Способ определения активности глютатион-пероксидазы в биологических тканях

 

Союз Советсиии

Социапистичесиии

Республик

ОП И АНИЕ Э22637

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву(22)Заявлено 24.06.80 (21) 294688)/28-13 (51)Я. Кд. с присоединением заявки №

> 01 33/48

Государственный комитет (23) П риоритет ло делам изооретеннй и открытий

Опубликовано 23. 04. 82. Бюллетень № 15

Дата опубликования описания 25 . 04 . 82 (5З) УЙ (612. 13 088.8) (72) Авторы изобретения

8. А. Пахомова, Н. П. Козлянина и Г. Н. Крк кова..".

Одесский научно- исследовательский институт стоматологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛЮТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ .ТКАНЯХ

Изобретение относится к медицине а именно к биохимии, при изучении липидного обмена в тканях экспериментальных животных и человека.

Известен способ определения активности глютатион-пероксидазы в биологических тканях путем инкубации гомогената ткани с гидроперекисью трет-бутила в качестве субстрата с последующим центрифугированием и спектрофотометрией супернатанта ill.

Однако известный способ не обеспечивает необходимой чувствительности из-за недостаточной специфичности и сложности известного способа.

Цель изобретения — повышение. чувст15 вительности способа.

Эта цель достигается тем, что, согласно способу определения активности глютатион-пероксидазы в биологи20 ческих тканях путем инкубации гомогената ткани с гидроперекисью трет-бутила в качестве субстрата с последующим центрифугированием и спектрофотометрией супернатанта, перед добавлением к исследуемой смеси субстрата инкубационную смесь выдерживают в те" чение 50-60 мин, а определение актив- ности глютатион-пероксидазы ведут на спектрофотометре при длине волны

262 нм.

Способ осуществляют следующим образом.

После забора биологические ткани хранят и гомогенизируют в О,О И фосфатном буфере в соотношении 1:50.

Инкубационная смесь включает 0,3 М фосфатный буфер рН 7,4 — 1,2 мл;

0,05 И ЭДТЛ - 0,2 мл, 0,01 М глютатион восстановленный — 0,3 мл; гомогенат 0,2 мл. Предварительную инкубацию проводят в течение 50-60 мин при о

37 С. Реакцию запускают добавлением

0,1 мл гидроперекиси трет-бутила

0,002 М, через 1-2 мин реакцию оста-. навливают 103-ным раствором трихлоруксусной кислоты в количестве 1 мл на пробу. 8 контрольную пробу гидро

3 9226 перекись трет-бутила не добавляют.

Пробы центрифугируют в ечение 1520 мин при 1500 - 2000 об/мин, после чего отбирают по 2,5 мл центрифугата и определяют экстинкцию по разнице экстинкций между опытными и контрольными пробами при 265 нм.

Пример 1. Околоушную железу гомогенизируют на,холоду в 0,3 М фосфатном буфере в соотношении 1:50., 1о

Затем проводят преинкубацию при 37 С в течение 50 мин в инкубационной смеси следующего состава: 0,3 И фосфатный буфер рН 7,4 - 1,2 мл; 0,005 И

ЭДТА - 0,2 мл 0,01 И глютатион вос-. )5 .становленный - 0,3 мл; гомогенат .

0,2 мл. Общий объем пробы 1,9 мл.

Реакцию запускают добавлением субстрата - 0,002 И гйдроперекиси третбутила - 0,1 мл, Через 1 мин реакцию zo останавливают 104-ным раствором трихлоруксусной кислоты в количестве

1 мл. Контрольная проба содержит

0,3 И фосфатйый буфер рН 7,4-1,2 мл . 0,005 M ЗДТА — 0,2 мл; 0,01 M глюта 25 тион восстановленный — 0,3мл; гомогенат0,2 мл;103-ная трихлоруксусная кислота1 мл. Все пробы центрифугируют и on->. ределяют активность. фермента по разнице экстинкций на спектрофотометре зо при 262 нм. Выражают активность фермента в микромолях на грамм ткани в минуту и рассчитывают по формуле:

<Е. х3

<,„ 0,2 л 0,0? л T. разница экстинкций между контрольной и опытной пробами; 3 - объем кюветы;

-экстинкция 0,3 мл 0,01 И окисленного глютатиона,: 1: — время ин кубации, мин. Так активность фермента в околоушной железе в среднем составляет 806. микромолей на грамм ткани в минуту.

Пример 2. Десну и альвеолярный отросток гомогенизируют на холоду в 0,3 И фосфатном буфере в соотношении 1:50. Затем проводят преинкубацию при 37 С в течение 60 мин в инкубационной смеси (состав смеси тот же, что и в примере 1). Реакцию запускают добавлением субстрата0,002 M гидроперекиси трет-бутила.

0,1 мл. Останавливают реакцию через, 2 мин 103-ным раствором трихлоруксусной кислоты в количестве I мл. Остальное, как в примере 1. Активность глютатион-пероксидазы в этих тканях

198 и 180 микромолей на грамм ткани. в минуту соответственно.

Таким образом, предложенный способ позволяет повысить чувствительность методики определения активности глютатион-пероксидазы и ее специфичность, ускорить проведение исследования, повысить точность и определить активность фермента во всех тканях.

Формула изобретения

Способ определения активности глютатион-пероксидазы в биологических тканях путем инкубации гомогената ткани с гидроперекисью трет-бутила в качестве субстрата с последующим центрифугированием и спектрофотомеррией супернатанта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, перед добавлением к исследуемой смеси субстрата инкубационную смесь выдерживают в течение 50-60 мин, а определение активности глютатион-пероксидазы ведут на спйктрофотометре при длине волны 262 нм.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Ланкин В. 3,, Гуревич С. И., Котельцева Н. В., Тихадзе А. К. и

Герасимова E. Н. Роль перекисей липидов в патогенезе атеросклероза"Вопросы медицинской химии", 1976, 22, 3, с. 392-395 °

Составитель 9. Алмазов

Ревактор А. Козориз Техред Т.Иаточка Корректор О. шпак

Заказ 2573/59 Тираж 883 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 1)ОЯ Иосква Ж-35 Раушская наб. g. 4/

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная,