Способ получения вещества кs-2-а,обладающего противоопухолевым и антимикробным действием
Союз. Советскин
Социалистических
Республик
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
И ЙАУЕКТУ
А 61 К 31/00 фзоудоротванный кокнтот ссср ао денни нэобротеннй н открытн11 Опубликовано 07 01.82,Бюллетень № 1 (53) УДК 615 . 771, .7(088.8) Дата опубликования описания. 09.01.82 Иностранцы Накао Исида, Хироси 11аеда, фудзио Сузуки, и Итуро Иицутани (Япония ) (72) Авторы изобретения Иностранная бирма "Кирин Сиграм Лимитед" (Япония ) (71) Заявитель (5ч) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕГ1ЕСТВА KS-2-А, ОБЛАДАЧЦЕГО ЧРОТИВООПУХОЛЕВ :П1 И АНТИ101КРОБНЫМ ДЕ11СТВИЕИ Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения веществ, обладающих противоопухолевым и антимикробным действием. Целью изобретения является получение вещества KS-2-А, обладающего противоопухолевым и анткмикробным действием. Цель достигается тем, что штамм Daeda1еа dickinsu KSDD 6(FERM-P N 3993), Lentinus edodes KSLE 7 (FERM-P N 399") KSLE 28 (Fi R11-P N 4196) культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях при 25 4 С и экстрагируют целевой продукт из биомассы горячей водой или 5%-ным водным раствором хлористого натрия при 80-100 С при перемешивании. В качестве питательной среды используют любую обычную среду, которая содержит глюкозу, крахмал, органические кислоты, в качестве источ ника углерода — полипептон, дрожжевой экстракт, мочевину, в качестве источника азота — витамин и неорганические соли, для лучшего эффекта до-. бавляют кукурузный экстракт или бар» ду ° Питательную среду подвергают фильтрованию или центрифугированию. Полученный мицелий подвергают затем экстракционной обработке. Целесообразно экстракционной обработке подвергать тонко измельченный полученный мицелий с использованием для этого горячей воды или разбавленных водных раст15 воров соли при 60-130 С, предпочтительно от 80 до 100 С, причем такие растворы содержат приблизительно 5% хлористого натрия. Такую экстракционную обработку удобно проводить с пер ремешиванием в течение примерно от 5 мин до 3 ч, предпочтительно в тече, ние 30-60 мин. После отделения твер-, дого материала экстракт, если это необходимо, подвергают осадительной об-; об работке с использованием гидрофильно-, 897099 го растворителя, например метанола или этанола. Полученньп(таким образом осадок собирают фильтрованием или центрифугированием с последующей лиофилизацией с получением вещества KS ° Это вещество KS растворяют в воде,добавляют в приготовленный раствор равный объем насыщенного. водой фенола, и конечную смесь подвергают интенсивному встряхиванию в холодных ус- 10 ловиях, в результате чего получают водный спой. В этот водный слой дo авляют насыщенный водой фенол, и за тем цикл встряхивания и центрифугирования повторяют дважды. Полученные 1 таким образом водные слои объединяют и затем добавляют в них диэтиловый эфир. 1 онечную смесь подвергают встряхиванию и собирают водный слой. Остаточный серный эфир из водного 20 слоя удаляют барботированием через него газообразного азота. В полученный таким образом водный слой добав.ляют четыре объема чистого этанола. Полученный в результате этого осадок 2 растворяют в буфере 0,01 М трис-соляная кислота (рН 6,95), а конечньп( раствор заливают в целлюлозную колонну, которую предварительно активируют и обрабатывают указанным буфером. 0 Этим же буфером осуществляют элюирование из колонны. Фракции, которые содержат вещество KS-2-А, собирают и после диализа и пиофилизации в виде белого аморфного порошка получают вещество KS-2-А. Вещество KS-2-А обладает следующими физико-химическими свойствами. Элементарный анализ, Е: С 39,5; Н6 5; й!,1. Зольность: следы (0,42). Молекулярный вес: 9000+3000 (путем ультрафильтрования); 7000-9000 (центрифуг .рованием по градиенту равновесной плотности); 8000 †30 (согласно методу поляризации флюоресциена) . Внешний вид — белый аморфный порошок. Температура разложения 185 С 50 (данные основаны на измерении температуры побурения в соответствии с капиллярным методом с применением си ликонового масла МГ-ЗО). УФ-спектрограмма. Отсутствуют какие-либо конкретные полосы максимуS5 мов поглощения. рН водного раствора этого вещества составляет 7,25. Р Растворимость. Вещество растворимо в воде, нерастворимо в этаноле, ацетоне, н-гексане, н-бутаноле, феноле и других органических растворителях. Удельное вращение плоскости поляризации света 25 с(3д е67,о е2,0е (в воде), (C= 0,452ö Гомогенность . Центрифугирование вещества KS-2-А осуществляют с линейным градиентом 5-20Е хлористого цезия в буфере 0,1 М трис-соляная кислота 1(рН 7,2) при скорости вращения 38000 об/мин и температуре 4 С в те-. чение 15 ч. Предлагаемое вещество яв( ляется гомогенным. Сравнительные экс перименты по седиментации с вирусными нуклеиновыми кислотами показывают, что предлагаемое вещество не включает в себя вирусных частиц, РНК или ДНК. Электрофорез осуществляют. на ,ацетате целлюлозы с использованием буфера 0,1 И уксусная кислота-пиридин (рН 3, 5). Для сравнения используют хондроитин. По истечении 30 мин электрофореза при токе 0,6 мА/см и напряжении 160 В хондроитинсульфат двигается в направлении катода, проявляя подвижность, равную 4 см/30 мин, тогда как вещество KS-2-А двигается в направлении анода с небольшой скорос" тью в течение 90 мин (подвижность см в 90 мин). Данное вещество явля-. ется электрофоретически гомогенным. Кроме того, электрофорез, осуществленный в тех же самых условиях, что и указанные, за исключением того, что в данном случае в качестве буфера используют систему 1 M пиридин-уксусная кислота (pH 7,0), подтверждает, что данное вещество является гомогенным. Цветная реакция: Фенольно-сернокислотная реакция Положительная Антроновая реакция Положительная Реакция Молиша Положительная Реакция Элсон-Моргена Отрицательная Карбазол-сернокислотная реакция Положительная. Реакция с реагентом Фолина-Сьокарто Положительная Биуретовая реакция Положительная Реакция с ФИТЦ (флуоросцеинизотиоцианат ) Положительная Окрашивание толуидиновым голубым О Отрицательная Нингидриновая реакция Положительная Сахарный состав Вещество KS-2-A подвергают кислотному гидролизу с последующим аль- % дитолированием и затем ацетилированием, после чего газохроматографическим путем определяют сахарный состав . Это вещество состоит в основном из маннозы и содержит небольшое количество глюкозы и галактиозы, а также незначительные количества арабинозы и ксилозы, причем весовое содержание этих компонентов соответственно 74:12:12:1:1. !% Аминокислотный состав. 10 мг вещества KS-2-А помещают в вакуумную камеру совместно с добавленными к нему 3 мл 6 н. соляной кислоты, после чего его подвергают кис- 20 лотному гидролизу при 110 С в тече- 1ние 22 ч. Затем в роторном испарите-, ле удаляют соляную кислоту и с помощью автоматического аминокислотного анализатора осуществляют анализ 23 на аминокислоты. К содержащимся аминокислотам в основном относятся треонин, серии, глутаминовая кислота, ала и аммиак. Кроме того, в небольших количествах содержатся аспарагиновая кислота, пролин, глицин, валин и лизин. В виде следов или в ничтожно малых количествах содержатся метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, аргинин и цистин. Вещество KS-2-А не оказывает непосредственного цитотоксического эффекта на клетки опухоли. При введении вещества KS-2-А в тело живого ор- ганизма оно улучшает защитную функцию организма и косвенно ослабляет рост опухолевых клеток, что в дальнейшем приводит к ликвидации этих опухолевых клеток. Кроме того, вещество KS-2-А не проявляет никакого бактерицидного или противовирусного действия. Однако в том случае, когда это вещество KS-2-А вводят в живой организм, оно улучшает защитную функцию организма и, следовательно, косвенно ингибирует рост бактерий и вирусов в живом организме, Вещество KS-2-А способно эффективно излечивать людей и животных от многих инфекционИ ных заболеваний, в частности от вирусного катара верхних дыхательных путей, гриппа, герпеса, коровьей оспы, энцефаломиокардита, инфекционных 99 а гепатитов, бепгенства, а также заболеваний, вызванных микроорганизмами. Pseudomonas, Candida, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, 0iplococcus, Neisseria, Escherichia соli, Micobacterium tuberculosis, Shiro- . chaetales H Protosoa. Пример 1. Микроорганизм Daedalеа dick1пз1i KSDD 6 (ГЕКИ-P N 0.3994) культивируют в 10 л среды, которая содержит барду, в аэробных условиях (1,8 об./об./мнн ) при 24 С в течение 11 дней. Затем питательную среду подвергают центрифугированию, в результате чего получают 38 г мицелия. Полученгпгй таким образом мицелий смешивают с 10 л горячего 5Х-ного раствора хлористого натрия и кипятят в течение 60 мин с последую- щим отделением верхнего слоя и осадка. Затем вггделенный таким образом верхний слой смешивают с этиловым спиртом в таком соотношении, что конечная концентрация этилового спирта составляет 707, и оставляют стоять в течение ночи в холодной темной комнате. Выпавший осадок собирают и лиофилизируют с получением 4 г вещества KS. Это вещество KS обладает следующими физико-химическиии свойствами. Элементарный анализ tc помощью С-Н-N-метра), Е: С 18,6 2,37.; -Н 2,8 0,4; N 1,3 .0,2. Зольность — 1О, 5 1, ЗЖ. Молекулярный вес (определяют с помощью колонки с биогелем ряда P u Амикон-ультра — фильтрования) приблизительно 70000. Температура разложения 300 С или выше. Растворимо в воде, нерастворимо в этаноле, н-бутаноле, ацетоне и гексане. Цветная реакция 1с использованием 1Х-ного водного раствора вещества к ): Антроновая реакция Положительная Реакция Морган-Элссна Отрицательная Карбазол-сернокислотная реакция Положительная рН водного раствора вещества KS находится в интервале от 6 до 7. Внешний вид: белый аморфный порошок. Аминокислотный состав (на !00 г), r: аргинии 0,4+0,05; лизин О,Я 0,06; гистилин 0,4+0,05; фенилаланин 0,2— 897099 «+0,03; тирозин 0, 0,03;лейцин 0,3+ 0,04; изолейцин О,ЗЫ,04; метионин 0,1 0,01; валин 0,4+0,05; алании 0,640,08; глицин О,.".. 0, 1; пролин 0,6- 0,8; глутаминовая кислота 1,2 + +0,2; серии 14-0,1; треонин 0,8 0,1; асапарагиновая кислота 140,1; триптофан 0,06+0,01; цистин. 0,3 0,04. Сахарный состав (определяют газохроматографическим путем), 7.: глюкоза 574 6; галактоза Ы0,5, манноза 26 3; ксилоза 8+0,8, арабиноза 5 0,3. Пример 2. Вещество KS, полученное в ходе проведения процесса примера 1, растворяют в воде и в этот1 раствор добавляют равный объем насыщенного водой фенола. Затем эту смесь подвергают встряхиванию на холоду, после чего подвергают центрифугированию с получением водного слоя. В этот водный слой добавляют водонасыщенный фенол и затем встряхивание и разделение центрифугирбванием повторяют дважды. Полученные таким образом водные слои объединяют друг с другом с последуюцим добавлением этилового эфира. Полученную массу подвергают встряхиванию, а затем собирают водный спой. Остаточный диэтиловый эфир иэ воды удаляют барбатироваиием через нее газообразного азота. В полученный водньп слой добавляют четыре объема чистого этанола. После этого смесь оставляют стоять в течение ночи в холодной темной комнате. Полу- З ченный таким образом осадок растворяют в буфере 0,01 М трис-соляная кис лота 1 рН 6,95 ), а приготовленный раствор заливают в -колонку с целлюлозой Эктеола, которую предваритель- 40 но активируют и обрабатывают буфером. Затем элюирование продукта из колонки осуществляют тем же самым буфером. Фракции, которые характеризуют содержание KS-2-А, собирают и после диализа и лиофилизации получают 0,7 r вещества KS-2-А. Пример 3 ° Микроорганизм .ent1nus eo1odes KSL Е 28 (FERN-P N 0.4196) подвергают культивированию путем встряхивания в среде, которая о содержит барду, при 24 С в течение 14 дней, после чего конечную питательную среду выливают в 10 л среды, 55 приготовленной разбавлением барды до удельного веса 1,012-1,020, с после-, дующим культивированием в ней при 24 С в аэробных условиях (1,8 об./ /об/мин ) н течение 11 дней. Затем конечную питательную среду подвергают центрифугированию, в результате чего получают 38 r мицелия. Полученный таким образом мицелий смешивают с 10 л горячего 57. †но раствора хлористого натрия и кипятят в течение 60 мин с последующим отделением верхнего слоя и выпавшего осадка. Полученный таким образом верхний слой смешивают с этиловым спиртом в таком соотношении, что конечная концентрация этилового спирта 707., и оставляют стоять в течение ночи в холодной темной комнате. Таким образом, получают осадок, вещества КЯ. Полученное по изложенному вещество KS растворяют э воде и в приготовленный раствор добавляют равный объем водонасыщенного фенола. Конечную массу подвергают встряхиванию в холодных условиях, после чего .подвергают центрифугированию с получением водного слоя. В этот водный слой добавляют насыщенного водой фенола и дважды повторяют операции встряхивания и разделения центрифугированием. Полученные таким путем водные слои объединяют друг с другом, а затем добавляют в них диэтилового эфира. Полученную конечную массу подвергают встряхиванию и собирают водный слой. Остаточный диэтиловый эфир из водного слоя удаляют барботированием через него газообразного азота. В конечный водный слой добавляют четыре объема чистого этанола. Конечную 1чассу оставляют стоять в течение ночи в холодной темной комнате. Полученный таким образом осадок растворяют в буфере 0,01 И трис-соляная кислота (рН 6,95), а конечный раствор заливают в колонку с целлюлозой Эктеола, которую предварительно активируют и обрабатывают указанным буфером. Элюирование продукта из колонки осуществляют этим же буфером. Фракции, которые характеризуются содержанием вещества KS-2-А, собирают, подвергают диализу и лиофилизируют. Таким образом получают 0,7 г вещества KS-2-А. Пример 3 (экспериментальный). Асцитные опухолевые клетки саркомы 180 отбирают с помощью шприца и разбавляют в 10 раз физиологическим раствором поваренной соли. Затем приготовленную таким образэм суспензию внутримышечно вводят в левое бедро мышам 40 001 (Qg) в количестве по 0,1 мл (1О+ клеток на каждую 0,1 мл) 10 897099 Доза, мг/кг Показательь эффективнос Средин вес Вес опухолевых частей, г мертость, опухолевых частей ти 100 50 0,09 0,21 1,0; 03; 02; 0,15, а у других четырех мышей имелись только следы опухолей 0,02 0,05 0,05; 0,4, у остальных 6 мышей имелись 10 только следы опухолей У всех 8 мышей имелись только следы опухолей l,01 2,20 34; 26; 48; 68, у остальных 4 мышей имели с ь следы опухолей 0,1 2,17 100 100 1,8; 3,0; 0,7; 3,4 18;23;20;25 Показатель эффективности — средний вес опухолевых частей у мышей той группы, которым давали лекарственное средство/средний вес опухолевых частей у мышей контрольной группы. На каждую особь. По истечении 24 ч вещество KS-2-А, полученное в ходе проведения эксперимента примера 3, растворяют в физиологическом растворе поваренной соли и перорально вводят в виде 12 порций через каждые 24 ч в организм мышей четырех групп, каждая из которых включает по 8 особей, причем каждой мьпчи карый раз дают в зависимости от группы соответственно по 100, 10, 1 или 0,1 мг/кг. Иышам Контрольная группа (Физиологический раствор поваренной соли) Аналогично приведенные результаты достигаются также в случае использования вещества KS. Пример 4 (экспериментальный). По истечении 24 ч после единовременного введения внутрибрюшинно контрольной группы дают перорально только физиологический раствор поваренной соли в тех же соответственно порциях и таким же точно путем. По истечении 7 недель после введения первых порций вещества KS-2-А умерщвляют индивидуальных мышей и определяют вес удаленных опухолевых частей. Полученные при этом результаты сведены в табл. 1. Таблица 1 или.перорально мьппам по 200 мк/кг вещества KS-2-А каждой ьапли интраперитонеально вводят по 10 опухолевых асцитных клеток Эрлиха. После этого отмечают число дней, в течение которых выживают мппи. В ходе проведения 11 897099 эксперимента используют весом по 20 r и в возрасте приблизительно 6 недель, 12 Таблнца2 Число выживших животных от общего количества Свыше 56,6 4/IO 23, 27, 28, 29, 29, 30, 100, 100, 100, 100 Интраперитонеальный свыше 26, 26, 27, 27, 28, 30, 30, свыше 100 100, 100 22, 23, 24, 25, 25, 25, 25, 26, 26, 26 Свыше 49,4 3/IO Через рот 10 О/10 24,7 Контрольный 10 эксперимент ,физиологический раствор поваренной соли) Т а б л и ц а 3 нее Число Сред число дней выживания выживших жи ечение вотные вотных от общего числа Вещество KS KS-2-А в дозировке 10 мг/мл 24, 24, 25, 26, 30 25,8 О/5 26, 26. 271 28, 31 То же, в дозе 2 мг/мл 27,6 0/5 Аналогичные результаты достигаются ;с использованием вещества KS. Пример 5 (экспериментальный1). асцитные опухолевые клетки Эрлиха, 25 взятые у мыши, несколько раз промывают средой RPM1-1640, не содержащей сыворотки, в течение 5 мин при скорости вращения 1800 об/мин, после чего концентрацию клеток доводят до уф 1 х 10 клеток/мл с использованием той же самой среды. Одновременно с этим вещество KS-2-А растворяют в той же самой среде с получением растворов концентрации 10, 2 мг/мл и 400 мкг/мл и 1 мл каждого из приготовленных таким образом растворов вещества KS-2-А добавляют в 1 мл указанной суспензии клеток Эрлиха и затем подвергают культивированию в уг- «> лекислотном инкубаторе в течение 2 ч при 37 С. В процессе такого культивирования пробирку несколько раз встряхивают. После этого каждую кульПолученные результаты сведены в табл. 2. туру подвергают центрифугированию при екорости вращения 1800 o6/мин в течение 5 мин с последующей промывкой средой RPMI †16. Полученные таким образом таблетки клеточной массы сус— пендируют в 2 мл указанной среды. По 0,2 мл каждой из приготовленных таким образом суспензий интраперитонеально вводят мышам DDI в возрасте 6 недель по 5 особей в каждой группе. При этом отмечают число дней, в течение которых выживают животные. Полученные результаты сведены в табл. 3. Число дней выживания животных в индивидуальных группах оказывается практически идентичным числу дней, в течение которых выживают животные контрольной группы; это указывает на то, что вещество KS-2-А не оказывает никакого непосредственного цитотоксического действия на раковые клетки., 14 897099 Продолжение табл, 3 Среднее число дней выживания Число Число дней, в течение особей которых выжили животные мышей Число выживших Лечение животных от общего числа То Же, в дозе 400 мкг/мл 5 О/5 25, 25, 25, 30, 30 27,0 RPHl-1640 (контрольный эксперимент) 5 24, 25, 26, 28, 32 О/5 27,0 Лечений мышей, имеющих опухоЧисло Число дней, в течение особей которых животным удамышей лось выжить Среднее число дней выживания Число выжив ли ших особей от общего числа Свьппе 70,0 5/10 Макрофаг мышей,!О вылеченных веществом KS-2-А 26, 40, 43, 45, 46, свыше 100, 100, IOO, 100, 100 О/О Макрофаг мыши, 10 которую не подвергалн лечению 24, 26, 27, 28, 29 30, 31, 32, 34, 35 29,6.О/ I O Только среда 10 БАРМ!+!640 26, 26, 27, 28, 28 28, 29, 29, 30, 31 28,2 Пример 6- (экспериментальный) . Мьппам 00! (с весом тела 20 r и в возрасте 6 недель) интраперитонеально вводят по 200 мг/кг вещества KS-2-А и по.истечении 24 r средней RPN1-1640, не содержащей сыворотки, вымывают перитонеальные эксудативные клетки. Затем вымытые эксудативные клетки подвергают культивированию в углекислотном инкубаторе в течение 2 ч. После этого не обладавшие адгезионной способностью клетки направляют в отход, а обладавшие адгезионной способностью клетки дважды или трижды промывают средой ВРМ1-1640, подогретой до 37 © С. Эти клетки, которые прочно прилипают к чашке Петри, собирают с использованием трипсина и ЭДТК, в результате чего получают мак1рофаг, вьделенньш из организма мышей, вылеченных веществом KS-2-А. Одновременно с этим других мышей DD1 в возрасте 6 недель заражают асцитны.ми опухолевыми клетками Эрлиха путем интраперитонеального введения в организм каждой особи по 10 клеток. Интраперитонеально в организм этих мышей вводят упомянутый макрофаг эа 24 ч до их заражения опухолевыми клетками, а затем им вводят в общей сложности 10 раз через интервалы в 3 дня: каждьп раз от 5 х 10 до l х 10 клеток. При этом отмечают число дней, в течение которых животным удалось выжить Полученные результаты сведены в табл. 4 ° Таблица 4 15 8970 Пример 7 (экспериментальный). Трансформированный акклиматизированный клеточный материал Fif †, приготовленньп с концентрацией 1 х 1О клеток/мл с использованием среды МЕМ S Игла, в которую добавляют 107 плодной сыворотки теленка (ПСТ), загружают в 3 различных склянки для культивирования а, в,и с. В склянке а культивирование проводят без какого-либо добавления в нее макрофага. Процесс культивирования в .склянке 4 проводят в присутствии i х 10 клеток/мл неактивированного макрофага, полученного в процессе экспериментального при- 15 мера 6. Процесс культивирования в склянке с проводят в присутствии 1 х 10 клеток/мл макрофага, полученного от мыши, которую лечат веществом KS-2 — А, в соответствии с изложен- 20 ным в экспериментальном примере 6. Процесс культивирования проводят при 37 0 С в атмосфере 57. углекислого газа в течение 72 ч. По истечении 24, 48 и 72 ч с помощью камеры для подсчета кровяных телец определяют число клеток FH-ÇÀ. Макрофаг, активированный веществом KS-2-А, оказывает ингибирующее действие на рост раковых клеток. 30 Пример 8 (эксперименталь— ный}. 40 мышам РР! среднего веса 22 г интраперитонеально вводят по 200 мг/кг вещества KS-2-А (группа 1). В организм других 40 мышей DDI через рот вводят по 500 мг/кг вещества KS-2-Л (группа 2). По истечении 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 и 32 ч из каждой группы мышей отбирают по 5 особей и умерщвляют с 40 последующим взятием крови. Полученную таким образом кровь подвергают центрифугированию со скоростью вращения 3000 об/мин в течение 10 мин с получением сыворотки. Титр интер- 4S ферона измеряют в клетке мыши штамча 1.-10 без тимидинкиназы и везикулярного стоматичного вируса (ВСВ). Титр интерферона получают посредством определенного эффекта цитофатитной вирусной защиты (ЦВЗ), который достигается посредством разбавленной сыворотки крови. Укаэанный титр интерферо99 !6 I на откалиброван относительно международной интерфероновой единицы. Пример 9 (экспериментальный). В организм мышей DDI четырех групп (среднего веса 20 r и в возрасте примерно 6 недель) интраперитонеально вводят по 200, 100, 50 и 25 мг/кг вещества KS-2 †. По истечении 24 ч после введения этого вещества у мьппей каждой группы берут кровь для определения титра циркулирующего интерферона. Полученные результаты приведены ниже. Интраперитонеальное Титр интерферовведение вещества на/мл KS-2-А в дозировке, мг/кг 200 800 100 800 50 800 25 80 Эти образцы интерферона проявляют такие общие свойства интерферона, как чувствительность к трипсину, специфичность видов паразитов в отношении хозяина. Пример 10 (экспериментальный). Микроорганизм Listerià monoсуСопепез!s, выделенный из организма пациента, который был заражен листериозом, суспендируют в дистиллированной воде с концентрацией 10 виру8 сов/мл, после чего эту суспензию используют для заражения инъекций в хвостовую вену мышей из расчета по 0,1 мл/особь. 3а 24 ч до заражения листериозом в организм мышей интраперитонеально вводят по 0,5 мл раствора вещества KS-2-А, В различных группах мышей дозировка вещества KS-2-A составляет при этом от 5 до 425 мг/кг на каждую индивидуальную особь. B организм мышей контрольной группы интраперитонеально вводят по 0,5 мл физиологического раствора соли. После этого отмечают количество мышей, которые выживаю;- в течение 20 дней после их заражения, а затем определяют выживаемость в процентах. Полученные таким образом результаты сведены в табл. 5. 897099 18 Т аблиц а 5 тепень Число особей, использованыживаеости жи отных,X ных в опы тах 425 100 141 100 87,5 100 26,3 (контрольный эксперимент) Таблица 6 Число животных Число осо- бей, выживСтепень выживаемости ших в течение 20 дней после заживотных, Ж ражения 425 100 87,5 141 87,5 l 00 87,5 26,3. 0 (контрольный эксперимент) Доза вещества KS-2-А при интраперитонеальном введении в организм, мк/кг Пример 11 (эксперименгальный). В ходе проведения данного эксперимента осуществляют то же самое лечение, что и описанное в экспериментальном примере 10, за исключением того, что в этом случае вещество KS-2-А вводят в организм иышей через Доза вещества, KS-2-А при введе нии в организм через рот,мг/кг Число особей, которые выжили в течение 20 дней после их з аражения рот в дозировке от 5 до 425 мг/кг. При этом отмечают число особей, которые выжили в течение 20 дней после щ их заражения, и раСсчитывают выживаемость животных в процентах. Полученные таким образом результаты сведены в табл. 6 19 897099 Пример 12 (экспериментальный ). Микроорганизм Pseudcnonas aeru glnosa> Bb+pJ1eHHblH из мочи больного лейкемией, подвергают культивированию при 37 и С в течение 24 ч, после . S чего клеточную массу суспендируют в дистиллированной воде в концентрации 10 вирусов/мл с последующим заражением путем инъекции в хвостовую вену 26 мьппей DDI (самки весом по 20 г в возрасте 6 недель) в дозировке по 0,1 мл/особь. За 24 ч до инъекционного заражения в организм мышей той группы, которая предназначена для ле Таблица 7 Число дней, прожитых животными после заражения Средняя продолжительЧисло Выживаевыжив- мость жиших в вотных,7 теченость жизни, дни ние 20 дней М 2; 2; 3; 3; свьяпе 14, Свыше свыше 14; 14; 14; 14; 10,7 свьппе 14; 14; 14; 14, 14 150 10 71 1; 1; 1; 1; 2; 2; 3; 2,3 0 3; 4; (контрольный эксперимент) Пример 13 (экспериментальный). Непосредственное антибактериальное действие вещества KS-2-А исслсдуют дисковым пульпо-диффузионным методом с использованием различных бактерий и водного раствора вещества KS-2-А концентрацией 1000 мкг/мл. Как Видно из данных таблицы, вещество KS-2-А не проявляет непосредственной антибактериальной активности. Ниже приведены значения минимальной ингибирующей концентрации (1П!К ) использованных микроорганизмов. Pseudomonas aeruginosa мкг/мл С вьппе 000 К1ebs i l l а pneumoni ае, мкг/мл Listeria monocytogeпеЗ, мкг/мл Еscherichià col i, мкг/мп Staphylococcus aureus 209-Р, мкг/мл Свыше 1000 Candida albicans, мкг/мп То же Доза вещества Число KS-2-А, мг/кг особей чения, интраперитонеально вводят по 0,5 мл водного раствора, содержащего 150 мг/кrt вещества KS-2-А, тогда как в организм животных контрольной груп-. пы вводят только по 0,5 мг физиологи" ческого раствора поваренной соли (интраперитонеально) . Отмечают число животных, которые выжили в течение 20 дней после их заражения, и затем определяют степень выживаемости,в процентах ° Полученные результаты сведень! в табл. 7 ° Candida tropicalis, мкг/мл Candida pseudotropicalis, мкг/мл Candida uti11s, мкг/мл Sacch ггomyces cerevisial Br-60, мкг/мл Hansenula anomaliа, мкг/мл Proteus ОХ-!9, мкг/мл Вас!1lus subtilis, мкг/мл Shigella зоппе1, мкг/мл Sarcina lutea, мкг/мл П р и и е р 14 (экспериментальный) ° В ходе проведения эксперимента мышей DDI весом 14- 16 г заражают введением в их организм intranadellу вирусов гриппа и лечат внутривенным или пероральным введением вещества KS-2-А в дозировке 200 мг/кг. В ходе проведения контрольного эксперимента в организм контрольных животных 21 897099 22 интраперитонеально вводят по 50 мг/кг 1 ч до заражения мьппей вирусом, одновиразола или 0,5 мл физиологического временно с их заражением вирусом по раствора поваренной соли. Далее on- истечении 1, .3 и 6 ч после их заражеределяют число дней, прожитых живот- ния и затем дважды в день в течение ньяи и степень их выживаемости в про- З последующих 4 дней. В качестве вируцентах. Как вещество KS-2-А, так и са гриппа используют адаптированный виразол вводят в организм в виде со- к мышам вирус гриппа штамма А /Кумаответствующих растворов в физиологи- мото/У /Н / в 10 дозах LD У. 5O ческом растворе поваренной соли в об- Полученные при этом результаты щей сложности 15 раз, а именно за >6 представлены в табл. 8. Таблица 8 Лекарственное Способ введения Число Средняя продол- Выживаесредство в организм особей жительность, дни мость мышей, 7 Интраперито- 25 Свыше 2Q неально Вещество KS-2-А, 200 мг/кг То же 25 Свыше 19 20 Свьппе 16,9 Перорально Интраперитонеально Виразол, 50 мг/кг Контрольный опыт 50 9,2 50 9,2 Интраперитонеально Полученные таким образом результа— ты сведены в табл. 9. .Предложенный способ позволяет получить вещество, обладающее противоопухолевым и антимикробным действием. Пример 15 (экспериментальный). В ходе проведения данного эксперимента исследуют токсичность вещества К 2 -2-А. Таблиц а9 Пероральный спосо введения, мг/кг Интраперитонеаль ный способ введе ния, мг/кг Подо пыт но животное нутриенное ведение организм, r/êã 875 Свьппе 12500 Свыше 2000 Мьппь, LD 2083 Крыса,LD Морская свинка,LD Свьппе 600 Свыше 2000 с я тем, что штамм Daedalea dickin" з11 KSDD 6 (FERti-P N 3993), Lentinus edodos KSLE 7 (FERH"P N 3994) или Lentinus edodes KSLE 28 (ГЕКИ-Р Формула и зобретения Способ получения вещества, обладающего противоопухолевым и антимикробиым действием, о т л и ч а ю щ и й— 897099 24. Составитель С. Малютина Редыстор М. Дыпын Техред T.Ìàòo÷êà . Корректор N. 111ароши Заказ 11741/4б Тираж 716 Подписное . ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва, Ж-35 Рабская наб.д д. 4/5 Филиал ППП "Патент",. r. Ужгород, ул. Проектная, 4 и 4196) культивируют в питательной среде, содерпкащей источники углерода, азота и минеральные соли, в азробных условиях при 25 С и экстрагируют целевой продукт из биомассы горячей водой или 5Х-ным водным растворби хлористого натрия при 80-100 С при перемешивании.