Способ получения -гомостероидов или их 1,2- дегидропроизводных

 

О Л изоьркткнйя

Союз Советскик

Социалистических

Республик (li) 697054

К ПАТЕНТУ (6l) Дополнительный к патон "у (22) Заввлено270373 (21) 1901008/23-04 (у3) приоритет (32} 29 ° 0 3. 72 (3l) 4666/72 (33} Швейцария (51) М. Кл.

С 07 д б 3/00//

A 61 К 31/56

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УЛК 547. 689, .6.07 (088,8) .Опубликовано 05.1179. Бюллетень Ж 41

Дата опубликования описания 05.11.79 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Андор Фюрст, Лео Алиг и Марсель Мюллер (Швейцария) Иностранная фирма Ф.Гоффманн ля Рош и Ко (Швейцария) (73) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧБНИЯ D-ГОМОСТЕРОИДОВ

ИЛИ ИХ 1,2-ДЕГИДРОПРОИЗВОДНЫХ

СН2К !

СО

ОФ

Изобретение относится к способу получения не описанных в литературе

D-гомостероидов общей формулы или их 1,2-дегидропроизводных, где R — водород, фтор, хлор или метил; Rg и R> независимо друг от друга означают окси- или низшую ацилоксигруппу, обладающих биологической активностью.

Известен способ получения 11о(-оксипрогестерона путем окисления прогестерона с помощью культуры

Rhizopus arrhizus (1).

Цель изобретения — расширение ассортимента биологически активных

D-гомостероидов.

Основаный на известной реакции окисления, предлагаемый способ получения D-гомостероидов или их 1,2-дегидропроизводных заключается в том, что П-гомостероид общей формулы где R<, R > и R З имеют вышеуказанное

И з нач ение, или его 1, 2-дегидропроизводное окисляют в положение II с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов с последующим выделением целевого продукта.

Ж Желательно использовать микроорганизмы таксономических единиц фунги и шизомицетов, в особенности аскомицетов, фикомицетов, базидиомицетов и актиномицетов, а также полученные химическим или физическим способом мутанты.

Наиболее подходящими микроорганизмами являются Curvu саг1а, например С. Euna1:a NRRL 2380 и NRRL 2178,1

З(Absidia, например А. coeruf.a IFO

697054

4435, Со (!etotrlchum, например С. oP., pisi ATCC 12520 PeEEicuKaria„например P, fi(,amentosa IFO 6675, StreptOmyces например S frac3iае ATCC

10745, Cunning hameИа, например, Сцп. bainieri ATCC 9244, Cun. vert:L;"

ce Data ATCC 8983, Cun. efegans АТ(С

9245 и Cun, echinufata АТСС 8984, Pgcnosporium, например Русп. sp. АТСС

12231.

Пример 1, 500 мл стерильного ) питательного раствора, содержащего 5,0Ъ сахарного крахмала, 0„5Ъ

Corn steep 6iguon, 0,2:- нитрата натрия NaNO 0,1Ъ дигидрофосфата калия

КН Р04, 0,05Ъ хлорида калия КСС, 0,05Ъ сульфата магния NgSO« 0 002« сУльфата железа РеБ04,засевают двухнедельной культурой, выросшей на скошенном агаре, и пять дней встряхнвают при ЗО C. Полученной подготовИтельной культурой засевают 20=л подготовительный ферментер с 15 л стерильной среды, содержащей 5,0Ъ сахарного крахмала, 0,25Ъ Corn

steep liguor,0,1Ъ NaNO 0,5Ъ КН РО,, и выдерживают 72 ч при перемеижвании 25 (220 об/мин) и аэрации (15 л/мин), при 29 С. 900 мл полученной подготовительной культуры переводят в

20-л главный ферментер, содержащий

14,1 л той же среды, что и подгото- 3О вительный ферментер, выдерживают в течение суток при перемешивании и о аэрации при 29 С, смешивают с профнльтрованным в стерильных условиях раствором 3 г 17с -окси-21-ацетокси- 35

-D-гомо-4-прегнен-3, 20-диона в 150 мл диметилформамида и ферме нтируют

40 ч. Затем полученную смесь фильтруют и мицелий экстрагируют метили"-обутилкетоном. Экстракты объединяют и концентрируют в вакууме, остаток хроматографируют на силикагеле, полученный сырец перекристаллизовывают иэ смеси ацетон-гексан и получают

11)3., 17 . -диокси-21-ацетокси-13- гомо-4-прегнен-3,20-дион.

6d-фт op-D-гомогидрокорти зон, т.пл. ?33-235 С

6c(.-фтор-D-гомопреднизолон, т.пл, 261-264 С б (-хлор-11,17а,21 — триокси-D-гпмопрегн-4-ен-3,20-дион

11 $,17ad.,òðèoêñè-бЫ-метил-D-гомопрегн-4-ен-3,20-дион

II p и м е р 3. Микроорганизм

С. F.unata NRRI. 2380 выращивают и пересевают, как в примере 1, 900 мл предварительной культуры переводят в 50 л испытательного ферментера, содержащего 30 л стерильной среды из 1Ъ Corn steep figuor, 1Ъ соевой муки и 0,005:- соевого масла, После выращивания предварительной культуры в течение 12 ч при 29 С, аэрации (30 л/мин) и перемешивании (220 об/мин) смешивают ее с профильтрованным в стерильных условиях раствором б r: бй-.фтор-D-гомо-Reichs -е1n-S-ацетата в 200 мл метилцеллозольва и ферментируют дальше в тех же условиях, Через 68 ч фермен гацию прекращают (контактное время

52 ч), Культуральную жидкость фильтруют и фильтрат и отфильтрованный мицелий экстрагируют метилизобутилкетоном. Экстракты очищают и концентрируют в вакууме. Остаток хроматографируют на силикагеле, Головной погон после элюирования содержит непревращенный и омыленный исходный материал. Из средней фракции получают бд;фтор-11(,17ас(.,21-триокси-D-гогло-4-прегна-3,20-дион, который перекристаллизовывают из уксусного эфира. Выход 1,85 r Т.пл. 235-236 С.

Я., 14300.

В аналогичных условиях при использовании C. funata NRRL 2178, Cun. bainieri АТСС 9244 или Сип. е Eegans

АТСС 9245 вместо С. (!unata МНИ

2380 выделяют только 11)3-оксисоединения.

Пример 2. Питательную среду, состоящую из 0,15Ъ Corn steep Тigucr

0,5Ъ пептона и 0,5 ; глюкозы в,дистиллированной воде (рН 7,3), затоав- 5() ливают Arthrobacter simplex ATCC 6946 выдерживают сутки при 28 С, прибавляют раствор ?5 D-гомогидрокортизона в 1 мл 80Ъ-ного водного этанола, инкубируют 48-72 ч, отделяют мицелий от субстрата, промывают водой и прОмывные воды и субстрат экстрагируют метиленхлоридом. Переработка экстрактов дает D-гомо-11р

17 4с(.,2l-триоксипрегна-1,4-диен-3,20-дион(О-гомопреднизолон), Аналогичным образом можно получать

11(,11ай,21-триокси-D-гомопрегна-l,4-диен-3,20 †ди (D-гомопреднизолон), т.пл. 250 C (разл.) H p и м е р 4. В условиях примера 1 Р. fi(amentosa f. sp. sasakii

АТСС 13289 выращивают и пересевают.

900 мл предварительной культуры переводят в 20=-л còåêësííûé ферментер, содержащий 14 л стерильной среды из бЪ жидкого сахарного крахмала {ЗЪ глюкозы), 1Ъ Corn з еер Eiguor, 0,2Ъ NaNOy 0,1Ъ КН РО4, 0,2Ъ KszHPO4

О, 05Ъ МЧВО4,0,002Ъ Ре804 и О, 05Ъ КС8.

После выращивания предварительной культуры в течение 12 ч при

29 С, аэрации (30 л/мин) и перемешивании (220 об/мин) смешивают ее с профильтрованным в стерильных условиях раствором 3 г бс(.-метил-17а, 21-диокси-D-гомо-4-прегна-3,2О-дион-21-ацетата в 100 мл диметилформа69 7054 НРь

) со

Формула изобретения

Составитель T . .Левашова

Техред М. Келемеш Корректор Г. Решетник

Редактор Т. Шарганова

Заказ 6610/60 Тираж 513 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва, Ж-35 Раушская наб,z д ° 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная,4 мида и ферментируют дальше в таких же условиях.

Через 17 ч ферментации (контактное время 52 ч) культуральную жидкость фильтруют. Мицелий и культуральную жидкость экстрагируют метилизобутилкетоном. Экстракты объединяют и концентрируют в вакууме. Остаток промывают гексаном и хроматографируют на силикагеле. При градиентном проявлении смесью метиленхлорид-аце- tO тон (1:1) из исходной фракции получают 870 мг омыленного сырья, После перекристаллизации из смеси этиловый эфир — уксусный эмир средние фракции составляют 133 мг

6с(-метил-11,17а),21-триокси-D-гомо-4-прегна-3,20-диона. Т.пл. 218219 С. 4 15100.

После перекристаллизации из смеси гексан-изопропиловый эфир следя,щие фракции составляют 660 мг 6ñ(.—

-метил-11pi,17аpr,21-триокси-D-гомо-4-прегна-3,20-диона. Т.пл. 184186 С. Е 42 15000. Вместо P. fifamentosc f. sp. sasakii ARTCC 13289 можно использовать штамм Р. fukamentosa IF0 6675.

Способ получения D-гомостероидов общей формулы

+ti где R — водород, фтор, хлор или метил; R u R независимо друг от друга означают окси- или низшую ацилоксигруппу, или их 1,2-дегидропроизводных,о т л и ч а ю щ и йс я тем, что D-гомостероид общей формулы ФН2К

СО

З, где R<, R „и R имеют вышеуказанное з н ачени е, йли его 1, 2-дигидропроизводное окисляют в положении

11 с помощью микроорганизмов, способных к 11-гидроксилированию D-5-стероидов с последующим выделением целевого продукта.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Физер Л,, Физер М. Стероиды.

N., Мир, 1964, с ° 683.