Способ определения остаточных коли-честв антибиотика гризина b органахи тканях животных
Сююэ Срветскнх
Соцналнстических
Республик
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ- СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6f ) Дополнительное н ввт. свмд-ву (22) Заявлено 140878 (21) 2658271/30-15 (51)М. Кл с присоединением заявки М
A 61 К 31/71
Государственный комитет
С.СС Р по дмам изобретений и открытий (23) Приоритет
Опубликовано 15.05.81. Бюллетень Н9 18
Дата опубликования описания 150581 (53) УДК 615. 779. 9 (088.8) (72) Авторы (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ
КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКА ГРИЗИНА
В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ
Изобретение относится к ветеринарной санитарии, в частности к способам определения количеств антибиотика гриэина в мясе животных, получавших кормогризин °
Известен способ обнаружения остаточных количеств гризина, заключающийся в том, что берут пробу органов и тканей, гомогенизируют при добавлении равного количества цитратно-солянокислого буфера, рН 6,0.
Полученный гомогенат центрифугируют
30 мин при 3 тыс. об. /мин и надосадочную жидкость исследуют на наличие антибиотика. При подготовке чашек 15
Петри используют для нижнего слоя
1,5%-ный голодный агар при рН 8,0, ! для верхнего — 1 5%-ный мясо-пептонI ный агар с добавлением 0,5% хлористого натрия и 0,3% одноосновного фос- 2О фата калия, при рН=8,0, в который вносят прк 60-65©С по 1 мл одномилли. ардной взвеси спор Бацилус субтилис шт.АТСС 6633 на 100 мл среды. После застывания в агаре делают лунки, в 25 которые вносят покрученный экстракт антибиотика. Контролем служит стан" дартный раствор гризина 3 ЕД/мл.
Чашки выдерживают 16 ч в термостате при 37о,замеряют диаметры зон к учитывают задержку роста тест-микро" ба, расчитывают концентрацию антибиотика в пробах по стандартным кривым (11.
Недостатком этого способа является то, что оч не дает возможность достоверно отличить наличие в пробах антибиотика гризина от присутствующих в нормальных тканях жквотных естественных кнгибкторов роста тестмикроба.
Изгестен также способ определечия антибиотиков, например стрептомицина, в меде, который позволяет использовать буферные растворы двухосновного к одноосновного фосфата калия, с использованием питательной среды Хоттингера (2).
Однако способ слабо чувствителен к антибиотику гриэину.
Цель изобретения — разработка более чувствительного микробиологического способа определения гризина в органах, тканях и биологических жидкостях животных, позволяющего одновременно дифференцировать гркзин от естественных ингибиторов роста.
Поставленная цель достигается тем, что экстракцкю антибиотика проводят фосфатным буфером, состоя829114 ки подготовленных чашек. Контролем служат стандартный раствор гризина
0,5 ЕД/мл и экстракты тканей нормального не получавшего антибиотик поросенка. Чашки выдерживают в термостате 15-17 ч при 37-37,5 С. Расчет количества антибиотика в эксграктах ведут по общепринятой методике.
При сравнительном изучении чувствительности известного и предлагаемого способов были получены следующие результаты, представленные в ,табл.1.
Таблица
Материал
Известному Предлагаемому
0,3
3,4
Печень
0,1
1,0
Почки
Моча
0„17
1,3
Содержимое желудочнокишечного тракта
0,1
1,5
Способ апробирован с положительным результатом при определении гризина в органах и тканях 39 поросят, отнятых .от матки в возрасте
30-45 дней, никогда не получавших антибиотики с кормами и в форме инъекций.
° Поросята на протяжении всего опыта получали специально приготовленнь.е корма, не содержащие антибиотики.
Поросятам давали гризин с кормом
15 дней в дозах 20 и 200 ЕД/мг на
1 кг массы животного в сугки. Для исследования брали материал от поро-. сят убитых в различные сроки после прекращения скармливания антибиотика.
Концентрация гризина в материале взятом от поросят в разные сроки после скармливания гризина преДставлена в табл.2.
Т а б л и ц а 2
Дозы антибиотика, мл/кг, массы животного
200
Материал
Время убоя животных, ч
6 24 48 б 24 48
L (I
0,5
Моча
0,1 0 0,6 0,18 0
0,2
Почки щим из двуосновного фосфата калик
167,30-167,32 r, одноосновного фосфата калия 5,23-5,24 г и дистиллированной вОды до 1 л, при рН--8,0-8,1, прогревают в кипящей водяной бане в течение 4-4,5 мин, в качестве среды используют 1,8-2Ъ-ный агар ХоттинГера с содержанием 130-140 мгЪ аминЙого азота с добавлением в нее 0,300,32Ъ фосфорнокислого натрия с рН=
8(0-8,1.
Способ осуществляется следующим образом.
Испытуемую пробу органов и тканей гомогенезируют при добавлении фосфатного буфера. Полученный гомогенат подогревают для разрушения естественных ингибиторов роста тестмикроба. Пробу центрифугируют и надосадочную жидкость исследуют на наличие антибиотика. 20
Подготавливают чашки со средой и тест-культурой. В застывшем агаре вырезают лунки, в котооые вносят испытуемый экстракт и стандартный раствор в качестве контроля. Чашки выдерживают в термостате, а затем проводят расчет количества антибиотика в экстрактах по общепринятой методике.
Пример 1. Берут испытуемую пробу органов и тканей по 3-3,1.г, гомогенезируют при добавлении 33,1мл фосфатного буфера при рН=3,08,1.Полученный гомогенат подогревают
4-4,5 мин в кипящей водяной бане для разрушения естественных ингибиторов роста тест-микроба. Пробу центрифугируют 25-30 мин при 2,53 тыс.об./мин и надосадочную жидкость исследуют на наличие антибиотика.
При подготовке чашек со средой 40 и тест-культурой берут 1,8-2Ъ-ный агар Хоттингера с содержанием 130140 MI Ъ аминного азота с добавлением в него 0,30-0,32Ъ фосфорнокислого натрия, расплавляют на водяной бане, затем охлаждают до 60-65ОC вносят в него по 0,5-0,6 мл одномиллиардной взвеси спор Бацилус субтилис шт.
ATCC 6633 на каждые 100 мл среды и разливают в чашки по 14-15 мл. В застывшем arape вырезают по 6 лунок.
Полученный экстракт закапывают в лунНаименьшая концентрация гризина по способу, ЕД/мл, ЕД/г я?9114
Продолжение табл. 2 зы антибиотика, мл/кг, массы животного
200
20 j
Материал
Время убоя животных, ч
24 48 6 24 48
Печень
Следы Следы 0 Следы Следы Следы
Содержимое желудка тонкого отдела кишечника толстого отдела ки- шечника
0,57 Следы 0
0,81 0,3 0,17
0,43 0,48 0
Следы Следы 0
3,5 1,9 0,8
1,0
1,6
Формула изобретения
Составитель M.,Áåëîócoâà
Редактор M. Недолуженко Техред Т. Маточка!
Корректор О. Билак
Заказ 2703/13 Тираж 687
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5
Подписное
Филиал ППП Патент, r.Óæãoðoä, ул.Проектная, 4
Исследования показали, что предлагаемым способом антибиотик обнаруживают в течение 24 ч в почках, печени, моче и содержимом желудочно- 25 кишечного тракта, от поросят, получавших гризин в дозе 20 мг/кг.
При применении гриэина поросятам в дозе 200 мг/кг антибиотик регистрируют в печени, моче и содержимом 3 > желудка и толстого кишечника до
48 ч.
Предложенный способ позволяет повысить чувствительность известного способа в 8-15 раз, одновременно дифференцировать наличие гризина от естественных ингибиторов роста и может найти применение при определении остаточных количеств антибиотика гриэина на.мясокомбинатах и ветеринарно-санитарных лаборато- 40 риях.
Способ определения остаточных количеств антибиотима гризина в органах и тканях животных, включающий гомогенизацию пробы ткани, экстракцию антибиотика с помощью буферного раствора при его нагревании, внесении его в чашки Петри с питательной средой и тест-культурой, инкубацию реакционной смеси в термостате и учет результатов реакции по диаметру зон задержки роста тест-культуры, отличающийся тем, что, с цейью повышения чувствительности способа, для экстракции используют буферный раствор, содержащий 167,30167,32 r двуосновного фосфата калия
5,23-5,24 г одноосновного.фосфата калия, вода дистиллированная до 1 л, при доведении рН= 8,0-8,1; нагревание экстракта осуществляют в течение
4,0-4,5 мин в кипящей водяной бане, в качестве питательной среды используют 1,8-2В-ный агар Хоттингера с содержанием 130-140 мгВ аминного азота с.добавленнем в него 0,30-0,32% фосфорноки"лого натрия, имеющего рН, что и фосфатный буфер.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Ветеринария . 1974, 9 1 с.95
2. Методы определения остаточных количеств антибиотиков и пестицидов в меде . МСХ СССР, ВДНХ, 1976.
