Способ количественного определения доступного лизина в белках

 

Союз Советск и и

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22)Заявлено 27.05.80 (21) 2933147/30 15 с присоединением заявки М— (23) Приоритет (5l)N. Кл.

G 0I N 33/02

G OI N 33/00

3Ъеударотаениый комитет

СССР ио делам изабретеиий и открытий

Опубликовано 30.11 81 Бюллетень М 44

Дата опубликования описания 30.1 l..81 (5З) JlK 543.062:

- 543.43 (088.8) (72) Автор изобретения

А.Ф.Сысоев

,:::;С«:-. ÛÉ3.." -:!"

Всесоюзный ордена Ленина и ордена Труддвойф ЩМФФого»q

Знамени селекционно-генетический ин тц3 уд., .„ ..„А 1 Й (71) Заявитель

««т «%11 j" Я" А (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ДОСТУПНОГО ЛИЗИНА В БЕЛКАХ

Изобретение относится к способам оценки зерна и других белковых продуктов растительного и животного происхождения по содержанию в них доступного (усвояемого организмом ) лизина.

Известен способ количественного .определения доступного лизина в белках, включающий тонкое измельчение пробы, денатурирование из нее белков и обработку белков раствором 2,4-ди10 нитрофторбензола.111.

Однако этот способ недостаточно точен, поскольку помимо g -аминогруппы лизина вступали во взаимодействие

15 с реактивом фенольные, имидозольные, гуанидиновые и сульфгидрильные остатки аминокислот.

Цель изобретения — упрощение процесса и повышение точности определения «

Поставленная цель достигается тем, что для денатурации белков используют водный раствор этанола 70Х-ной концентрации, в качестве реактива для обработки белков используют раствор

11-бензохинона, а после обработки белков реактивом анализируемую пробу обрабатывают при 70-71О С раствором f -аминокапроновой кислоты с последующим охлаждением, центрифугированием и колориметрированием. Причем используют 0,02Х-ный раствор

П-бензохинона в 88-95Х-ном зтаноле, а также IХ-ный раствор -аминокапро новой кислоты в 70Х-ном этаноле.

Поскольку доступный лизин по пред лагаемому способу определяется в белковых продуктах без гидролиза белков, следует особо подчеркнуть важность тонкого измельчения материа. ла с тем, чтобы 80Х муки проходило через сито 0,1 мм. При отсутствии необходимых мельниц тонкий помол осуществляют измельчением материала в ступке с равным по весу порошком стекла

8858

Раствор БХ в зтаноле при хранении в комнатной температуре, даже в ко-. ричневых склянках, постепенно желтеет.

В целях предотвращения этого процесса в раствор следует добавить следовые количества азотнокислой (окисной) ртути. К 10 каплям насьпценного раствора Нс (МО ),(400-450 мг) добавляют

10 капель койцентрированной азотной кислоты и доводят, водой до 100 мл.

К 100 мл 0,02Х-ного БХ в 88Х-ном этаноле добавляют 0,3 мл рабочего раствора Нц, (140 ) . При хранении в холодильнике. раствор БХ не теряет годности в течение 2 сут.

В целях использования в анализах регенерированного эталона в работе применялся 88%-ный этанол.(отгонка с

80 см дефлегматором)). Этанол-ректификат можно заменить гидролизным этанолом высокой очистки. Концентрация

В экспериментах использовался ЬХ фирмы Реахим (чистый). Реакционная

1 активность определялась иодометричес- ким способом. Она оказалась равной

88 9%. При более низкой активности реактив следует перекристаллизовать из спирта. Концентрация спиртового (этанол раствора БХ подбиралась экспериментально.на основе развиваемой окраски после добавления лизина или аминокапроновой кислоты. Наиболее оптимальной оказалась концентрация БХ, равная 0,02%. В 4 мл такого раствора содержится с учетом чистоты

712 мгк БХ.Учитывая, что на одну

Молекулу лизина расходуется две молекулы БХ, это соответствует 480 мкг лизина. Теоретически при навеске белкового продукта, равной 50 мг, этого количества БХ достаточно, чтобы

20 определить доступный лизин при его содержании 0 8Х и выше на сухое вещество. фактически этот предел не должен превьппать 0,5-0,6%, так как в разбавленных растворах БХ его реак25 ции с лизином замедляются. При определении лизина в продуктах с более высоким его содержанием (сухое молоко, зерно-бобовые культуры, мясокостная мука и др.) концентрацию лизина в исходном материале следует понизить путем смешивания в ступке с соответствующим количеством чисто.го крахмала. Напротив, при более низких содержаниях общего лизина З5 (0,2-0,3% ) навеску материала можно увеличить до 100 мг.

74

4 спирта ниже 75% повышает чувствительность реактива к другим аминокислотам.

В качестве контроля можно применять как раствор основного лизина, так и раствор Я -аминокапроновой кислоты в 70Х-ном спирте. Однако наличие у свободного лизина второй NH -груп2 пы усиливает его нуклеофильность, вследствие чего реакция взаимодействия с БХ ускоряется и при больших концентрациях лизина и- 70 0 заканчивается через 10-15 мин, в то время как для завершения реакции БХ с

f """аминокапроновой кислотой при тех же условиях требуется 20-30 мин. Поскольку остаток молекулы лизина,связанного в белках, по количеству СН и NH2-групп соответствует ЕАК кислоте, йоследняя является более предпочтительным реактивом в качестве контроля и стандарта для калибровочной кривой, Недостатком фирменного препарата

ЕАК кислоты является присутствие ,некоторого количества лактамной (циклической> формы, которая не взаимодействует с БХ. Поэтому расчет концентрации раствора ЕАК кислоты для калибровочной кривой производился не на основе стехиометрического соотношения, а путем подгонки оптической плот» ности раствора ЕАК кислоты к оптической плотности раствора лизина.

Изучение реакции БХ со свободными аминокислотами показало,что из общего числа нейтральных и кислых аминокислот только глицин и пролин развивают слабую окраску е раствором БХ (0,030,04 экстинкции при концентрации 1 мм) однако содержание этих аминокислот в свободном .виде в измельченном зерне весьма незначительно, а глицин и пролин, связанные в белках, не всту- . пают в реакцию с БХ. Что касается аргинина и гистидина, то их присутствие в анализируемом материале несколько повышает экстинкцию и составляет до

1/3 суммы экстинкции свободных лизин-аргинин-гистидин.Однако есть основания считать, что будучи связаннымв белках, ойи также не реагируют с БХ, что подтверждается отсутствием их взаимодействия при анализе зерна кукурузы.

Эти же данные указывают на огсутствие реакции БХ с концевыми аминогруппами белков.

Экстинкция контрольных пробирок

1,39. Количество БХ в единипах экстинкции, связавшегося с лизином белка, составляет: 1,39"0,79 0,60.

По калибровочной кривой это соответствует 196 мкг лизина s 50 мг зерна и 392 икг в 100 мг зерна,а на сухое вещество (при 10% влажности)

421 мкг или 0,421%.

На аминокислотном анализаторе в этом образце определено 0,52% общего лизина на сухое вещество. Следова" тельно доступный лизин составляет

0,421х100

0,52

Предлагаемый способ определежя доступного лизина прост, не требует дорогостоящих реактивов и может иайти широкое применения.для оценки пищевых и кормовых достоинств белоксодержащих материалов.

Формула изобретения

1. Способ количественного опреде= ления доступного лизина в белках, включающий тонкое измельчение пробы, денатурирование из нее белков и обработку белков реактивом,о т л и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения точности определения, для денатурирования белков используют водный раствор этанола, в качестве реактива для обработки белков используют раствор П -бензохинона, а после обработки белков реактивом анализируемую о пробу обрабатывают при 70-71 С раствором g-аминокапроновой кислоты с последующим охлаждением, центрифугированием и колориметрированием.

2. Способ но п.1, о т л и ч a— ю шийся тем, что используют

70Х-ный водный раствор. этанола.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что используют

0,02Х-ный раствор П -бензохинона в

88-95%-ном этаноле.

4. Способ по пп.l-3,о т л и ч аю шийся тем, что используют

1%-ный раствор 6-аминокапроновой .кислоты в 70Х-нои этаноле.

Источники инфориацИИ ° принятые во внимание при экспертизе

1. Луппа Х. Основы гистохимии.M., 1980, с. 68-ф9.

Тираж 910 Подписное

5 885874 е

Способ осуществляется следукнцим образом.

Из каждого тонкоизмельченного образца берут по три параллельных навески по 50 мг и переносят в сухие пробирки, добавляют по 0,5 мп 70%-ного эталона, спегка перемешивают, закрывают резиновыми пробками, обернутыми апюминиевой фольгой, и помещают в водяную баню на 15 мин при 70-71 С, 10

Затем в каждую пробирку добавляют точно 4 мл 0,02%-ного раствора 11-бензохинона в 88%-ном эталоне (с 0,3 ил рабочего. раствора Н (ЙОЗ) на

100 ил 3X). В две контрольные про- 1з

8 бирки добавляют 0,5 мл 70Х-ного спирта и такое же количество БХ. После осторожного перемешивания все пробирки закрывают пробками и переносят в баню на ЗО мин при 70-71о С. Через у0 каждые 10 мин кассету с пробиркаии слегка встряхивают. После окончания нагревания пробирки охлаждают,пробирки первой параллели оставляют в штативе,а к содержимому двух оставшихся параллелей добавляют по 0,2 ил раствора -аминокапроновой кислоты (100 Mr в 10 ил 70Х-ного этанола).

Раствор перемешивают, пробирки закрывают пробками и нагревают на водяной бане при 70-71 С в течение . 20 мин. Затем содержимое пробирок охлаждают, центрифугируют 5 мин при

6000 об/мин.(полиэтиленовые пробирки) и не позже 1 ч после нагревания ко° В 3$ лориметрируют при 500 нм.

По разности между оптической плотностью контрольного и опытных растворов с помощью калибровочной кривой. определяют содержание лизина.

Пример . Образец — высоколизиновая кукуруза (навески измельченного зерна по 50 мг). После нагревания с 0,02Х-ной БХ экстинкция раствора иа фотоколориметре "Спекол" . 4% составила 0,06. Доля окраски эа счет свободного лизина (принятая 2/3 от общей окраски) равнялась 0,04.

После йагревания с 0,2 мл 1,0Х-ного раствора (-аьплнокапроновой кислоты экстинкция раствора была в 1

0,825, во П 0 835; среднее — 0,83.

Поскольку окраска раствора после первого нагревания суммируется с окраской после второго нагревания, ее следует вычесть: 0,83-0,04 = 0.79

ВНИИПИ Заказ 10533/64

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4