)па» и упарнваюг, полученный в oc IBI Ye маслянистый продукт растворяя)т в метано ie (88 мн) и обрабатывая)т водным рВс ворс)м гидрсокнси натрия (1 и., 88 мл), смесь пе1)< ме<дн„"3 IOT в течение 1,ч при комнатной темнерагуре. 0t)pB30BBBIIIHHctf осадок от<риньтрсвыван)т, фидьтрат экстрагируют

31»1))ане11110л» (триждь) пс 150 мл ). Водную фазу п<)нк)1 < tB)T co! IHlt<)11 к) с".1<)1<)й (4 kt.. 30 мл) и экстрагнр»чст этилацетаforit (трижды пс 150 мл), 0()l eд1ше! Н»ые этилацетат)!ые экстракты ftpoMhlBBloT

HBcbttftåktHûM раclâîðoì хлористогÎ натрия, высупгивают над сульфатом магния и упаривают в вакууме. Указанное в 3BFO;IoH e соединение получа)ст в виде аморфногс остатка, дающего одно

00110внсе пятно при энектрофорезе в водном буфере при рН 5,3, содержащем ниридин (!%) и уксусную кислоту (0,32%) при 4000 В. Соединение применяют беэ последуюшей о п»стки на следующей с -z<п»и.

Ана.)сги !НО. 110 с прнмене11иеь» этилового, и30пропиловсгс или H - буп»нового эфиров L - пролина в; ecTO r.;eii.лс:oFO )с:11ра..: кже получают указанI(9< в 3)гс) . )чк.: <)c!! 0<< ..)<)e.

П р 11 1:1 е р 13. )," - 17)1 F. 13утилсвый эфир N— (N - ":.,"рокси - 51 - ни<ро - L - аргинил) -

-пролил 1 лпцинамил, <71) .

K раств<)ру li) - трет. )Бут»нового эфира N - (N-карбоксн — Nt - нитрс - L - аргинил) - L - пролина (примеi; 17,1 . .1мсля) и хлоргидрата э<0;»ра г>) lцнна (,5 г, 17,1 IvfMQJIJI) B дй):,»е) инфсрь)аьп».1. (45 мл) прн перемешивании, при 0 С дсбав:t,".:-3,-1: эри.)гинамин (2,4 мл), через

10 мин - л< 111)к::.)1 екс» лкарбоднимид (3,52 г, мr;; :! . .е! ".-;;"11 -:H 1ние лссц<м!жают В течение

:р„" .. :: «гн комнатной температуре, - с < . - -",. ".;;1-;.); .--"". .-11ернвают досуха при

ii0i1ltж

0 .. еганоне, k!Bcetùeïíî÷ амм)1аксм. flplt 0 С и вы-с!T)003 )гст л-и э.сй емпературе в течение трех

PB!:;.0t): "пари -ают, сстаток pBcòèðàþò с .. нн,)це)зтс.;--:.: :: -, iiiiFe. ":1»BBat»Hoe в заголовке с<;е:п»енл:-. оса...с,:--:T 1<з абсслютнсгс этанола в

О в)1:1е .;,- <О;1:-Л)<01<.. t)! Л . к< а с T.ÏJI, 1 3-163 С, i,1 Л, ... имеет такие же свойlB., как <.::. ..: .,::::.. 01)санное в примере 11.

А»: B: o:. 1., ч«с, .iio C применением метэ»л(эвсго, иэслрс)н<лс..<л: )-.л)1 1»-бу<нлсвсго эфира глнцина в.,:с<это э<)1лс:)с, с э<)),»Р!<, также пслучаlст укаЗаннсе в загс;)св;e с< ., Ittt e !!e.

Ц р и <м е р 1- ..! - Бенз»новый эфир М - Й - (N—

- (1<).касбскс;-, - 1 - лси)г<1.1) - 1 1 - HTpo - арп»111»л) —, -;,oсн)1)1 - L - глиц)11)а)»ида.

-" l .Г;створ -р,т, -:утилсво10 эфира N - (М -, (N. — карбскси - !v - гн«рс - 1 - аргинил) - L - пролил) глипннаь<ил:" !:ã;;..ã:-м,.еры!! и 13, 817 мг, 1,76 ммолл 1 в: ; —: « )<: кнс.)сте (5 мл) охлаж;;еl!11!,.:: н:;» .,«.: -:; I, t:f,ié при этой темпера—.у;)е 30;:-:,, ",.е:;.1<;: ti;) кап:tt»r» к холодному

1<бе<): "T! . <1, э<)л11 » .":: )н), сб)раздающийся осадок трифтсранеппа М -;И - (1" - нитрс - 1 - аргинил - 1-пролил) - 1 - t(;)o:1;t.!) глинн гамида отфильтровывают

H тд)атe)t:"i:o .» );.ih!i <сi < и.. 1 эфиром. 1!<)сне высуш)<вял)<я в В.)к гk i

576920 диметилформамиде (6 мл), содержащем триэтиламин (0,245 мл), и перемешивают в течение 15 мин при 0 С. К этому раствору добавляют 2,4,5

-трихлорфениловый эфир N - бензилового эфира.Nкарбокси - 1 - лейцина (860 мг, 1,96 ммолей) и каплю уксусной кислоты, и смесь выдерживают в течение 24 ч при 0 С и в течение 24 ч при комнатной температуре. После упаривания досуха в вакууме, остаток растворяют в минимальном количестве смеси хлороформа и метанола (100:15) и хроматографируют на двуокиси кремния (150 г). Полученное хроматографически чистое, указанное в заголовке соединение, в виде аморфного твердого вещества, растворяют в метаноле (3 мл) и осаждают добавлением к этому раствору холодного изопропилового эфира (50 мл) с получением указанного в заголовке соединения, (а), — 38,4 (с = 1,0 ДМФ)

По методике, описанной выше, но с использованием вместо трифторуксусной кислоты хлористого водорода в низшем алканоле или в ледяной уксусной кислоте, получают хлоргидрат N(N - (й - нитро - L - аргинил)- 1 - пролил) глицинамида, который превращают в указанное в заголовке соединение по методике, описаннои выше, Таким же образом можно получить указанное в заголовке соединение при использовании 4- нитрофенилового или 2,4 - динитрофенилового эфиров N бутилового эфира N - карбоксилейцина вместо

2,4,5 - трихлорфенилового эфира.

Пример 15, Диацетат N -((М - (N - (N - 1.-лейцил) - 1 - аргинил) - 1 - пролил)3- Z - глицинами(Н);

Раствор N - бензилового эфира N - $ N - (N - (N- карбокси - 1 - лейцил) - N- нитро- 1.- аргинил)1 глицинамида (пример 14, 805 мг„1,3 ммоля) в ледяной уксусной кислоте (5 мл), содержащей палладированный уголь (5%, 300 мг), применяемый в качестве катализатора, перемешивают в среде водорода по методике, описанной в примере 6.

Реакционную смесь фильтруют через диатомовую землю (Целит), фильтрат концентрируют в вакууме и добавляют по каплям при перемешивании к сухому эфиру при 0 С, Аморфный осадок отфильтровывают, тщательно промывают эфиром и высушивают в вакууме, с полученным указанного в заголовке соединения, которое чистят тонкослойной хроматографией на двуокиси кремния с применением в качестве растворителя системы, содержащей этилацетат, уксусную кислоту, н-бутанол и воду (1:1:1:1), и электрофорезом при рф

1,6 в 8% водном растворе муравьиной кислоты при напряжении 4000 В или при рН 5,3 в водном буфере, содержащем 1% пиридина и 0,32% уксусной кислоты, при 4000 В.

Аналогично, с применением в качестве катализатора платины вместо палладия, также получают указанное в заголовке соединение.

Пример 16. трет, Бутиловый эфир 2г ксигидразида N - ()ч - (N- (N- (N- (5- кето

L. пролил) - L - гистидил) - 1 - триптофил) 1--серил) - 1 - тирозил) - глицина.

Способ А.

1"èäðàçèä N. (N . (5 - кето - 1 - пРолил) гистидил) . L - триптофана (11), (пример 2, 5 о

0,655 r, 1,40 ммолей) растворяют при 0 С в растворителе, соде ржаще м сухой диметилформамид (7 мл), сухой диметилсульфоксид (5,9 мл) и 2,4 н. раствора безводного газообразного хлористого

t0 водорода в сухом тетрагидрофуране (3,5 мл). К о полученному раствору, охлажденному до -20 С, при перемешивании добавляют изоамилнитрит (0,206 мл, 1,53 ммоля) и смесь перемешивают при этой температуре 30 мин затем понижают темпе15 ратуру до -25 С и к реакционной массе медленно добавляют триэтиламин (1,3 мл) до получения слабощелочного раствора (рН 8-9) . Поддерживая температуру -20 С при перемешивании добавляют раствор трет - бутилового эфира 2 - карбокси20 гидразида N (М - L - серил - L - тирозил) глицина (I I I) (пример 8, 0,617 г. 1,40 ммоля) в сухом диметилформамиде (6 мл), реакционную смесь продолжают перемешивать при этой температуре о

30 мин затем температуру поднимают до 0 С и

25 выдерживают в течение 30 мин, а затем 18 ч перемешивают реакционную массу при температуре ледяной бани. Раствор фильтруют, осадок промывают сухим диметилформамидом (дважды по 2 мл) . Объединенные фильтраты концентрируют

30 в вакууме при 40 С. Остаток растворяют в метаноле (5 мл), медленно добавляют диэтиловый эфир (500 мл) и выпавший осадок отделяют фильтрованием. Осадок растворяют в метаноле (5 мл) и повторно осаждают добавлением диэтилового

35 эфира (50 мл) . Собранный осадок перекристаллизовывают из метанола с получением указанного в заголовке соединения в виде тонкого белого порошка с т.пл. 182 С (с разложением).

Аналогично, но с применением грет - бутил40 нитрита вместо изоамилнитрита, также получают указанное в заголовке соединение.

Способ Б.

N- (й - (5- кето- 1 - полил) - L- гистидил) - 1.,триптофан (пример 3, 0,133 г, 0,294 ммоля) и трет.

45 бутиловый эфир 2 - карбоксигидразин N - (N - L-серил - L - тирозил) глицина (ill), (пример, 8, 0,129 r, 0,294 ммоля) растворяют в безводном диметилформамиде (5 мл). При перемешивании и температуре 0 С добавляют, к раствору дициклогексилкарбодиимид (0,061 г, 0,294 ммолей). Проо должают перемешивание в течение 24 ч при 0 С, а затем 5 дней при комнатной температуре, фильтруют и фильтрат упаривают досуха в вакууме. После хроматографирования на двуокиси кремния (20 г) с применением смеси хлороформа с метанолом (2:1) в качестве элюента, объединенные фракции концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в метаноле (2 мл), медленно добавляют диэтиловый эфир (100 мл) и выпавший осадок отфильгро60 вывают, Продукт идентичен. указанному в заго576920

13

Составитель В. Волкова

Техред АДемьянова

Редактор Л. Емельянова

Корректор П.Макаревич

Тираж 553 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР ло делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 2951/702

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 иовке соединению, полученному по методике, описанной выше.

Пример 17. Трифторацетат гидразина N- (N(N - (1ч - (1ч - (5 - кето - 1 - пролил) гистидил) L - триптофил) — 1 - сернл) - L - 5

«тирозил) глицина (И) .

Раствор трет. бутилового эфира 2 - карбоксигидразида N - -(N - (N - f N - -(N - (5 - кето - 1пролил) - L. - гистидил) - L - триптофил ) - t.

- серил) - 1 - тирозил) глицина (пример 16,0,859 r, 1О

0,982 ммоля) в 90 -ной трифторуксусной кислоте, (27 мл) перемешивают 30 мин при температуре ледяной бани, затем столько же при комнатной температуре. Полученную смесь медленно добавляют при перемешиванин к раствору диэтилового эфира (700 мл). Р5

Осадок собирают и нерекристаллизовывают из метанола. Получают указанное в заголовке соединение в виде тонкого белого порошка, т.пл. 200 С (с разложением) (а)-> — 21,2 (с = О,1 вода) .

Формула изобретения

Способ получения декапептида формулы 1

Н-Пир- Гис-Три-Сер-Тир-Гли- Лей- Арг- 25

-Про-Гли-NH . или его солей, путем конденсации пептидных фрагментов в среде безводного органического растворителя при охлаждении,от лича ющ и и ся тем,что,c целью упрощения процесса и улучшения качества конечного продукта, трифторацетат гидразида гексапептида формулы

N - (N - (й - (й - (N - (5 - кето - L - Про) - L °

-Гис) - L-Три) - L - Сер) -1 -Тир) - Гли обрабатывают сильной минеральной кислотой и органическим нитритом при температуре от -30 до -10 С, затем реакционную смесь подщелачивают сильным органическим основанием и добавляют раствор диацетата Н - (га - (N- (й-1 - Лей) - L- Арг) - L-Про ) - Гли - NH > с последующим перемешиванием прн температуре от -30 до 0 С и выделением целевого продукта в свободном вице или в виде солей.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Н. Sivertsson, 1. К. Chaug n др, Syhthesysof

the Luteiniring Rellasing Hormone of the Hypotalamus and its Hormonal Activity, Biochem. Biophys.

Rec. Commun, ° - 44 И 6 1566 (1971) 2. R.,Geiger и др.Synthesys and Characterisation

of à decapeptide having LH — RS/FSH — RH Activity

Biochem. Biophys. Res. Commun, 45, N 3, 767 (1971) .

3. Н. Matsuo и др . Synthesys of the porcine LH

and FSH — Releasiny Hormone by the solid — Phase

method, Biochem Biophys. Res. Commun., 45, РЗ, 822, (1971).