Способ получения сульфонатов -аденозил - -метионина
ОП ИСАИ И Е
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Союз Советских
С04иалисти4еских
Республик е (61) Дополнительный к патенту (51) М, Кл.
С 07 Н 19/04/
A 61 К 31/70 (22) Заявлено 1L0775 (21) 2152821/23-04 (23) Приоритет (32) 12,07,74
Государе гвенный KoMHTpl СССР ио делам изобретений и открытий (33) Итали я (31) 25128-А/74
Опубликовано 25Р779- Бюллетень № 27 (53) ДК 547.963. .07 (088.8) Дата опубликования описания 2807,79 (72) Автор изобретения
Иностранец
An ь берто Фи еччи (Италия) Иностранная фирма Биоресерч Лимитед Партнершип оф Д-р Ливио Камоззи энд К., (Италия) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФОНАТОВ
S-АДЕ НОЗИЛ-L-МЕТИ ОН И Н A
Изобретение касается способа по- лучения новых соединений — сульфонатов Б-аденозил-L-метионина, обладающих ценными Фармакологическими свойствами.
Цель изобретения — получение ценных полезных соединений, расширяющих арсенал средств воздействия на живой организм.
Это достигается путем синтеза последних, основанного на известной реакции получения солей сульфокислот (1) .
Сущность предложенного способа получения сульфонатов S-аденоэил-Ь-метионина общей Формулы э" гз ч где SAM — S-аденоэил-i-метионин г х = О, 1, 2; n = 1,2; у =1,1,5,2,3,4, причем, если х = О, n = 1,2, у
= 1,5,2,3,4; х = 1, n = 1,2, у
2; x = 2, n = 2, у .= 1, R — ра:дикал .сульфокислоты, выбранной иэ группы, содержащей метансульфокислоту, этансульфокислоту, 1-н-додекансульфокислоту, 1-н-октадекансульфокислоту, 2-хлорэтансульфокислоту, 2-бромэтансульфокислоту, 2-оксиэтансульфокислоту, 3-оксипропансульфокислоту, е,d- е,d-10-камфорсуль-. фокислоту, 8, d- 8, d-3-бромкамфор-10-сульфокислоту, цистеиновую, бензолсульфокислоту, п-хлорбензолсульфокислоту, 2-метилбензолсульфокислоту, 4-ди фен ил сул ьф оки слот у, 1-н афт али ив сульфокислоту, 2-нафталинсульфокислоту, 5-сульфосалициловую кислоту, п-ацетилбен золсульфокислоту, 1, 2-этандисульфоки слоту, о-бен эолдисульфокислоту и хондроитинсерную кислоту, заключается в том, что к водному концентрированному раствору
SAM добавляют насыщенный раствор пикролоновсгй кислоты в воде или органическом растворителе, растворимом в воде, полученный пикролонат подвергают взаимодействию с раствором сульфокислоты RSO>H, где R имеет указанные значения, или со смесью серной и упомянутой сульфокислот с последующим осаждением целевого продукта растворителем, смешивающимся с растворителем, используемым на стадии образования сульфоната.
Обычно органический растворитель выбирают и з группы, содержащей низшие одноатомные спирты, ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, этилацетат, тетрагидрофуран (ТГФ), 676169
2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, диоксин и диметилформамид.
Предпочтительно используют спиртовый раствор сульфокислоты, водный раствор сульфокислоты и серной кислоты в смеси с равкым объемом органического растворителя, смешивающегс5 ся с водой.
Сульфокат обычно осаждают добавлением органического растворителя, выбранного из группы, содержащей бензол, толуол, диэтиловый эфир, дииэопропиловый эфир, ацетон„ метилэтилкетон, метилизобутилкетон, этилацетат, метилацетат, тетрагидрофуран, хлороформ.
Двойную соль сульфокислоты и серной кислоты осаждают при добавлении низшего кетона или алканола, полностью смешивающегося с водой, Известно, что БАМ представляет обой продукт исключительной важности 29 для большого количества биологическйх реакций ферментативного трансметилирования.
Однако большой проблемой, связанной с этим веществом, является его исключительная нестойкость при температуре окружающей среды или выше этой температуры. Кроме того, способ его получения труден и малоосуществим в промхалекных масштабах, Известны иссле,цовакия, направленные на стабилизацию SAM до такой степени, чтобы сделать возможным его применение в областях биологии для того чтобы можно было получать соли„ стойкие IIpH нормальной температуре и и условиях влажности. В результате получены хпорид и сульфат SAM, но они нашли применение только в качестве реагентов в биохимии и толь- 4О ко в течение короткого времени, так как даже в сухом состоянии их стойкость ограничена во времени при ни=-— ких температурах. -Кроме того, способы их получения полезны для полу- 45 чения этого вещества в малых количествах, но не для их получения в промышленных масштабах (1), Согласно изобретению новые соли
SAM оказались необычайно стойкими 50 по времени при температурах до 45 С и их можно получать по новому способу, легко проводимому экономически в годно в про.:ьпалекных масштабах и дающему высокие выходы. 5
Содержание БАМ во всех кислотах данного изобретения остается неизменным даже через 360 дней при 45 C в сухом состоянии . Две наиболее стойкие соли SAM — хлорид и сульфат изменяют содержание SAM через
30 дней при 45 С в сухом состоянии соответственно ка 20 и 50Ъ; через .60 дней хлорид полностью разлагаетая, а сульфат содержит только 5% начального SAM.
Способ получения новых солей согласно предлагаемому изобретению включает в основном следующие ста,ции:
А„ Получают раствор, обогащенный
SAM, экстрагированием из природных веществ, содержащих его, или в результате ферментативного синтеза из адекозиктрифосфата (АТФ) и метионина;
Б. Осаждают БАМ, при сутствукпций в отфильтрованном водном растворе, насыщенным водным раствором пикроло новой кислоты или растворами этой же кислоты в органических растворителях, смешивающихся с водой,. например в метиловом„этиловом, пропилов ом, и зопропиловом, н-бутилов ом или изобутиловом спиртах, или в ацетоне, метилэтилкетоне, метилизобутилкетоне, этилацетате, тетрагидрофуране, 2-метоксиэтаноле, 2-этоксиэтаноле, диоксаке ияи диметилформамиде, 8, Растворяют отфильтрованный осадок в растворе одной иэ упомянутой кислот в спирте, например в метаноле,, этаноле, 1-пропаноле, 2-пропаноле, 1-бутаноле, 2-бутаноле, втор-бутаколе или 2 -метоксиэтаноле или 2-этоксиэтаноле, Г, Добавляют раствор органического растворителя, "мешивающегocR с применяемым спиртом, например бензола, толуола, диэтилового эфира, диизопропиловогG эфира, ацетона, метилэтилкетока, ме.-илизобутилкетона, этил- или метилацетата, тетрагидрофурана или хлороформа, Отделяют органический растворитель и снова растворяют осадок в растворе кислоты, применяемой на стадии В, в одном из растворителей, нримекяемых также ка стадии Б, и обрабатывают раствор обесцвечивающим
V IÃË ЕМ . ь „Добавляют к раствору органичеекого растворителя, способного осаждать чистую соль, SAM в хорошо кристаллическом и легко фильтруемом состоянии„. выбраккого из растворителе. - ":,. указанных ка стадии Г, Первые две стадии способа получения двойных солей с серной кислотой
KДЕHTИЧHН, Последующие стадии можно осуществлять следующим образом:
Ж, Растворяют отфильтрованный осадок в смеси„., содержащий равные объеь .Иые "..асти растворителя, частично смешивающегося с водой, например ,; s HJi3TилHeToHB MeTHJ H зобуTH IKeTo к, H-оутакола или изобута::ола, и води-;о раствора равной. ",окцентрации (в г-3 квив алект ах )::.л!- ой и 3 упо;я;::у: и сульфокислоты ": Iå=:кой кислоты.
3. Отделяют органический слой и добавляют к водному ра;.";вору кетова
6169
1Î или спиртовый растворитель, полно,стью растворимый в воде.
И. Снова растворяют осадок в
10-20%-ном растворе кислоты, применяемой на стадии Ж в одном из спиртовых растворителей, применяемых на стадии В, и обрабатывают раствор обесцвечивающим древесным углем.
К. Добавляют органический раство- ритель, способный осаждать чистый
ЯАИ в хорошо кристаллизуемом и легко фильтруемом состоянии.
В соответствии с одним из вариантов двойные соли получают путем подвергания простой соли полученной в конце стадии В, следующим стадиям
Л. Снова растворяют осадок в водном раетворе (одинаковой нормальности) серной кислоты и кислоты, применяемой на ранней стадии В, и обрабатывают раствор обесцвечивающим древесным углем.
М. Добавляют органический растворитель, способный осаждать чистую соль SAM в хорошо кристаллизуемом и легко фильтруемом состоянии.
Стадию A способа можно проводить разными путями, одинаково эффективными для получения концентрированного раствора ЯАИ.
В примерах приведены способы получения новых солей данного изобретения.
Пример 1. К 90 кг дрожжей, обогащенных SAM (6,88 г на 1 кг), в соответствии с методом Шленка,добавляют 11 л этилацетата и 11 л воды при температуре окружающей среды, После энергичного перемешивания s течение 30 мин добавляют 50 л 0,35 н. серной кислоты, непрерывно перемешивая еще в течение 1,5 ч. После фильтрования и промывания водой получают 140 л раствора, содержащего
4,40 г/л SAM что соответствует
99,5% его количества в исходном ма,териале. К полученному раствору при перемешивании добавляют раствор
2,3 кг пикролоновой кислоты в
25 л метилэтилкетона. После выдержи-. вания в течение ночи осадок отделяют центрифугированием и промывают водой.
Осадок растворяют при перемЕшивании при температуре окружающей среды в 6,2 л 1 н. раствора метансульфокислоты в метаноле. После отфильтровывания следов нерастворимого ма- . териала к раствору добавляют 50 л
:ацетона. После полного осаждения осадка верхний слой раствора декантируют, а нерастворимый остаток промывают небольшим количеством ацетона.
Осадок растворяют в 25 л 0,25 н. раствора метансульфокислоты в метаноле, добавляют обесцвечивающий дре весный уго, ь и раствор фильтруют. К ь фильтрату добавляют 125 л метилизобутилкетона.
Получают 1089 г кристаллического и легко фильтруемого осадка, растворимого в более 20% воды с образованием бесцветного раствора. Соль слабо растворима в обычных органических растворителях. Результаты тонкослойной хроматографии показали, что продукт не содержит примесей.
Аналитические данные приведены в табл.1 и соответствуют соединению общей формулы
СВН 5i О Я4СНО Я, Новое соединение идентифицируют 5 по ферментативному способу, основанному на ферментативном метилировании никотинамида и гуанидиноуксусной кислоты с помощью SAN.
При полном повторении данной методики, но с применением н-додекансульфокислоты и 1-н-октадекансульфокислоты получают соли формул
1Б 23 6 б 14 26
НМО94С Ж 23 6 S 1 38 Sò, аналитические данные которых приведены в табл.2.
П р и и е р 2. 1,15 кг пикролоновой кислоты, растворенной в 10 л изобутилового спирта, добавляют к
70 л раствора, получаемого после лизиса дрожжевых клеток, при этом применяют исходные материалы и способ, описанные в примере 1.
После выдерживания в течение ночи образующийся осадок отделяют центри@у гиров анием. Осадок растворяют при температуре окружающей среды при перемешивании в 3,1 л 1 н. раствора этансульфокислоты в этаноле. После фильтрования от небольшого количества нерастворимых веществ к Раствору добавляют 25 л диэтилового эфира.
После отстаивания смесь фильтруют и
45 осадок промывают небольшим количеством эфира. Осадок растворяют в
12,5 л .0,25 н. раствора этансульфокислоты в этаноле, добавляют обесцвечивающий суголь и смесь фильтруют.
К фильтрату добавляют 63 л бензола.
585 г соли осаждают, фильтруют и высушивают. Полученное соединение растворимо в воде более, чем на 20%, и слабо раствсримо в обычных органических растворителях. Как показали результатй тонкослойной хроматографии соединение не содержит какихлибо примесей.
Аналитические данные, показанные в табл.1, соответствуют продукту формулы С„Н .И ЯО 4С Н О S, Новое соединение идентифицировано также по ферментативному способу, описанному в примере 1.
При повторении методики данного способа, но при использовании 26761
7 бромэтансульфокислоты и 2-хлорэтанe ëüô Kèслоты получают соли формул
"-„Н N, Q„54C,H БС В - v С Н. и Q„S44 Н SG CP..
Аналитические данные для этих солей приведены в абл. 1
П р и м e p 3 1 р 15 кг пикролсно вой хислоты, растворенной н 12 л н-бу анола, добавляют к 70 л раствсра, образующегося при лизисе дрсжжЕвых клеток, полученного по способу лизиса с применением такого же сырья, как в примере 1. После от стаи вани я н течение ночи осадок отделяют центрифугированием. Осадок растворяют при температуре окружающей среды при перемешинании в 3,1 л 1 н. раствора
D 10-камфорсульфокислоты н 1-пропа- 15 ноле. Затем добавляют 25 л бензола, В(павший осадок растноряют н 12,5 л
0,25 н. раствора камфорсерной кислоты в 1-пропаноле и после добавления угля и фильтрования к фильтрату 20 добавляют 63 л ацетона.
Получают 928 г соли. Соединение растноримо в воде более, чем на
20%, и слабо растворимо н обычных органических растворителях.Результаты тонкослойной хроматографии показали, что соединение не содержит каких=либо примесей.
Abrалитические данные табл.l состветстнуют формулам продуктов
С Н2эЬ60э Я 4С о Н16О Б.
Новое соединение идентифицировано также по ферментативчому методу, описанному в примере 1.
При аналогичном повторении метсдики способа, íî с применением о-3†камф-10-серной кислоты получают соль Формулы С к Н N OÄS. 4С„Н О ЯВr, аналитические данййе которой даны в табл. 1
Пример 4 „Очистка специ- 40
Фического фермента.
50 мл сефароэы (полисахарида, производимого фирмой Pharmacia Pine
Спещ1са s рБ, Уппсала, Швеция) спекают и суспендируют в воде, а затем 45 обрабатынают бромистым цианом по известному способу для связывания веществ, содержащих аминогруппы, н матрицы, содержащие полисахаридный гель. K полученному гелю добавляют избыток L-лизина. После реакции гродукт несколько раз промывают дистиллирон иной водой, буферной смесью при РН 8,5 и буферной смесью с рН
4,". Затем гель используют для набив- 5ки колонки диаметром 1,5 см и высотой 30 см. Через колонку пропускают буферную см сь из 0,05 N триэтаноламина и 0,01 М серной кислоты (рН
8,0) до достижения полного равно- 60 вЕсия, В колонку помещают 2 мл дрожжевого экстракта, полученно-о звуковой обработкой или гомогениэацией ,с помощью сухого льда и, возможно, после обогащения специфическим фер:ментом. Колонку затем элюируют той же буферной смесью, которую используют для достижения равновесия, а затем проводят распределение белков н элюате с помощью ультрафиолетовой спектрометрии. Одновременно определяют активность синтетазы в разных фракциях по способу Дж. А. Стекола, rNethods in EuzymoCogy, т. 6, с. 566 (1963). Фракции, обладающие активностью синтетаэы, собирают. Полученный раствор обладает активностью, превышающей активность неочищенного экстракта более, чем в 20 раз. Фермент можно далее концентрировать в этом растворе путем осаждения соля.ми, органическими растворителями или н соответствии с известными способами концентрирования белковых раст" воров„
Получение SAN. 30 мл спеченного геля сефарозы активируют бромистым цианом или любым другйм известным способом связывания белков в матрицы полисахаридного геля. К актинированному гелю добавляют 4 мл раствора специфического фермента, очищенного по указанному способу и содержащего примерно 100 мг белка.
Суспензию актиниронанного геля и раствор фермента перемешивают при
4 C в течение 18 ч Смолу промывают водой. Зти промывные воды содержат примерно 70В общей ферментативной активности от начальной актинности раствора специфического фермента. В результате инкубации сафарозы, полученной по упомянутому способу определения активности синтетазы, наблюдается, что примерно
20В всей активност связывается с полисахаридом.
Полученную сефароэу используют для набивки колонки диаметром 1,5 см и высотой 20 см. Через колонку пропускают растнор, содержащий 0,675. М триэтанолаъин, 0,150 М сульфат магния 0 0= М АТФ, 0 >05 М м-метионин и 0,01. М KCC co скоростью 5 мл/ч при 25-27СС, Элюат иэ колонки анализируют на содержание SAN. Результат анализа показал, что выход составляет 30%.
Получение п-хлорбензолсульфоната.
103 мл элюата, содержащего 6 г/л
SAN подкисляют серной кисло- î.é до рН 3 и к полученному раствору добавляют при перемешивании раствор 2-3 пикролоновой кислоты н 25 мл метилэтилкетона. После отстаивания в течение ночи осадок отфильтровывают и промывают водой.
Осадок снова растворяют в 6,2 мл
1 H. раствора п-хлорбензолсульфокис" лоты .з 2-метоксиэтаноле.
Затем добавляют 50 мл т г:уола, Br=-павший осадок растворяют в 12,5 мл
0 25 н . раствора и-хлор бен эолсульфокислоты н 2-метоксиэтаноле,а посr!e добавления угля и фильтрования б 76169
k фильтрату добавляют 60 мл хлоро форма.
Получают 1,43 r соли. Соединение растворимо в воде более, чем на
20%, и слабо растноримо в обычных органических растворителях. Тонкослойвая хроматография показала, что соль не содержит каких-либо примесей.
Аналитические данные, приведенные в табл.1, соответствуют соедин е н ию ф ар мулы 5 2З 6 5 6 б 3
Новое соединение йдентифицируется также по ферментативному способу, описанному в примере 1.
При аналогичном повторении методики данного способа, на с использованием п-ацетилбензолсульфокислоты, о-бензолдисульфокислоты, 4-бифенилсульфокислаты, 2-мезитиленсульфакислоты и 5-сульфосалициловой кислоты получают соответственно со- 20 ли следующих формул:C н И О 9»
15 23 6 5
"Ъ н н 46 C„>HQ3N6O S 3C1281OO>S C<
«Ъс Н, О Я, аналитйческие данные которых приведены в табл. 1.
Пример 5, Осадок, полученный после добавления пикролононой кислоты к 70 л раствора, как аниса- 30 но в примере 1, растворяют при температуре окружающей среды при перемешивании в 3, 1 л 1 н. раствора 1,2-BTBH+HcQJIb(f)oKHcJIoTH в метаноле.
Затем добавляют 25 л ацетона.
Выпавший осадок растворяют в 12,5 л
0,25 н. раствора 1,2-этандисульфокислоты н метаноле, а после добавления угля и фильтрования к фильтрату добавляют 60 л метилизобутилкетона.
Получают 546 г соли, Соединение растворимо более, чем на 20% в воде, и слабо растворимо в обычных органических растворителях. Результаты тонкослойнай хроматограФии показали, что соединение не содержит каких-либо примесей.50
Аналитические цанные, показанные в табл. 1, соответствуют продукту формулы С Н23 И60 Я 2С2Н606 Я2.
Новое саединенйе идентифицируется также па ферментативному способу, описанному н примере 1.
Пример б. Осадок, полученный п добавления пикралоновой кислоты к 70 л раствора, описанного. н примере 1, растворяют при темпера60 туре окружающей среды и при перемешивании в 3,1 л 1 н. раствора 2-оксизтансульфакислаты н этанале. Затем добавляют 25 л метилизобутилкетона.
Выпавший осадок растворяют и
12,5 л 0,25 и, раствора 2-оксиэтансульфокислаты н этаноле и после добавления угля и фильтрования к фильтрату добавляют 80 л тетрагидрофурана»
Получают 632 r соли . Соединение растваримо н воде более, чем на
20В, и слабо растворимо в обычных органических растворителях. Результаты танкаслайной хроматографии показали, чта соединение не содержит каких-либо примесей °
Аналитические данные, показанные н табл. 1 соответствуют продукту общей формулы
С Н23К4 05 S 4C2H604S
Новое соединение идентифицируется также па ферментативному способу, описанному в примере 1.
При аналогичном повторении методики способа, но с применением 3-ок сипрапансульфакислаты получают соединение формулы
С Н23Н60 6 4С НВО 9, аналитические данные которого принедены в табл ° 1
Пример 7. Осадок, полученный после добавления пикролонавай к".ñëîòû к 70 л раствора, как описана н примере 1, растворяют при температуре окружающей среды и при перемеиивании н 3, i л 1 н. раствора
1-нафталинсульфакислаты в метаноле.
Затем дабанляют 25 л метилэтилкетана. Выпавший осадок растворяют н
12,5 л 0,25 н. раствора 1-нафталинсульфакислаты в метаноле и после добавления угля и фильтрования фильтрат добавляют к 70 л метилэтилкетана. Получают 717 г соли. Соединение растноримо s наде более, чем на
20%, и слабо растноримо в обычных органических растворителях, Результаты танкаслойной хроматографии показывают отсутствие каких-либо
",ðêìåñåé.
Аналитические данные, показанные н табл.1, соответствуют продукту формулы С„ н 23 И60вЯ ЗС,о Нн Оз Я
Новое соединенйе идейтифицируется также по сферментативному способу, описанному н примере 1.
Пример 8. Осадок, полученный после дабанления пикролононой кислоты к 70 л раствора, как описана н примере 1, растворяют при температуре окружающей среды и при перемешинании н 3, 1. л. 1 н. раствора
2-нафталинсульфакислаты з 2-пропанале .
Добавляю= 25 л диизапропилового эфира. Выпавший осадок растворяют з 12,-5 л 0,25 н. раствора 2-нафталинсул факислаты н метаноле и после добавления угля и фильтрования к фильтрату добавляют 70 л этилацетата.
Получают 710 r сали. Соединение растноримо в воде более, чем на 20%, 6 76 169
4Î
5О
Я оО
65 и слабО раствОримо B Обычных ОргaHHческих растворителях. РезpJIbTBrH тонкослойной хроматографии для зтбго соединения показали отсутствие каких-либо примесей.
Аналитические данные, приведенные в табл.1, соответствуют соединению формулы С„ Н зИ О Б ° ЗСл НэО9Б
НОвОе сОединение идентифицируется также по ферментативному методу, описанному в примере 1.
Пример 9. Осадок, полученный после добавления пикролонс1вой кислоты к 70 л раствора„как пока— вано в примере i растворяют при температуре окружающей среды и при перемешивании в 3,1 л 1 н. раствсра бензолсульфокислоты в 2-бутаноле.
Затем добавляют 25 л диизопропилсВого эфира. Выпавший осадок растворяют в 12,5 л 0,25 н, раствора бенЗолсульфокислоты в метаноле и пос" ле добавления угля и фильтрсвания к фильтрату добавляют 65 л этилацетата.
Получают 612 r соли. Соединение растворимо в воде более, чем на
20.3, и слабо растворимо в обычных органических растворителях. Результаты тонкослойной хроматографии для этого соединения показали, что ссединение не содержит каких-либо примесей.
Аналитические данные, показанные
В табл.1, соответствуют продукту формулы С< Н . N О Б ЗС,Н О S
Новые соедйненйя идейтйфйцируются также по ферментативному способу,: описанному в примере 1, Пример 10. Qcaäoê,. полу= ченный добавлением пикролановой кислоты к 103 мл раствора, как показано в примере 4т растворяют пртл температуре окружающей среды H при перемешивании в 6,2 мл 1 н. раствора хондроитинсерной кислоты в метаноле.
Затем добавляют 50 мл ацетона.
Выпавший осадок растворяют в 25 мл
0,25 н. раствора хондроитинсерной кислоты в метаноле и после добавления угля и фильтрования к c!, ..Льтрату дсбавляют 125 мп метили=-обутил.кетона.
Получают 3,27 г соли, Соецинение растворимо в воде более, чем на
20т"; и слабо раствОримО H Обычных
У
Органических растворителях, Резуль" та .. тонкослойной хроматографии по-= казали отсутствие каких-либо примесей.
Аналитические данные, показанн:ые
В табл.1, соответствуют продукту формулы С >Н К.О Б 4С„Н КО. Б
Новое соединение идентифицируется также по ферментативному способу, описанному в примере 1, Пример 11. Осадок, полученНЫЙ после добавления пикролоновсй кислоты к 103 мл раствора, как показано в примере 4, растворяют при температуре окружающей среды и при перемешив анни в б, 2 мл 1 н . раст вора цистеиновой кислоты в 2-этоксизтаноле. Затем добавляют 50 мл диметилацетата. Выпавший осадок растворяют в 25 мл 0,25 н. раствора цистеиновой кислоты в 2-этоксиэтаноле, а после добавления угля и фильтрования к фильтрату добавляют 125 w. метилацетата. Получают 1,53 г соли.
Соединение растворимо в воде более, чем на ?0%, и только слабо растворимо в Обычных органических растворителях. Результаты тонкослойной хроматографии показали отсутствие каких-либо примесей.
Аналитические данные, приведенные в табл„1, соответствуют продукту формулы
С,,Н, Н О Б ° 4С Н ИО Б
Новое соедийение йдентйфицируется также по ферментативному способу описанному в примере 1, Пример 12. Получение двойной соли БАМ с серной кислотой и
-.тетансульфокислотой.
103 мл элюата, содержащего 6 г/л
БАМ, полученного по методу примера
4, подкисляют серной кисло-.îé до рН 3, и к этой смеси добавляют при перемешивании раствор 2,3 г пикролоновой кислоты в 25 мл метилэтилкетона,растворитель А) .
После отстаивания в течение ночи осадок отфильтровывают и промывают водой. Осадок снова растворяют в
18 мл 0,1 н. раствора серной кислоты и метансульфокислоты и в 18 мл метилзтилкетона (ðqастворитель А) .
После перемешивания и отстаивания
Органический слой отделяют, а водный слОЙ взбалтывают тс небольшим кОличеством метилзтилкетона до удалеНИЯ ПОСЛЕДНИХ СЛЕДОВ ПИКРОЛОНОВОй кислоты. После о-..;.еленин водного
Сдтск т,:С B=.Iÿ :.,ò Обесцвечивающий уголь и смесь фильтруют. Получают 16,5 мл вод--orо бесцветного раствора, содержащего 33т8 мл БАИ, что соответству0ф Бритт,содержащегося в исход ном растворе. Анализ с применением тонкослойной хроматографии показал, что раствор содержит только БАМ.
16,5 мл раствора выливают в 100 мл ацетонa (растворитель В) После пере мешивания и Отстаивания жидкость отделяют „:-;екантац.лей., Осадок растворяют в 5,6 г i >";-:Ho - раствор,"- м тансульфокислоты а метаноле (растворитель В) .
П,зсле добавления обесцвечивающеъ го угля и фильтрования раствор вытттлв=-::;т в 25 мл зтип твогт эфира (растй ори"л езч .".).,Смесь фильтруют после
ОССтаИВтаНИЯ И ПОЛУ аЮт ..:=;. ОШО КРИС алл.-:зу мую соль (.,:. тг) следующего
;.ocT aBB: БАМ )9Q, Н.,ЯО4„
Аналитические данные --, =o!;. соли тпоказаны в табл, 2„
676169
При аналогичном повторении указанной методики, но с применением сульфокислот и растворителей, указанных в табл. 2, получают двойные соли, приведенные в табл, 2 с их аналитическими свойствами.
При аналогичном повторении указанной методики, íî с применением
3,3 r 15%-ного раствора метансульфокислоты в метаноле на последующей стадии осаждения 25 мл диэтилового эфира (растворитель Г) получают
1,05 r солй следующего состава:
ЯАМ HSCI4 Н BCI „аналитические данные которых указаны в табл.3 °
При повторении укаэанной методики, но с применением сульфокислот и растворителей, указанных в табл, 3, получают двойные соли, приведенные в табл. 3 с их аналитическими свойствами.
Пример 13. Получение. двойных солей SAM с серной кислотой и
2-оксиэтансульфокислотой.
Соль, полученную после первого осаждения SAM 2-оксиэтансульфокислотой (см.пример 6), снова растворяют в 20 л раствора 0,1 н, серной кислоты и 0,1 н. 2-оксиэтансульфокислоты В метаноле (растворитель А), Смесь фильтруют после добавления обесцвечивающего угля и к фильтрату добавляют 100 л метилизобутилкетона
20
ЗО
Таблица1 а|
Б мсвкс при
260 мкм (Н $0 б н.) SAM %
Я %
Основ н ая формул а
Анион найдено н ай- вычи сдено лено найдено вычислено вычис ленс
Метансульфонат
10, 51 10,72 20, 30 20, 45 50, 3 50,96 188
С НЗ9 ЫЬО S
Додекансульфонат
5р55 5,61 10,91 10,70 26,37 26,68 98
17ь ч
7 127 ь 17
4,72 4,84 9,50 9,22 22,75 22,99 85
Этансульфонат
9i82 10 01 18сб2 19r06 47|12 67t55 175
С Н N 0 $
2-Бромэтансульфонат
7,35 7,28 13,68 13,88 34,67 34,58 127
CHNOSBr
43 6 17 5
2-Хлорэтансульфонат
8р58 8,58 16,31 16,39 40,89 40(84 151
C H N O S C8
2% 4Э 6 47
10-Камфорсульфонат
5,97 6, 33 1 1 р53 12|06 29,52 30,06
57 Ь7 6 21 5
5,14 5 11 9 81 9|75 24,02 24,30 89
8,91 9,30 17|25 17,73 43,82 44,19 163
1-Окт аде к анcyJ lhheooHHaT TС . О„S
О-3-Бромкамфор-10-сульфонат С Н N 0 S Br
55 83 6 2< 5 4
2-Оксиэтансульфонат -, С Н N О S
14 (растворитель Б) . Смесь фильтруют после отстаивания и получают 587 г соли следующего состава:
SAM НЯ04 2С Н.04S с аналитическими б 4 данными, приведенными в табл, 4.
При повторении указанной методики, но с использованием 10 л раствора О, l н. серной кислоты и 0,1 н. раствора 2-оксиэтансульфокислоты в мет аноле (раст воритель A) последующее осаждение метилизобутилкетоном (растворитель Б) приводит к получению 505 г соли следующего состава, SAM HS04 ° Н S04 С Н 04$ аналитические даннйе которой приведены в тасл . 5 °
При повторении упомянутой методики, но с использов" íèåì простой соли SAM, содержащей анионы, указанные в табл. 5, и с использованием растворителей, приведенных в этой же таблице, получают двойные соли, указанные в табл. 5 с их аналитическими свойствами.
При повторении этой методики, но с использованием 3,3 г 15%-ного раствора п-толуолсульфокислоты в метаноле при последующей стадии осаждения 25 мл этилового эфира получают 1,18 r соли:
SAM НЯ04 2СН С Н4$03Н, обладающей свойствами, указайными для продукта примера 1.
676169
Продолжение табл. 1
:о
С Н4 021 Я
24 2 6 Ч4 4
С„Н, 60Ч, Я
Цистеат
С Н N О Я .у 5Ч 6 25 5
С Н N О ЯТЧ йЛ Чо 6Ч
С Н44 О„Я
СЗЗ НззН6 ОЧ Я4 СЕ
45: 47 6 Ч4 +
СФ -НФ,ЪО.Ч Я. н-Ацетилбензолсульфонат о-Бензолидисульфонат
4-Бифенилсульфонат С Н53 N6 ОЧ4 S4
5Ч 53 6 Ч4 42-Мезитиленсуль фон ат С42 Н59Ы60Ч4 Я4
5-Сульфосалицилат С Н4 N О Я
36 4Ч 6 25 4
1, 2-Этандисульфонат
3-Оксипропансульфонат С Н Ы О S
27 $$ 6 2Ч 5
Хондроитинсульфат
Вен эол сульфонат и-Хлорбенэолсульфонат
i-Нафталинсульфонат
2"Нафталинсульфонат
7,75 7,90 12 01 12 05 37,31 37,54 138
11,10 11,08 16р76 lбр90 52i75 52рб4 194
7,49 7,63 11,52 11,64 36,50 Збр25 134
8,50 8,41 12 67 12 р82 40, 1 1 39,94 147
7,99 7,97 12,01 12,17 37,68 37 90 140
10,31 10,78 20,03 20,55 50,б8 51 22 .189
8р79 8р 75 16 р55 16,70 41, 32 41,61 153
12,50 13,02 14,68 14,90 36 92 37, 12 137
5,83 6,26 6,84 7,17 17 21 17,86 66
9,34 9,62 14,22 14,67 45,18 45,69 169
8,10 8,60 12,72 13,12 40,53 40,87 151
8,03 8,20 12,03 12,52 38,73 39,00 144 с
7,83 8,20 11,95 12,52 38,52 39,00 144
676169
1Е!
Ф
Ц
C во х х ь
Л а
1
1 Ъ л1
Ю
»
cl
СЧ
CO
1 » (Ъ! о хо х х
3 Э
Я!
IA
- Pl! !
Ю cF Ф
00 !
РЪ!
М
Ю л
ОЪ
РЪ
М
1О (Ч
Ю
Ю л "3
Э (Ч
О
Ю
Р3 (Ч (Ю л
Ю
U1 л
Ю л
Ю л ь
СЧ
lA л е о х х
»
И! о х о х
Ъ! W ю 1!
РЪ
C)
ГЧ
Ю
Ю
М
lA л
ЧЪ
С Ъ LO л
О\
ttl
CI л
Ф
Ц !
Я м о х х
М сО
CO л
OQ
Ю л
СЧ л
I сО
СЧ
ФЧ
М сО оЪ (CO
I о хо . 6 е х ц
cF О
CO
1ъ
0Ъ
00
Ю
° Ф
t х хааа н х
ФНЭ
Йд) Х
l 3O, Е Н Х !0 Х н а ною!
ЪЪ Е Н !!Ъ 1 !!>! 1 О я@а ео и х
Н Ц ео
М х
I э о
Й х
1 е х
Ф х
I Э
w 4 нхх ено
Мен
Эйе
Яйх
1 1 I
4»Ф хО х но!:х
Фю х о мхнн
1 Х 1
Цн A ххах оо:е
Р4оюо &
Хек
I 1 I йЗох
1 1
6) QI !O 5
Ж I НХ
Е о! 1н
ChC 43 е !!! е ц х счВЬЕ
Е ф
И I М Ф
1 gh.g Х
- ео3
I мkAФ
I4 Х К Х ! a o гЕVe
0 (A
XO x
f хю ЫО
Dam X
0! 1 сЧ о, о е е
C Ц е х о х
v о х !
Ф х о о
Н
v ф о" я
+ х и
1 о ц а йЙ & Ф 5 ! ъъх е х1ъ
Ы
tO г о
0 к
ln х
М и н
Ф
lA
U1 о"
° 0
0
Ф1 х и
МЪ
01 ч» о
Ф х и
1 о
Ре
Ьф
III е и х (Ч
Н о о 15но
<мхах м
И о
z О х и
20 о !
» л
СО ! ч
I бс
В(Ф бо х х
C)
С)
Ch 3« и
Г )
CO
С»
«Ч
Г«Ъ
»
CO Ф«
Ц
mo х х гM
»
tA
«« ( и
Г»
СС!
С0 л
1 бс
Ц бо х х
QO - 111 с»с Ю
М » о в
«Ч
1 х о бс
Pl сР
Р1
C) л о с.
i чс о
Я ж
+ х о о о
1 о ! 0«!
0 К
QXx
00Н
1ОЕ
«»
1 к х х о
O I I
Я Q ф
Ю Х с к х о !
II uz
K Ы Сб
101
С«С С.1 СС) б
С1 бс о и х
1-1 С»
Й х к
W 0 сд х
Сб х с!
1 К а ссс х
1 б х
1 (3
Я Щ ф с
Х
1о х
С" CQ х о сне а, ох, С4 И см — с« х
0 о с-« и ф
С4
Са о ю
R о ж и
1 бС
К х ! х х е с о
Ебсс«
1 о х в ф Д
1.1 !» С-1
5 «сб
zoz
С1 о С
С 1
V1 х сс .
СЧ и
К I ССС х» х
Ссо КХ ао хо
Л С-: С 1 о ! & бС 1 Д к(хк с
О Ф ь 63
Itk Yx
676 169
И
Ф о
«Я
Ф х и
1 Д х к! á ьсб сч СОХ
-mao
4 4 Ц &
Ф
И
СO !!
Е Ф
СС«
N и
Э сч
М
1 1 1Д1б х к х ! хэо,о
ИС!0mue а
«О г о О к
C) х
CG и ц х
xeio с окс ссс я х ссс
Я х сI к в 1б
ИОХС. ! ох б
СЛСЭК К
° СИ о
«С
R сс
Р
СС и
22
1» л л
С0
СЧ
» (31
° 1 м
° Ф
E г»
° Ф
Ch (Ъ1
» л м
Ю м
».
Ю Ф ь
ill а
Ch м
Ж
С0
» (3 Й л
Ю
» л м
1 »
CP
»
Ch м
Ю
СЧ
»
И 3
0Ъ м
Ch л4 (Ч
Ю
»
1 л
С 4 м
»
CO л
Ф»
ОЪ, л
60 л
»
1 л л л
ОЪ Ф
CO
Ю
-3 л4
Ю
М
CD л
lA л
CO м
О\
\О (Ч
» 3
Ю
»
Ю
° Ф
» О о
И
К л
С Ъ с ь л
4-4 ь
» (Ч
1Ч ь
» ь л
Ю м
СО
I Ф о
И х
С 4
М
И о
1 х
l6 н
0Ъ!
Ц во
Е й! и во
Е х
1с
И о4
CO
Ж
t 1 1
C;gQ йоцх е. ъх о йхнн
1 I о
u1e
М X 0
О6 Н н>,п mum
МЪ
И о"
С6 ж
I Х О
Мха
1Ое
О
1 &
Х е6
I6 1„
Н +I6
III us
676 l69
N о
Ф
I 1
16Îõ
С4 и нk(Q сх>
& и &
1ОО о ах
ВВ6 CI
Х 1 1:
Ih
И
O о
Р
С4
0 х Ln
1 I
<6 он
1 ОЪ Х б
<11 ОХ!
C 1
НХ1Н
ИЮЛЮ
ОЫ1:Х
-л genug
Q о
Ф
О \ ж б и
1 а
О 1
ЙФцх
1 Н О
nIAu&
In
И о.
z е4 Ф х и
I о а
I I
Ф М
1- 1. 8 Q н
6И 6 ххх х о
eq8
676 469
24 х
«»
СЗ гч с)
П1
Р )
Ф
Ц
Ф е о х х л
01 ь
Г ) 1 л л ь л л
С> м 1 л
СЧ
Ю ь
Ch cP
Ul
1 ь (Г) л
1 о х о
4!4 Ц .О
Р1 с1 л
Ю с) ь
Р1
< Ч
»T ь л л
О1
lA л
9
Ц
C е о х х
r! с>
«4 (Ч ь
1О л (4 О л ч (ь
И л 1 л г1
1Я
»й
1 (71
О1 ь л
Ч о
x o х
3 Ф
Щ 4» о
Х 1
Ф 9
Ц Ц
C К
9 х х
С" 1 l ь
«t
«1 (М
«4 ( ь
I и
О
2 9
Х 1 п3 х
М о х о о х
- !
1 х ц
v o
Х X
O 9
f4 ц о
1 о
0.1 Л ДН
Д, Я I» 63 I!I:e а,»х
xo vo
1-1 1 e I e
Ц о х
9 н б) 1 о х
9 н
;Т) х о
X х
M о
1Х
I 4о х
3 o+
X o 5 р о х
1
9 х а, о
О»
Ф
И о О
z х и и
i 1 ц ц х х о нонн
9 11» 9
Их ох
1 ф н
Ф о
Е х
X н
ХХДФ охрах н: о p>ue
Ч.
I о»
R Ф х (44
1
М 4 Н
4=дх о оцх п»о х О &
1 Ж
О!0.
И R3
М
Ю
Ф
N о Я
З х, 4е) и
И
44 о
К
Ж
4 1 вх I
ФХ 49
Ж 4: Ц х . се
Ф
N о
Е ж
»
U ц» х
Xe1 O ноцн
9mX9
Е х
1 Н
I I 44 9 х ц ц х
Фо»о
Иmo& 4
И
44
СЧ
9 Н
Л 1 х
Г) х
1 и
X 1„Н
9 !»С
II4gOX
o tn <3
6 76 269
Формула изобретения
Составитель Г. Коннова
Техоед,. М. Петко Корректор С. ПатрУшева
Тираж 512 Подпи снсе
ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035 Москва Ж-35 Раушская наб, д, 4 5
Редактор Т. Загребельная
Заказ 4359/53
Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная,4
Ь
1 ° Способ получения сульфонатов
S-аденозил-L-xe vovzaa общей формулы
SAM (H2SO4)x ((S03H)h 4У где SAM — S аденоэил-L-seexmossa; 5 х = О, 1, 2; n = 1, 2g у = l 1 5, 2, 3, 4, причем, если х = О, и
1, 2, у = 1, 5, 2, 3, 4; х
1, n = 1,2, у= 2; х = 2 и = 2, у = 1, R — радикал сульфокислоты, выбранной из группы, содержащей метансульфокислоту, этансульфокислоту, 1-н-додекансульфокислоту, l»н-октадекансульфокислоту, 2-хлорэтансульфокислоту, 2-бромэтансульфокислоту, 2-оксиэтансульфокислоту 3-оксипропансульфокислоту, 8g й- 6 p d-10-камфорсульфокислоту, Ю, d- С, d-3-бромкамфор-10-сульфокислоту, цистеиновую, бенэолсульфокислоту, п-хлорбенэолсуль фоки слоту, 2-метил бен з олсульфокислоту, 4-дифенилсульфокислоту, 1-нафталинсульфокислоту, 2-нафталинсульфокислоту, 5-сульфосалициловую, п-ацетилбензолсульфокислоту, 1,2-эт анди сульфоки слоту, о-бензолдисульфокислоту, хондроитинсерную кислоту, отличающийся тем, что к водному концентрированному раствору SAM добавляют насыщенный раст- ЗО вор пикролоновой кислоты в воде или органическом растворителе, растворимом в воде, полученный пикролонат подвергают взаимодействию с раствором сульфокислоты RSO Í, где R имеет укаэанные значения, или со смесью серной и упомянутой сульфокислоты с ласледуюшим ocBKU Hlff. м целевого продукта растворителем, смешиваюшимся с растворителем, используемым на стадии образования сульфоната.
2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что органический растворитель выбирают из группы, содержащей низшие одноатомные спирты, ацетон, метилэтилкетон, метилиэобутилкетон, этилацетат, тетрагидрофуран, 2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, диоксан, диметилформамид.
3, Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что используют спиртовый раствор сульфокислоты.
4. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что используют водный раствор сульфокислоты и серной кислоты в смеси с равным объемом органического растворителя, смешивающегося с водой.
5. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что сульфонат осаждают добавлением органического растворителя, выбранного из группы, содержащей бензол, толуол, диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, этилацетат, метилацетат, тетрагидрофуран, хлороформ.
6, Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что двойную соль сульфокислоты и серной кислоты осаждают при добавлении низшего кетона или алканола, полностью смешивающегося с водой.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Ленинджер A. Биохимия, Мир, 1974 с. 626.
