Способ получения щелочной или аммониевой соли инсулина

 

О П-И-"- С А:Н И Е

СОюз СОВетских

Социалистических

Республик (11) 624563

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлеио15.07.74 (21) 2053684/28-13 (23) Приоритет — (32) 16.07.73 (31) 37969 5 (ЗЗ) США (43} Опубликоваио15.09.78.Бюллетень № 34 (45) Дата опубликования описания3!03.13, (51) М. Кл.

А 61 К 37/26

Государственный комитет

Совета Министров СССР оо делам изобретений и открытий (53) УДК 615.45:615..7 (088.8) Иностранец

Ричард Ли Джексон (США) (72) Автор изобретения

Иностранная фирма

"Эли Лилли Энд Компани" (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШЕЛОЧНОЙ ИЛИ AMMOHHEBOH

СОЛИ ИНСУЛИНА

Изобретение относится к фармацевтинесКоА промышленности, а именно к получению лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета.

Известен способ получения препаратов инсулина путем смешивания щелочной или аммониевой соли инсулина с цинком, протамином в соотношении на каждые !00 ед инсулина 0,2 — 1,5 мг протамина при рН раствора 6,5---8,0 !! J . Однако известный способ не обеспечивает высокого качества целево- !р го продукта.

Целью изобретения является повышение качества целевого продукта.

Эта цель достигается тем, что соль двухвалентного металла инсулина растворяют в водно-кислой среде, добавляют соединение щелочного металла или аммония в хелатообразующем агенте, например в этилендиамин-Х,М,N,N òåòðàóêñóñíîé кислоте в кол и честве 0,0002 — 0,05 М при рН 7,6--8,6.

Двухвалентный металл включает элемен- gp ть: Л! В, VIII IB, и IIB групп периодической системы элементов, например марганец, же, сзо. кобальг, никель, медь, цинк и кадмий, предпо ггптельно двухвалентным металлом является цинк.!!(елочной металл включает элементы группы IA до 5-го периода включительно.

Предпочтительны литий, натрий, калий.

Водный щелочной раствор инсулина содержит двухвалентный металл, хелатообразующий агент и ионы щелочного металла и аммония, рН раствора может меняться от

7,6 до 8,6, предпочтительно рН 8,2. Концентрация инсулина с двухвалентным металлом может меняться от 10 до 100 ед/мл. I! рсдпочти гельная концентрация такого инсулина составляет приблизительно 500 ед/мл. Хелатообразующим агентом может быть, например, этилендиамин-N,N,N .N --тетрауксусная кислота, 1,2-диам иноп ропан- N,N, X, N -четырехуксусная кислота, 1,3-диамино-2-оксипропан-N,N,N,,Х -четырехуксусная кислота, диэтилентриаминчетырехуксусная кислота, диэтилентриаминопятиуксусная кислота, гексаметилендиамин-N,N,N,N -четырехуксусная кислота, N-бутилэтилендиамин-N,N,N,-трехуксусная кислота, N-(2-оксиэтил)этилендиамин-N,!х!,N -триуксусная кислота, этилендиамин-!х1,N,N,N -тетрапропионовая кислота и другие. Лучшими хелатообразующими агентами являются полиметилендиаминчетырехуксусные кислоты, самым пре lllочтительным

624563.рацией является 0 2%

3 хелатообразующим агентом является этилеидиамин-N,N,N,N -aexupexywcycnasr кислота, Хелатообразующий агент используют в виде свободной кислоты, либо в виде ее соли со щелочным металлом или аммонием. Если берут соль, катион соли должен быть тем же, что и катион требующегося щелочного металла или аммония в инсулине. Следует учитывать количество добавляемого катиона в результате применения такой соли при определении количества требуемых ионов щелочного металла или аммония.

Для того чтобы удалить двухвалентный металл из инсулина и осуществить быструю кристаллизацию, инсулина на базе щелочного металла или соединения аммония, молярное соотношение между хелатообразующим агентом и двухвалентным металлом в инсулине должно быть 3:1. При более низких соотношениях скорость кристаллизации инсулина на щелочном металле или на соединении аммония из щелочного раствора понижается. При более низких соотношениях растет вероятность того, что двухвалентный металл остается связанным с инсулином.

Концентрация хелатообразующего агента должна составлять приблизительно 0,0002 М и может доходить до 0,05 М. При концентрации инсулина иа базе двухвалентного металла приблизительно 500 ефмл предпочтитель ная концентрация хелатообразующего агента 0,01 М.

Щелочной водный раствор инсулина на двухвалеитном Металле может также содержать ионы щелочного металла или аммония.

Концентрация ионов щелочного металла или аммония может меняться от 0,2 до 1,0 М.

Ионы щелочного металла или аммония могут поступать из любого (или любых) водорастворимого соединения, которое не оказывает вредного действия на инсулин.

Часть требующихся ионов щелочного металла или аммония может быть получена при использовании хелатообразующего агента в форме соли щелочного металла или аммония или при использовании основного щелочного металла пли соединения амМония для регулировки рН раствора. Ионы могут быль получены из хлорида, бромида, фторида, йодида, ацетата, сульфата, фосфата. Лучшими являются хлоридные и фосфатные соли, предпочтительны хлориды.

Щелочные водные растворы инсулина на двухвалентном металле можно приготовить различными способами; Предпочтительный способ заключается в растворении инсулина на двухвалентном металле в кислой водной среде и подгонке получающегося раствора до щелочного рН при помощи подходящего основания. Хелатообразующий агент или дополнительные ионы щелочного металла или аммония можно добавлять в любое время в виде твердых частиц или в виде водных растворов.

Кислый водный раствор инсулина на двухвалентном металле имеет рН 2,5 — 3,5. Кислотность раствора обеспечивают любой неорганической кислотой, предпочтительна хлористоводородная кислота.

При необходимости в кислые водные растBopbl инсулина на двухвалентном металле доба вляют консерванты, например фенал, метилпарабен, а также изотонические агенты, например глицерин, глюкозу.

Количество консерванта составляет 0,4% но весу на объем, предпочтительной концентЗатем кислый водный раствор инсулина с двухвалентным металлом делают щелочным при помощи основания, в основном используют гидроокись щелочного металла или аммония, карбонат аммония и другие аналогичные щелочные соединения.

Другой способ получения щелочного водного раствора инсулина с двухвалентным металлом заключается в растворении инсулина с двухвалентным металлом в водной щелочной среде с рН, равным приблизительно 8 — 9,5, рН конечного раствора 7,6 — 8,6.

Щелочность исходного водного раствора обеспечивают за счет гидроокиси щелочного металла или аммония.

Восстановление щелочности достигают добавлением разбавленной неорганической кислоты, соляной или фосфорной, Концентрированные растворы в инсулине на двухвалентном металле являются более трудными для приготовления, чем разбавленные растворы из-за пониженной растворимости инсулинов на двухвалентном металле в щелочном растворе.

Хелатообразующий агент и ионы щелочного металла или аммония можно вводить в любое время, обычно их вводят перед стадией окончательной доводки рН.

После приготовления водного раствора инсулина с двухвалентным металлом, инсулина на щелочном металле или аммоний инсулин начинает кристаллизоваться из раствора, обычно нри температуре окружающей среды, но при необходимости можно использовать более высокие или низкие температуры. Предпочтительна температура кристаллизации киже 30 С.

Затем полученные кристаллы инсулина на щелочном металле или соединенИи аммония отделяют известными способами.

Обычно кристаллы отделяют центрифугированием и промыва|от последовательно разбавленным, раствором соли щелочного металла или аммония (обычно около 0,5 М), ацетоном, абсолютным спиртом и простым эфиром. Затем кристаллы сушат под вакуумом.

При,яер l. Цинк-инсулин в количестве 8 г, состоящий приблизительно на 70% из инсулина, получаемого от быков и коров, и на

30% из инсулина от свиней„растворяют в

400 мл воды с фенолом и кислотой, которую

624563

Формула изобретения

Способ получения щелочной или аммониевой соли инсулина путем смешения водного раствора инсулина с двухвалентным металлом, отличагощиися тем, что, с целью повышения качества целевого продукта, соль двухвалентного металла инсулина растворяют в водно кислой среде, добавляют соединение щелочного металла. или аммония в хелатообразующем агенте — этилендиамин-N,N, N,N,-тетрауксусной кислоте в количестве

0,0002 — 0,05 М при рН 7,6 — 8,6.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент США № 508!62, кл. А 61 К 17/02, 1972. готовят растворением 0,8 г фенола в 400 мл

0,01 М водного раствора соляной кислоты.

Полученный раствор делят на четыре равные порции и добавляют к каждой порции 2 r хлористого натрия. ь1етыре порции обозначают как пробы — 4.

К трем пробам добавляют четырехнатриевую соль эти."енлнамннтетрауксусной кислоты. Затем рН каждого раствора устанавливают 8,2 путем добавления 40 /р-ного водного раствора гидроокисн натрия. В пробах 2 — !0

4 сразу начинаитобраэовываться кристаллы натрий-инсулина. В пробе 1 кристаллы не образуются даже после перемешивания в течение 3 ч.

Пробу 1 титруют 0,1 М водным раствором этилейдиаминтетрауксусной кислоты (в

15 виде четырехнатриевой соли). При концентрации этилендиаминтетрауксусной кислоты приблизительно 0,006 М начинается кристаллизация натрий-инсулина. Каждую пробу перемешивают в течение всей ночи. Затем крис- 20 таллы натрий-инсулина отделяют центрифугированием, промывают олин раз ацетоном, дважды абсолютным спиртом и один раз простым эфиром.

Затем сушат под вакуумом.

Пример 2/Очищенный натрий-инсулин в количестве 2 г (полученный из поджелулоч:..ой железы быков и коров), имеющий активность 27 ед/мг и содержащий минимальные количества кислых протеиновых примесей, растворяют в 400 мл 0,5 М уксусной кислоты. К получающемуся раствору добавляют

20 мл абсолютного спирта н 0,4 мл 20Р/р-ного раствора хлористого цин,.а, причем последний раствор соответствует 40 мг хлористого цинка на 1 г инсулина. Затем рН раствора доводят до 5,95 добавлением 20Р/р-ной З5 гидроокисн аммония и раствор выдерживают в охлажденном состоянии прн 5 С 72 ч.

Образовавшиеся кристаллы цинк-инсулина собирают центрифугированием, промывают один раз дистиллированной водой и растворяют в 50 мл кислой фенольной воды. Раствор разводят до 100 мл кислой фенольной водой. К полученному раствору добавляют 2 г хлористого натрия и 0,208 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (в виде четырехнатриевой соли). Затем раствор доводят до рН 8,2

40Р/р-ным водным раствором гидроокиси натрия. Начинают образовываться кристаллы натрий-инсулина., Кристаллизация идет при температуре окружающей срелы. Кристаллы натрий-инсулина выделяют центрифугированием, промывают И сушат, как описано в примере I.

Выход натрий-инсулина 1,864 r, что соответствует 93,2 /р.

Пример 3. Повторяют все процедуры по примеру 2, но исходным материалом является натрий-инсулин, выделенный нз поджелудочной железы свиней, с активностью

25 ед/мг. Окончательный выход 1,862 г, что соответствует 93,2 /р.

Пример 4. Кристаллы цинк-инсулина (70 /р иэ поджелудочной железы быков н

30 /р иэ поджелудочной железы свиней) растворяют в 300 мл кислой фенольной воды. 100-миллилнтровой аликвоте этого раство. ра добавляют 2,5 r хлористого. калия, рН раствора устанавливают 8,2 добавленнем

3,5 мл 10Р/р-ного водного раствора гндроокнси калия. К полученному мутному раствору добавляют 0,3 г этилендиаминтетрауксусной кислоты. Затещ рН раствора снова устанавливают 10 /р-ной гидроокисью калия до 8,2.

Раствор перемешивают при температуре окружающей среды (около 25 С) 48 ч. Крис.таллизация начинается в течение первых

12 ч. Получающийся калий-инсулин отделяют центрифугнрованием, промывают дважды абсолютным спиртом, а затем один раэ простым эфиром и сушат под вакуумом.

Выход калий-инсулина 1,736 г (86,8 /р).

Пример 5. К 100-миллилитроной аликвоте раствора цинк-инсулина по примеру 3 добавляют 1,4 г хлористого лития. рН раствора устанавливают 8,2, вводя 6,2 нл М гидроокиси лития. Мутный раствор обрабатывают этилендиаминтетрауксуснои кислотой и рН устанавливают 8,2 при помощи

1 М гидроокиси лития по методике примера 3. Затем проводят кристаллизацию, как в примере 3, получая аналогичные результаты. Образующийся литий-инсулин выделяют, как описано в примере 3, получают

l,234 г (61,6 /p) продукта, Пример 6. Повторяют методику примера 4, но хлористый литий заменяют 1,8 г хлористого аммония,. а гидроокись лития заменяют 60 мл 1 М гидроокиси аммония.

После добавления этилендиаминтетрауксусной кислоты и установления рН при помощи

1 М гидроокиси аммония кристаллизация не происходила после 24 ч. Добавляют дополнительно 1,8 г хлористого аммония. Кристалл из а ци я происходил а после пе реме ш и вания в течение дополнительных 24 ч. Получающийся аммоний-инсулин выделяют, как описано в примере 3, выход 1,018 г (50,9Р/p) продукта.