Способ получения синтетической двунитчатой рнк, обладающей интерферониндуцирующей активностью

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (и);933001 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 2б. 07. 79 (21) 2793202/28-13 (23) Приоритет - (32) 28. 07. 78 (31) 92212/78 (331 Япония (5!) М. Klt

G 01 N 33/48

Ме дарстеееай комнтет

СССР аа делам азабретений я открытей

Опубликовано 30. 05. 82.Бюллетень у»0 (53) УДК h 616. .07(088,8) Йата опубликования описания

Иностранцы

Хирофуми Аримура Масанори Нагаи такеси ямау

Цутому Китагава и Тадаказу Суяма Япония)

Иностранная фирма

1 М:Ф

"Дэе Грин Кросс Корпорейшн" (Япония) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКОЙ ДВУНИТЧАТОЙ РНК, ОБЛАДАЮЩЕЙ ИНТЕРФЕРОНИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к биохимии и касается получения двунитчатой

РКН.

Известен способ получения синтетической двунитчатой РНК., обладающей интерферониндуцирующей активностью, путем использования человеческой

ДНК в качестве матрицы для ферментативного синтеза $1).

Однако известный способ не позволяет получить преперат, обладаю" щий высокой интерферониндуцирующей активностью.

Цель изобретения — повышение .интерферониндуцирующей активности це- 16 левого продукта.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью, путем использования человеческой ДНК в качестве матрицы для ферментативного синтеза аденозинтрифосфорную, уридинтрифосфорную, гуанидинтрифосфорную и цитидинтрифос- р6 форную кислоты инкубируют с ДНК из человецеской плаценты в присутствии активной PHK- полимераэы Mlcrococcus lysodeikticus или Escherichiq co

1i в течение 2-4 ч при 20-40 С в трис-солянокислом буферном растворе при рН 7,0-8,0, образовавшуюся в результате реакции РНК отделяют от бел ка обычными методами. отделенную от белка PHK центрифугируют с использованием CsCl в качестве амортизатора, целевой продукт осаждают этанолом и выдерживают s термостате при

70-100 С, затем быстро охлаждают до о комнатной температуры или ниже.

В соответствии с данным изобретением двунитчатую PHK получают в,результате ферментного синтеза с использованием в качестве матрицы естественной человеческой ДНК.

Двунитчатая PHK ферментативно синтезируется с помощью способа, при котором ATP, GTP, СТР и UTP реагируют друг с другом в присутствии в качестве шаблона естественной человеческой ДНК посредством каталитического дейтвия активной полиме. разы PHK для получения PHK с последующим отжигом получающейся PHK нагревом при 70-100 С и постепенным о охдаждением до комнатной температуры или ниже для образования меж ду ее молекулами двунитчатых зон.

Естественную человеческую ДНК по лучают с помощью экстракции из тка- 1о ней человеческого тела обычным известным способом, в частности экстракцией с фенолом, с фенолом, насыщенным водой, или с фенолом, насыщенным буферным раствором.

Например, ДНК выделяется из че ловеческой плаценты в соответствии со способом Пэриша. Замороженную при -20 С человеческую плаценту гомогенизируют в присутствии 60 р"амино- 2в салицилата натрия и фенол-крезольной смеси для осуществления экстракции нуклеиновой кислоты и депротеинизиции. Депротеинизация всплывающей на поверхность жидкости, полученной, у после центрифугирования с фенолкрезольной смесью, проводится еще раз. Нуклеиновая кислота выпадает в осадок после цинтрифугирования иэ всплывающей на поверхность жидкости. Осадок растворяют в слабом ионном растворе и добавляют высококонцентрированный. хлористый натрий для высаливания

РНК. После удаления РНК с помощью центрифугирования удаляют остаток PHK и высокоагрегированную ДНК; Затем с помощью ультрацентрифуги удаляют гликоген. Полученную из всплывшей фракции ДНК осаждают и растворяют в слабом ионном растворе. Этот раствор диализируют с дистиллированндй водой, а диализат подвергают лиофили- . зации для получения в качестве лиофилизированного продукта естественной

ДНК.

Полученная таким образом ДНК используется в качестве матрицы для полимеразации рибонуклеоидных трифосфатов при каталитическом действии полимеразы РНК для синтезирования РНУ Р

PHK-полимераза означает обычно зави-, симую от ДНК полимеразу РНК и является ферментом, катализирующим реакцию синтеза PHK посредством полимеризации рибонуклеоидных трифосфатов через двойную эфирную связь с использованием ДНК в качестве матрицы. Этот фермент специфичен, т.е. в качестве матрицы действует лищь ДНК, экстрагированная из того же источника, что и фермент. Однако используемая в качестве фермента активная полимераза PHK обладает низкой специфичностью матрицы, так что для синтеза PHK возможно использование в качестве матрицы человеческой

ДНК, Для выделения и очистки активной полимеразы РНК, например, в случае, когда она получена из blicrococcus

lysodeikticus используется оригинальный способ Накамото модифицированный частью усовершенствованного способа Вейсса. Для этого клетки собирают на последней - логарифмической фазе их роста, хранят до исполь— зования в замороженном состоянии,а при использовании промывают и лиофилизируют. К этому экстракту добавляют экстракт сульфата стрептомицина для концентрации комплекса нукле" иновых кислот и нуклеопоотеинов. а после элюирования полимеразы PHK из этого комплекса посредством добавки фосфатного буферного раствора вновь добавляют сульфат стрептимицина для выпадения в осадок избирательно лишь нуклеиновой кислоты.

Этот осадок удаляют центрифугированием, а мембранные компоненты и рибосомную фракцию удаляют на ультрацентрифуге. Затем добавляют сульфат протамина для образования комплекса протамин-полимераза РНК, и полимераза РНК элюируется из этого комплекса с помощью фосфатного буферного раствора. Элюированная таким образом полимераза PHK реагирует с сульфатом протамина для создания . еще одного комплекса, вновь элюируется из комплекса с фосфатным буферным раствором, а элюат подвергается фракционированию с сульфатом аммиака. Фракцию, осажденную с насыщением 30-503, собирают и обрабатывают с катионитом для получения очищенной полимеразы РНК. Активность полученной таким путем полимеразы РНКв диапазоне 50-10 000 ед/мг протеиHB.

Затем осуществляют синтез PHK c использованием полимеразы PHK и человеческой ДНК в качестве матрицы.

Смесь реактантов для синтеза РНК содержит 4-40 ед/мл полимеразы РНК, 100-1000. мкг/мл ДНК, 0,2-2 мй АТР, GTP,CTP u VTP соответственно в ка45

Полученный таким образом индуктор интерферона в виде двунитчатой

РНК, синтезированной с естествен5 9330 честве основы, 1-4 мМ МпС1 0-4 мМ гипохлорида спермидина и 0,01-0,1 М три-НС1 (рН 7,0-8,0).Температура реакции 20-40 С, время реакции 1-10 ч.

Хорошие результаты получают при продолжительности реакции 2-4 ч. Завершается реакция охлаждением и до" полнительными этапами обработки: дегидрированием полимеразы ДНК с помощью дезоксирибонуклеазы, удаления протеинов с помощью обработки в феноле, очисткой с помощью диализа.

Затем диализат концентрируют посредством ультрафильтрации,а концентрат центрифугируют в CSC1 в соответст-15 вии со способом Глизина для выделения

РНК, Полученную таким путем PHK очищают осаждением с этанолом, а полученный продукт подвергают последующей реакции температурной обработ- 20 ки °

Эта реакция, целью которой является получение двунитчатой РНК, проводится в соответствии с методом

Робинсона и др. Реакцию выполняют таким образом, что РНК растворяется в двойной концентрированной SSC ,I ,стандартном солевом цитрате, 0,15 M

ИяС1, 0,015 М цитрата натрия) при величине рН 6,5-7,5,получившийся рэст 30 вор нагревают до 70-100 С, затем температура постепенно понижается до комнатной для окончания реакции. В данном случае желательны нагрев раствора до 70-100 С на 3о

10 мин быстрое охлаждение до комнатной температуры, затем повторный нагрев до 70- 100 С, после чего раствор вновь постепенно остывает до комнатной температуры. На этом этапе желательно долгое время поддерживать температуру между высокой и комнатной. По завершении реакции

РНК восстанавливается с помощью осаждения из этилового спирта или подобным образом, полученный осадок центрифигируют и промывают,. затем растворяют в водном растворе хлористого натрия с малой концентрацией, подвергают диализу в воде при низкой температуре на протяжении 10-30 ч, при необходимости стериализуют фильтрацией, затем подвергают лиофилизации для получения препарата.

01 б ной человеческой ДНК в качестве матрицы,- белого цвета, без запаха, безвкусный, содержит по крайней мере примерно 43 (нормально 10- 15Ц двунитчатых частей в молекуле. указанный индуктор интерферона в виде двунитчатой PHK обладает следующими физическими и химическими свойствами.

Молекулярный вес. Седиментационный коэффициент определяют по градиенту плотности сахарозы при центрифугировании (5-20 в роторе при

38000 об/мин, 3,5 ч) с использованием в качестве стандарта рибосомной PHK L-клетки мыши. В образец входит 11-13 компонентов.

Растворимость. Растворим в дистиллированной водс, в буферном растворе 0,01 M три-НС1 (pH 7,5),.двойном концентрированном растворе S, в растворе SSC с концентрацией О, 1 (рН 7,0) и т.д. Нерастворим ь этаноле и ацетоне.

Спектр ультрафиолетового поглощения. 0,02 мг/мл водного раствора.образца дают спектр ультрафиолетового поглощения, типичный для нуклеиновой кислоты. Максимум поглотительной способности приходится на 260 нм, а минимум - на 230 нм.

Цветовая реакция. Реакция положи» тельна при проверке орсинолом и отрицательна для дифениламина и индола„ соответствует характеристике цве- товой реакции PHK.

Реакция осаждения. К 0,5 мг/мл водного раствора образца добавляют раствор этанола двукратного объема и дают отстояться в течение более чем одного часа при -20 С. В оса док выпадает почти 100 материала.

Дабавление половины объема охлажденной 50 -ной TCA (трихлоруксусной кислоты) к-0,1 мг/му водного раствора образца переводит в нерастворимую форму 80-903 РНК -ТСА, которую можно собрать с помощью фильтра (0,45 мкм).

Дегидрирование рибонуклеазой. Образец растворяют в двойном концентрированном растворе SSC (рН 7,0) и подвергают обработке вместе с бычьей рибонуклеазой поджелудочной железы (10 мкг/мл) и рибонуклеазой

-Т.1(1 мкг/мл) в течение 30 мин при

37 С. В результате примерно 11-13ь образца остаются непоглощенными. С

;другой стороны, образец растворяют в растворе ЯЯС (рН 7,0) с концентра- цией 0,3, нагревают, затем быстро, охлаждают и обрабатывают вместе с упомянутой выше рибонуклеазой после перенесения раствора в раствор SSC двойной концентрации. В результате непоглощенными остаются 2-3 .

Поглощение дезоксирибонуклеазой.

Образец растворяют в 0,0! И буферного- раствора три-НС1 (pH 7,4) и обрабатывают с дезоксирибонуклеазой (50 мкг/мл) при 37 С в течение

30 мин. Полученная в результате про порция нерастворимой фракции ТСА та же, что и при укаэанной выше обработке, причем увеличение поглотительной способности при 260 нм не заметно, ни до, ни после обработки, Чувствительность к щелочному гидролиэу. Образец растворяют в 0,3 М гидроокиси калия и выдерживают при

37 С в течение 18 ч. Образец гидролиэуется полностью. Анализ продукта гидролиза с помощью тонкослойной хроматографии показывает лишь отдельные пятна адениловой кислоты, амидиновой кислоты, цитидиновой кислоты и уридиновой кислоты, Состав. Анализ остава выполняют с помощью тонкослойной хроматографии на продукте щелочного гиддолиэа . В результате анализа установлено, что молярное отношение каждого нуклеотида находится в диапазоне 27,0-30,5Ф адениловой кислоты, 20,6-24,7ь амидиновой кислоты, 16,824,34 цитидиновой кислоты, и 27,832,74 уридиновой кислоты.

Плотность на всплывание образца в С 30 ,Плотность на всплывание образца в

С фО измеряют с помощью ультрацентрифуги (Spinco SW 50,1 ротор, 31500 об/мин 72 ч). Она равна 16351640.

Термическая денатурация рибонукле аэы - стойкость PHK. Образец растворяют s растворе SSC (pH 7,0) концентрации 0,1, температуру плавления определяют в соответствии.со способом К, Колби и Д. Г. Дьюсберга. Она оказалась равной 71 С.

Спектральная поглотительная способность увеличивается с повышением температуры. Образец растворяют в ра створе SSC .(рН 7,0) с концентрацией О,1, затем определяют увеличение поглощения при 260 нм при повышении температуры. Наблюдаются воэраста3300 1 8 ние примерно на 201 в диапазоне температур 25-90 С.

Чистота. Оценку чистоты образца выполняют следующим образом. э Количество протеина определяют по методу Фолина-Лоуни, а количество ДНК - по SST-методу, модифициро! ванному Мицуно и др. Загрязнений протеина и ДНК не наблюдается.

Ю Наблюдения под электронным микроскопом. Наблюдения под электронным микроскопом показывают, что большинство молекул PHK являются линейными, длина их 0,1-3 мкм.

1$ Двунитчатая РНК, обладаюшая описанными выше физическими и химическими свойствами, может быть использована в качестве интерферона по той причине, что она индуцирует интер26 ферон и обладает черезвычайно малой токсичностью.

При изготовлении различных медицинских препаратов-стабилизаторов, среди которых могут быть челове2s ческий альбумин „ маннитол и. др., агенты повышенной растворимости глицин и такие вещества, как сорбитол - могут быть добавлены к раствору до проведения лиофилизации, приЭв чем раствор уже.содержит активный материал. При использовании изготовленный таким образом медицинский препарат растворяют (в физиологическом растворе, стериализованной воде, стерилизованном изотоническом растворе для инъекций и т.д.) и назначают пациентам в качестве индуктора интерферона посредством внутривенных, мышечных или подкожных инъекций.

Эффективная доза от 1 до 2 мг на килограмм веса тела в день, при необходимости доза может быть увеличена.

Препарат эффективен в качестве лекарства даже в неочищенном виде, т.e. в смешанном состоянии с однонитчатой РНК, достаточно эффективны 4Ф или более двунитчатой PHK.

Биологические свойства препарата

%9 подробно описаны в примерах 1-7.

Пример 1.Противовирусную активность определяют измерением вирусной производительности в соответст вии с частично модифицированЯ ным методом» Т ее 0 09 1 ю0 10 и

50 мкг/мл образцов индуктора интерферона (препарат по настоящему изобретению и Poly 1:Ñ в качестве контросодержащую возбудитель интерферона, удаляют и клетки трижды промывают соляным раствором Хенкса, затем добавляют вирусы Vesicular stomatitis (V.S.V.) с кратностью инфекции от 2 до 3 бляшкообразующих единиц на клетку. Вирусы адсорбируют при 37 С в течение 1 ч. После адсорбции для уда"

Вирусная производительность (Рй /мл

\ оз

Poly 1:С

Предлагае" мый препарат

6 х 10

8х10

7,5х10

4 х 10

1,5

6 „107

1 х 10

2,4 х 10

3,3 х 10

2 10

FL (человеческие) ления свободных вирусов V.S.V. клетки промывают пять раз и добавляют

5 мл новой содержащей среды (среда

MEM Игл, содержащая 14 утробной телячьей сыворотки). После инкубационного периода. продолжающегося 20 ч при

37 С клетки охлаждают в холодильниР

0 ке при -30 С. Охлаждение и оттаивание повторяют дважды, затем клетки направляют на центрифугу (2000 об/мин, на 10 мин) . Титр вирусов во всплывшем веществе определя ют с помощью анализа культур клеток

ГЬ. Вирусы с клеток, обработанных средой МЕМ Игл без возбудителя интер ферона (с содержанием сыворотки или

ДЕАЕ - декстрана), используют как контрольные.

Использованные клетки относятся к двум разновидностям установленных . клеточных линий человеческих амниотических клеток FL и клеток почки кролика RK-13 а также человеческих зародышевых диплоидных клеток крайней плоти (HF)) и человеческих зародыше,вых почечных клеток НК. Гетероплоид-. ные клетки клеток НК первоначально

45 рассаживались примерно 130 раз.

Эти клетки выращивают в среде

МЕМ Игл,дополненной 103 утробной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл пенициллина G, !00 мкг/мл сульфата стрепто(мицина и 60 мкг/мл канамицина. По завершении инкубаиии вирусов клетки культивируют в среде, в которой количество сыворотки уменьшено до 13.

Клетки культивируют в инкубаторе с содержанием СО, 5б СО ) .

Используемое в качестве контрольного вещества Poly 1:С, расмотренное в фосфатном буферном растворе

О,1

2S 50

HK 0 (человечесзо e) 1

50 д RK-! 3 (кроли чьи)

7,5х10

5х 10

1 6 х 10

4 .

3,3х10

3

2 х 10

7,5 х 10

4,5 х 10 х 10

104

1,5х10

0,1

/ х 10

0 х 10

1 х 10

2,3х10

2 х 1О

1 х 10

1,5х10

5х10

3,3 х !О

2х10

50

4 pfu — бляшкообраэующая единица.

Пример 2 . Активность индуцирования интерферона проверяют добавкой предлагаемого препарата к культивированным клеткам. Этот тест проводится с использованием метода Вилцека, при этом 2 мл среды МЕМ Игл (без -сыворотки), содержащей 550 мкгlмл возбудителя интерферона и 100 мкг/мл циклогемиксида, добавляют к клеткам HFS, образовавшим монослой в пластиковой чашке Петри диаметрсм 6 мм. Клетки выдерживают о в термостате в течение 5 ч при 37 С.

К среде добавляют О, 5 мл актиномици-, на.с тем, чтобы окончательная кон9 933001 10 ля), 50.мк "/èë декстрана ДЕАЕ (мо- рН /,0) с концентрацией 2,5 мг/мл, лекулярная масса 50x10 ) и 3 мл мини- хранилось при -30 С, а при испольэомальной среды фирмы Игл (далее упоми- вании разжижалось. наемой как МЕМИгл), дополненных 0,54 . Результаты приведены в табл, 1, утробной телячьей сыворотки, добавля- s откуда видно, что хотя между клетют к однослойным клеткам (2,5-3х10 ками.есть небольшое различие, протиклеток/колбу) в 50-мл колбы для вы- вовирусная активность препарата та ращивания культур, затем выдержива- же, что и у Poly 1:С. ют при 37 С в течение 20 ч. После инТ а б л и ц а 1 инкубационного периода среду Игл МЕМ, !6

11 9 центрация стала равной 1 мкг/мл. Зао тем продолжают в течение 1 ч при 37 С инкубацию. После полного завершения; инкубациИ клетки промывают соляным раствором Хенкса пять раз, затем добавляют 5 мг ИЕИ Игл с 0,53 сыворотки. После 20 ч инкубации при

37 С среду собирают и центрифигиру ют (1000 об/мин) в течение 5 мин для получения всплывшего вещества, содержащего интерферон. Тест на интерФеоон проводят с использованием клеток PL, Тест на интерферон проводят по модифицированному методу Вилцека..

Монослойные клеточные культуры s плас тиковой чашке Петри промывают и прививают двум разведенным в два раза образцам интерферона в среде ИЕИ

Игл, содержащей утробную телячью сыворотку, затем помещают в термостат на 20 ч при 37 С. После промывки клеточных слоев их подвергают действию примерно 100 Pfu на чашу вирусов V.S.V., а полученные пластинки подсчитывают после двух- или трех дневной инкубации. Титр интерферона выражают как величину, обратную числу разбавления образца, уменьшавшего число бляшек на 503 от контрольного, на которое была нанесена среда

ИЕИ Игл вместо образца. Титр образца интерферона человеческих клеток определяют одновременным определением стандартного человеческого лейкоци.тарного интерферона для преобразования в мейдународные единицы (1 Ц). В качестве контрольного используют

Poly 1:С.

Предлагаемый препарат проявляет большую активность индуцирования интерферона по сравнению с Poly 1:С. п р и м е р 3. Действие интерферона в живом организме, Кроликам-самцам весом 2,0-2,5 кг .проводят внутривенную инъекцию 10100 мкг/кг препарата или Poly 1:С в качестве контрольного средства. Непосредственно до инъекции, а также после,l. 2, 4, 8, 11 и 24 ч после инъекции у кроликов берут кровь.

Активность индуцирования интерферона определяют анализом содер-. жания интерферона в полученной сыворотке. Иетод титрования интерферона аналогичен упомянутому методу

Вилцека и др. за тем исключением что вместо клеток FL используют клетки BK-13

33001 12

Предлагаемый препарат проявляет активность индуцирования интерферона в живом организме, равную или превышающую активность Poly 1:С.

S Пример 4, Тест на токсичность.

Изучается эффект предлагаемого препарата и Polу 1:С в качестве контрольного средства на культивирован16 ных клетках. При этом в колбу 5 мл одновременно помещают 4 мл суспенэии человеческих амниотических клеток

FL (60 х 104 клеток на 4 мл), а также 1 мл среды ИЕИ Игл, содержащей

lS 5,50 250 мкгlмл (растворенных окончательно в 5 раз) препарата. Клетки культивируют при 37 С в течение 6 дней..

После 2, 4 и 6 дней культивации щ отбирают по две колбы иэ каждой группы, для удаления плавающих клеток их промывают фосфатным буферным раствором. Оставшиеся клетки отделяют от стеклянной поверхности с помощью

2S 0,021 этилендиамин-тетрацетата (ЕДТА) и трипсина (0,254) для подсчета их числа. Затем число жизнеспособных клеток подсчитывают с помощью окращивающего вещества эритроцина 8 и гемоцитомера.

Контрольный препарат Poly 1:С до некоторой степени токсичен даже при концентрации 1 мкг/мл, при 10 мкг/мл токсичность существенно заметна, а при 50 мкг/мл размножение клеток не наблюдалось. S противоположность контрольному получаемый препарат не обнаруживает токсичности при концентрации 10 мкг/мл или меньше, размножение клеток подавляется лишь очень незначительно даже при кон центрации 50 мкг/мл.

Из приведенных экспериментов видно, что полученный препарат является средством возбуждения интерферона, обладает противовирусной активностью, примерно равной или превышающей активность Poly 1:С, и в сравнении с ним является менее токсичным.

П р и. м е р 5. Острую токсичность полученного препарата проверяют, используя самцов мыши Г ВЕ, в соответствии с методом Лидича и Вилкоксона.

Результат показал, что от внутрибрюшного введения препарата на уровне 50 мг/кг веса тела или при внутривенном вливании на уровне 25 мг/кг гибели мышей не было.

13 9330

Для мышей доза Lg при подкожном введении препарата - не менее

50 мг/кг, при внутривенном введении— не меньше 25 мг/кг, Получение синтетической двунитча- $ той РНК поясняется следующими примерами.

Пример 6. Выделение и очищение ДНК человеческой плаценты.

Плаценту, замороженную непосредственно после родов и хранившуюся при -20 С, измельчают на куски до

60 г, к ней добавляют 15 обьемов

63-ного раствора аминосалицилата и 15 объемов смеси Фенола с крезолом (состав: Фенол 500 r, и-крезол 70 мл, вода 55 мл и 8-гидроксилхинолин 0,5 r), Полученную смесь гомогениэируют при комнатной температуре в течение од— ной минуты в смесителе при максималь- 20 ных оборотах. Полученную таким образом суспензию размешивают при комнатной температуре в течение 20 мин, затем центрифугируют в течение 30 мин при 5ОC и 6000 х g для удаления дена-2$ турированного протеина и фенола. К всплывшей жидкости добавляют хлористый натрий с тем, чтобы его конечная концентрация стала равна 33, а также половину объема всплывшей 30 смеси фенол-креэола. Смесь размешивают при комнатной температуре в течение 20 мин, затем центрифугируют в течение 1О мин при 5 С и

8000 х g.

3$

К всплывшей жидкости добавляют два объема охлажденной этиловой спиртово-крезольной смеси (объемное отношение 9:1) и осторожно смешива- . ют для образования осадка. После то- в го, как волокнистый осадок намота- ют на стеклянный стержень, оставшуюся жидкость отстаивают 1 ч при

2 С, затем оставшийся осадок восстанавливают центрифугированием, Общий осадок тщательно промывают в до"статочном объеме 75Ф-ного этилового . спирта с содержанием 23 ацетата

;натрия и полностью растворяют в 200 мл 0.1 И ацетата натрия, содержащего 5 мИ фторида натрия. К этому раствору добавляется хлористый натрий с конечной концентрацией 3 И.

Этот раствор отстаивают в течение

15 ч при (-2) †(-5) С и центрифугируют 10 мин при 5 С и 12000 x p.

К всплывшей жидкости добавляют водный объем охлажденной этилцеллю01

14 лозы и осторожно смешивают до получения белого волокнистого осадка.

После отстаивания в водяной бане при

0 С в течение 20 мин волокнистый осадок извлекают с помощью стеклянного стержня, диспергируют и растворяют

Ф при комнатной температуре в 300 мл

3 И буферного раствора ацетата натрия (рН 6,0), содержащего 5 мИ фторида натрия. Когда растворение почти полностью завершится, раствор о центрифугируют при 5 С в течение

10 мин при 2000 x g для удаления остаточной PHK и сильно агрегированной ДНК в качестве осадка.

К всплывшему веществу добавляют равный объем охлажденной втилцеллюлозы, и смесь отстаивают в течение

20 мин в водяной бане при 0 С. Полученный волокнистый осадок наматывают на стеклянный стержень, диспергируют и растворяют при комнатной температуре в 200 мл О,1 И буферного раствора ацетата натрия (рН 6,0), .содержащего 5 мИ фторида натрия. Korра растворение завершится почти полйостью, раствор центрифугируют в течение 90 мин при 5 С и 60000 х е для удаления гликогена как осадка.

К всплывшему веществу добавляют ацетат натрия с конечной концентрацией 0,3 M и смешивают с равным объемом охлажденной этилцеллюлозы. После отстаивания в течение 20 мин в водяной бане при 0 С волокнистый осадок собирают.с помощью стеклянной палочки и растворяют в 16 мл 0,1 И буферного раствора ацетата натрия (pH 6,0), содержащего 5 мИ фторида натрия.

По завершении растворения раствор передают в диализный трубопровод и диалиэуют в течение 48 ч при 2-5 С с 200 мл дистиллированной воды, пятикратно,. сменяя внешний раствор.

Диализат центрифугируют для удаления нерастворимых материалов и определяют концентрацию ДНК посредством из" мерения коэффициента поглотительной способности при 260 нм разведенного всплывшего на поверхность вещества..

Расчет концентрации ведут с учетом того, что коэффициент спектральной поглотительной способности при

260 нм 1 мг/мл ДНК равен 20. Растворы с содержанием 6,5 мг ДНК помещают в пробирки 10 мл и подвергают лиофилизации. После проведения указанных процедур получают в сумме

15: 9330 40 кг человеческой ДНК. Для оценки чистоты препарата ДНК определяют количество протеина по усовершенствованному методу Лаури. Количество

РНК определяют по методу Мицуно. 5

Протеина было О,И в виде альбумина человеческой плаценты. РНК было

4,83 от общего числа нуклеотидов. . Очищение палимераэы РНК. На питательном бульоне выращивают Micmmccus 1узодеЖСхсю с использованием

ЗаГ Fermeater. По достижении послед= ней логарифмической стадии роста их собирают и хранят — при -20 С, 400 tзамороженных клеток диспергируют в 2 л 0,01 И буферного раствора три-НС1 и центрифугируют, чтобы соб", рать промытые клетки, которые затем диспергируют в 0,01 M буферном растворе три-НС1 (рН 8,0), содержащем 2е

0,2 М сахарозы, для получения конечного обьема 2 л. К этой суспензии добавляют 600 мг белого лизоцима куриных яиц, и суспензию выдерживают в термостате при 30 С. После 15 мин И о инкубации добавляют 6 мл 0,1. И:MgClg и выдерживают в термостате еще

45 мин для разрушения стен клеток.

Затем добавляют 18 мл 0,1 М NgC1< и 2400 мл воды, охлажденной до 0 С. Зв

Смесь энергично перемешивают. 8се процедуры проводят в водяной бане при 0 С. Через 10 мин дсбавляют

600 мл 104-ного сульфата стрептомицина, а еще через 10 мин полученный . осадок центрифугируют в течение

10 мин при 5 С и 20000 х g. Полученный осадок суспендируют в 800 мл

0,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 8,0}, содержащего 0,2 И сахарозы, 6,14 сульфата стрептомицина и

0,00035 И NgC1, Через 10 мин раствор центрифугируют при 5 С в течение 10 мин при 20000 x g,. Осадок гомагенизируют в 720 мл раствора, приготовленного смешиванием 8 мл 1 И буферного раствора фосфата калия (рН 7,5) 8 мл 0,1 И MgC1 и 80 мл

2 И сахарозы, разбавлением смеси дистиллированной водой до 720 мл с использованием тефлонового гомогенизатора фирмы Поттер-Элвейхем. К этому гомогенату добавляют 32, мл, М буферного раствора фосфата калия (рН 7,5}, а еще через десять минут - 70 мл

103-ного сульфата стрептомицийа.После

1О мин перемешивания полученный qcaдак отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 5 С и 30000 x g, 01

16 а полученное в результате всплывшее вещество подвергают дальнейшему цент-рифугированию при 5 С в течение 2 ч при 105000 x g для удаления компонентов мембраны и рибосомной фракции.

К 800 мл полученного при ультрацентрифугоровании всплывшего вещества добавляют 110 мл 1 M буферного раствора фосфата калия (pH 7,5),а затем

160 мл 2,5>-ного ненейтрализаванного сульфата протамина для выделения па-. лимеразы РНК в осадок как комплексного соединения с сульфатом пратамина.

После 10 мин перемешивания осадок собирают с помощью центрифугирования в течение 10 мин при 5 С и 20000 х g.

Осадок гамогенизируют в 180 мл 0,2 М буферного раствора фосфата натрия (рН 7,5), содержащего 0,2 И сахарозы для элюирования полимераэы РНК.

После 10-минутного перемешивания суспензию центрифугируют в течение.

10 мин при 5 С и 30000 х ц. К всплы- . вшему веществу добавляют 360 мл

0,13-нога сульфатного раствора ненейтрализованного протамина, и вновь по лимераза РНК выпадает в осадок как комплексное соединение с сульфатом протамина. После 10 мин перемешивания суспенэию центрифугируют в те" чение 15 мин при 5 С и 20000 x g.

Осадок гомогенизируют в 50 мл 0,14 M буферного раствора фосфата калия (pH 7,5), содержащего 0,2 М сахарозы, и гомагенат подвергают центрифугированию в течение 10 мин при 5 С и 30000 х g. Собранный осадок гомогенизируют в 30 мл 0,2 М буферного раствора фосфата калия (pH 7,5), .содержащего 0,2 И сахаразы для элюирования полимеразы РНК, После 10 мин

:перемешивания суспензию центрифугиру:ют в течение 15 мин при 5 С и

30000 xg.К всплывшему веществу (30 мл ) добавляют 7,27 г сультата аммиаКа с тем, чтобы получить 403-ное насыщение для осуществления фракционирования сульфата аммиака. Спустя 15 мин после добавления сульфата аммиака суспензию центрифугируют в течение

10 мин при 5 С и 30000 х g .Îñàäîê растворяют в 5 мл 0,02 М буферном,растворе три-НС1 (рН 7,5), содержащем 0,3 И сульфата. аммиака, и добавляют равный обьем глицероля, Раствор разбавляют в 2,5 раза.

0,01 И буферным раствором триНС1 (рН 7,5) и пропускают сквозь

СИ-целлюлозную колонку в стеклянном!

93300!

Очищенная полимераэа

PHK

10000 ед.

20 ед/мл

ДНК человеческой плаценты 200 ед/мл

100 мг

0,4

200

ATP

0,4

CTP

200

0,4

0,4

UTP

200

GTP

200 фильтре, приготовленном с использованием 2,4 г СИ-целлюлозы для удаления рибонуклеазы. Колонку промывают

0,01 И.буферным раствором три-НС1 (рН 7,5), содержащим 204 глицероля 5 и 0,06 M сульфата аммиака, и элюат пропуекают .сквозь колонку СИ-целлюлозы, приготовленной с использованием

0,8 r СИ-целлюлозы.

После промывания колонки к суммарным 80 мл элюата добавляют 22,2 г сульфата аммиака для осуществления осаждения сульфата аммиака. Через

15 мин полученный осадок собирают центрифугированием в течение 15 мин !5 при 5 С и 30000 x g, а полученное таким образом осажденное вещество растворяют в 4 мл 0,02 И буферного раствора три"НС1 (pH 7,5), содержещего 0,3 И сульфата аммиака, а 2@ потом добавляют равный объем глицероля и до использования хранят при

-700С.

Из 400 г замороженных клеток получают 43 мг препарата полимеразы 25

РНК с удельной активностью 190 ед-. на мг протеина (суммарная активность

8290 ед) и отношением спектральной поглотительной способности при

280 : 260 нм 1,55.

36

Одна единица ферментной активности определяется как количество, катализирующее при введении 1 н моль

14 С - ATP нерастворимый ТСА матери-. ал в течение 10 мин инкубации ° 35

Каждый реактив. растворяют в 0,1 И буферного раствора три-НС1 (рН 7,5).

В табл. 2 приведены используемые при синтезе РНК реагенты, общее количество 500 мл. 40

Таблица2

HnClg»

2 5

1250

Ненейтрализованный тригидрохлорид спермидина 2

1000

Три-НС1, рН 7,5

0,1 И

Указанные выше реагенты тщательно смешивают и выдерживают в термостате в течение 3 ч при 30 С в водя-ной бане. Затем эту смесь охлаждают в водяной бане при 0 С до окончания реакции и нагревают в течение о

5 мин при 65 С для инактивации полимераэы РНК. Реакционную смесь охлаж дают примерно до 37 С проточной во". дой, затем к ней добавляют 56 мл

О,! И HgC1 g для доведения раствора до 10 мИ. Затем добавляют 5,6 мг дезоксирибонуклеаэы (без рибонуклеа зы) и помещают в термостат на 30 мин при 37 С для дегидрирования ДНК.

В течение 3 мин реакционную смесь нагревают при 100 С для инактивации дезоксирибонуклеазы, затем охлаждают проточной водой до комнатной температуры..После этого к ней добавляют

560 мл двойной концентрированной

SSC (рН 7,0) и 1120 мл фенол-крезольной смеси (состав: фенола 500 г, м-креэола 70 мл,, воды 55 мл, 8-гид" роксихинолина 0,5 г). В течение

5 мин реакционную смесь встряхива3 ют, затем центрифугируют в течение

10 мин при 5 С и 5000 х g. Отделенное от фенольного слоя и слоя денатурированного протеина всплывшее вещество получает добавку половины объема упомянутой выше фенол-крезоль. ной смеси, затем его встряхивают при комнатной температуре в течение 5 мин.

Полученное посредством центрифугирования всплывшее вещество вновь диализируют. с 5 м .раствора SSC с двой- . ной концентрации (рН 7,0). содержащего 0,053 додецилсульфата натрия (упоминаемого далее как SDS), 1 ч при комнатной температуре и еще 1 ч после замены внешнего раствора. После этого внешний раствор заменяют 5 л

0,01 концентрации SSC (рН 7,0) и ди . ализ продолжают всю ночь при 2-5 С..

001

19 933

Диализат (890 мл) подвергают ультрафийьтрованию с использованием пусто" телого волоконного мембранного фильтра до сгущения до 19 мл.

S 19 мл ультрафильтрованного кон- 5 центрата растворяют 1 9 r СуС1. 3атем общий объем доводят до 26 мл до бавкой 0,01 М буферного раствора триHCl (рН 7,5), содержащего С Сl в пропорции 1 r на 1 мл буферного раство- 1© ра. Этот раствор (26 мл) наносят на

7,8 мл 5,7 И С С1 (рН 6,5), содержащих 0,1 И ЕДТА, затем наносят 1,3 мл

0,1 М буферного раствора три-НС1 (pH 7,5) и все это центрифугируют.

Центрифугирование проводят на роторе при 27000 об/мин (130000 x g) в течение 15 ч при 15 С.

После центрифугирования всплывшее вещество удаляют и РНК в виде свет- 26 лых гранул растворяют в 30 мл 0,1 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,5).

Полученный раствор охлаждают в водя ной бане при О С.и добавляют к нему два объема охлажденяого этилового З спирта, все это отстаивают 1 ч при

-20 C. Затем полученный осадок соби рают с помощью низкоскоростного центрифугирования. Всплывшее вещество удаляют и осадок вновь растворяют в З6

0,01 М буферном растворе три-НС1 (рН 7,5). O

Выход очищенной PHK 8,6 мг в соответствии с расчетом из соотношения

А260 22, где A260 - спектральная поглотительная способность при ..

260 нм 1 мг/мл раствора PHK.

При добавлении 504 ТСА в осадок выпадает примерно 804 очищенной РНК как нерастворимой фракции TCA. Седи- 4в ментационный коэффициент очищенной

РНК, который измеряют с помощью градиентного центрифугирования сахарозной плотности с использованием в качестве стандарта,. мышиной

L-клеточной рибосомной РНК, равен примерно 12 с.

Отжиг РНК. 3 мг очищенной РНК растворяют. в 4,8 мл 0,01 И буферного раствора три-НС1 (рН 7,5) и добавляют к раствору 1,2 мл SSC

10-кратной концентрации (рН 7,0) с тем, чтобы концентрация PHK в двухкратной концентрации SSC стала равной 500 мкг/мл. Полученный таким образом раствор помещают в стек лянную пробирку с заглушкой, нагревают 5 мин при l06 С, быстро омлаждают в водяной бане при О С, затем помещают в водяную баню при 85 С.

Температуру водяной бани постепенно понижают в течение 2 ч до 65 С, и рекция происходит 4 ч при 65 С. 3а тем отключают нагреватель водяной бани, и раствор отстаивается ночь с постепенным охлаждением до комнатной температуры.

Седиментационный коэффициент отожженной PHK определяют методом градиентного центрифугирования сахарозной плотности. Наблюдается пик при

12 с, причем полученный результат практически не отличается от того, что был получен до отжига, однако наблюдается небольшой новый пик вобласти примерно 28 с.

Устойчивость рибонуклеазы отожженной РНК (число PHK -гибрида РНК; ко— личество двунитчатых частей) определяют по методу Гемперта. 30 мкг.отожженной PHK обрабатывают вместе с

20 мкг рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы и 2 мкг рибонуклеазы-!

Т в растворе SSC двойной концентрации (рН 7,0) в течейие 30 мин при

37ОС, в результате с помощью фильтрата (0,45 мкм) получают 13, 33 нерастворимой фракции ТСА без следов дегидрирования, С другой стороны, 30 мкг образца, нагретые при 100 С в SSC с концентрацией 0,3 и быстро охлажденные в воо дяной бане при О С, подвергают рибонуклеазной обработке в SSC двукратной концентрации, как упомянуто выше, в результате получают недегидрированных 2,33 нерастворимой фракции ТСА.

Отожженная PHK регенерирована с помощью осадка этанола по типовому методу. Осадок диализируют с дистил" лированной водой, диализат стериализуют фильтрацией с разделением на пробирки и подвергают лиофилизации..

Полученные таким образом препараты являются индук1орами интерферона и обладают его физическими, химическими и биологическими свойствами.

Пример 7. Выделение и очищение ДНК человеческой плаценты, Процесс осуществляют по тому же методу, что и в примере 6.

Очищение полимеразы PHK E-.coli, Штамм К-12 E. со1х выращивают в питательном бульоне с использованием

Jar Fermenter, собирают на последней стадиии логирифмической фазы роста и хранят при -20 С, 250 г этих

21 9330 клеток суспендируют в 750 мл буферного раствора Грайндинга (0,05 И буферного раствора три-НС1, рН 7,9), содержащего 53 глицероля, 2 мИ ЕДТА, 0,1 мИ дитиотреитола, 1 мМ 2-мерка- 5 птоэтанола, 0,233 M NaC1, 130 мкг/мл белого лизоцима куриных яиц и>,.

23 мкг/мл фторида фенилметансульфонила) и отстаивают в .течение

20 мин при 8 С. Затем добавляют

0,0125 объма 44 ДОС (дезоксихолат натрия) и смесь перемешивают 39 с.

После отстаивания в течение 20 мин вновь перемешивают 30 с. Затем

1000 мл ТСЕД + 0,2 И NaC1 (ТСЕД - И

0,01 M буферного раствора три-НС1 (pH 7,9), содержащего 53 глицерола, 0,1 мМ ЕДТА и 0,1 мИ дитиотреито ла, ТСЕД + 0,2 М NaC1 — ТСЕД с содержанием 0,2 M NaCl ) были добавле- 20 ны к раствору и энергично перемешивались в течение 5 мин. Суспензию о центрифугируют 45 мин при 4 С и

10000 х g. К полученному всплыв. шему веществу добавляют 0 075 объ- 25 ема 53"ного Polymin Р (pH 7,9) Спустя 5 мин полученный осадок собирают центрифугированием в течение 15 мин при 4 С и 6000 х g. Осадок гомогенизируют в ТСЕД + 0,5 М NaC1 (ТСЕД с зо содержанием 0,5 И ИаС1), гомогенат перемешивают 10 мин при 4 С, а затем о центрифугируют 30 мин при 4 С и

6000 х g. Полученный осадок гомогенизируют в ТСЕД + 1,0 М МаС1 (ТСЕД с содержанием 1,0 М NaCl) и перемешивают при 4 С в течение 10 мин. Гомогео о нат центрифугируют 30 мин при 4 С и

6000 х g.Ê полученному в результате всплывшему веществу добавляют сульфат аммиака в пропорции 35 г на

100 мл, все это перемешивают 30 мин при 4 С. Затем суспенэию центрифуги=. о руют 45 мин при 4 С и 10000 x g. Полученный осадок растворяют в 700 мл

ТСЕД.

Этот раствоо пропускают сквозь колонку с агарозой и ДНК телячьей зобной железы (2,6 х 15 см), изготовленную в соответствии с методом,Шаллара, для поглощения полимеразы, РКК. Колонку промывают 500 мл ТСЕД+

+ 0,15 И NaC1 (ТСЕД с содержанием 0,15 И ИаС1), затем 500 мл ТСЕД +

1+0,3 М NaC1 >ТСЕД с содержанием 0,3 И

NaC1).Ïîñëå этого сквозь колонку пропускают 500 мл ТСЕД + колонку пропускают 500 мл ТСЕД+

+ 1,2 М NaC1 для элюирования полиме

01 22

Полимераза

PHK

ДНК человеческой плаценты

20 ед/мл

3000 ед

200 мкг/мл 30 мг

0,6

ATP

0,6

CTP

90 разы РНК. К элюату добавляют суль- фат аммиака е пропорции 35 г на, 100 мл и перемешивают 30 мин при

4ОС. Образовавшуюся супенэию подвергают центрифугированию в течение

30 мин при 4 С и 10000 х д. В результате получен осадок- раствор 7 мл

ТСЕД + 0,5 И NaC1 + 303 глицероля (ТСЕД + 0,5 М NaC1 эа тем отличием, что содержится 303 глицероля вместо

5о )

Раствор делится на 2-3 равные части, и каждую часть подвергают фильтрованию сквозь гель через колонку с Био Гель А 5 м (Полиакриламидгель), уравновешенную ТСЕД ». 0,5 И 11аС1.

Элюирование производят с ТСЕД +

+ 0,5 NaC1. Из элюата извлекают фракции, обладающие активностью полиме« разы,РНК, и используют для синтеза PHK.

Удельная активность полученной та ,ким образом полимеразы PHK равна

320 ед/мг протеина при определении по методу Бургесса с использованием в качестве матрицы ДНК эобной железы теленка.

Единицу активности фермента определяют как количество, катализирующее введение 1 н объема 14 С-ATP в материал нерастворимой ТСА в течение

10 мин инкубации.

Коэффициент спектральной поглоти« тельной способности между 280 и

260 нм оказался равным 1,86. Суммарная активность полимеразы РНК, полученной из 250 r замороженных клеток, оказалась равной 30000 ед, а суммар" ное количество протеина - 96 мг.

Синтез, выделение и очистка PHK.

Реагенты, предназначенные для синте» за РНК, приведены в табл. 3; (всего

150 мл). Каждый реагент растворялся в 0,04 М буферного раствора триНС1 (рН 7,9) .

23, 9.330, Продолжение 1абл. 3

2 3

GTP,UTP .

kCl

0,6

0,6

7,5

150 . 600

И.пС1>

ИФ:1

2-меркаптоэтанол

0,5

Три-НС1, рН 7,9

0,04 И указанные реагенты тщательно сме шивают и помещают на 3 ч в термостат при 37 С. Затем реакционную 126 смесь охлаждают в водяной бане при

0 С для окончания реакции, нагревают в течение 5 мин при 65оС для инактивации полимеразы PHK и охлаждают проточной водой примерно до 37 С, затем и добавляют 16,7 мл 0,1 М ИдС1, что- бы довести раствор до 10 мМ, После этого добавляют 1,7 мг дезоксирибонуклеазы (без примеси рибонуклеазы) и помещают в термостат на 30 мин при о

37 С для дегидрирования, ДНК.

Реакционную смесь нагревают до о

il00 С в течение 3 мин для инактивации дезоксирибонуклеазы, затем охлаждают проточной водой до комнатной темпера-, туры. После этого добавляют 170 мл 55С .двойной концентрации (рН 7,0) и

340 мл фенол-крезольной смеси (состав : фенола 500 r, м-крезола 70 мл, воды 55 мл, гидроксихинолина 0,5 г) .

В течение 5 мин реакционную смесь встряхивают при комнатной температуре, затем центрифугируют 10 мин при 5оC и 5000 х g . К отделенному от фенольного слоя . и слоя денатури45 рованного протеина всплывшему ве- ществу добавляют половину объема фенол-крезольной смеси и встряхивают при комнатной температуре в течение 5 мин.

Эмульсию центрифугируют и всплывшее вещество диалйзйруют с 5 л .

SSC двойной концентрации (рН 7,5), .содержащей 0,053 5% в течение 1 ч при комнатной температуре, и диализируют вновь в течение 1 ч после замены внешнего раствора. Затем внешний раствор заменяют 5 л ЗЗС концентрации 0,01 (рН 7,0) и диализ

01 24 ведут еще в течение ночи при 2-5 С.

Диализат (310 мл) подвергают ультрафильтрации с использоввнием волоконного мембранного фильтра до получения 19 мл концентрата.

В 19 мл концентрата, полученного при ультрафильтрации, растворяют

19 r QCl. Затем общий объем доводят до 26 мл добавкой 0.01 М б Феоного раствора три-НС1 (рН 7,5), содержащего QC1 в пропорции 1 г на

1 мл буферного раствора. Раствор (26 мл) наносят на 7,8 мл 5,7 М

С Cl (pH 6, 5), содержащих О, 1 М

ETTA, а затем туда наносят еще

1,3 мл 0,1 И буферного раствора триНС1 (рН 7,5) и центрифугируют.

Центрифугирование ведут в роторе в течение 15 ч при 15 С и .27000 об/мин (13000ц x g).

После центрифугирования удаляют всплывшее вещество и PHK в чистой грануле растворяют в 3 мл 0,01 М буФерного раствора три-HCl . (pH 7,5).

Полученный раствор охлаждают в водяной бане при 0 С, добавляют два объема охлажденного этилового спирта и дают отстояться при -20 C в течение 1 ч. Полученный осадок собирают с помощью низкоскоростного центри фугирования. Всплывшее вещество удаляют, и осадок вновь растворяют в

0,01 И буферном растворе три-НС1 (рН 7,5) °

Выход очищенной РНК равен 9,0 мг.

При добавлении 504 ТСА в осадок выпало примерно 904 очищенной РНК как нерастворимой фракции ТСА, Седиментационный коэффициент очищенной

РНК, замеренный с помощью центрифугирования для определения градиента плотности сахарозы с использованием рибосомной РНК L-клеток мыши в качестве стандаота равен поимеоно 11 с.

Отжиг PHK. (мг очищенной PHK растворяют в 12,0 мл 0,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,5), добавляют

3,0 мл 52С с 10-кратной концентрацией ГрН 7,0) г тем, чтобы концентрация РНК в двукратной концентрации

SSC стала равной 200 мкгlмл. Полученный раствор помещают в стеклянную пробирку с пробкой, прогревают 5 мин при 100 С быстро охлаждают в водя0 ной бане, при 0 С, после чего помещают в водяную баню при 85оC. Температуру водяной бани постепенно пони жает до 65 С в течение 2 ч, и при

65 С реакция протекает еще 4 ч. За=

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Н. Чубелко Техред M. Рейвес Корректор Г.- РеЬетник

Заказ 3829/79 Тираж 883 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

25 9330 тем отключают нагреватель водяной бани, и в течение ночи раствор отстаивается, постепенно охлаждаясь до комнатной температуры.

Устойчивость рибонуклеазы отожжен- S ной РНК (количества гибридной PHK-PHK; число двунитчатой гасти) определяют по методу Гемперта и др. 30 мкг отожженной РНК обрабатывают вместе с

20 мкг рибонуклеазы бычьей поджелудоч"В ной железы и 2 мкг рибонуклеазы- Т в

33С двукратной концентрации (рН 7.0) при 37 С в течение 30 мин, полученная в результате 12,0i нерастворимая фракция ТСА без дегидрирования 1$ была собрана миллипоровым фильтром (0,45 мкм) . С другой стороны, 30 мкг образца, нагретых в БАС 0,3 концентрации в течение 5 мин при

100 С и быстро охлажденных в водяной ?о бане при 0 С, подвергнуты рибонукле азной обработке, как упомянутого выше, в результате собрано 3,3Ф нерастворимой фракции недегидрированной ТСА с помощью фильтра. 15

Отожженная PHK регенерирована с помощью осаждения этанола в соответствии с типовой процедурой. Осадок диализируют с дистиллированной во— дой, диализат стериализуют фильтра- Зо цией, разделяют по ампулам и подвергают лиофилизации. В состав очищенной РНК входят, 3 :адениловая кисло" та 27,3, амидиновая кислота 21,5, цитидиновая кислота 18,5, уридиновая кислота 32,7., 26

Предлагаемый способ позволяет по" высить интерферониндуцирующую активность целевого продукта °

Способ получения синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью, путем использования человеческой ДНК в качестве матрицы для ферментативного синтеза, о т л и ч à ю щ и йс я тем, что, с целью повышения интерферониндуцирующей активности целевого продукта, аденоэинтрифосфорную, уридинтрифосфорнуЮ гуанидин трифосфорную и цитидинтрифосфорную кислоты инкубируют с ДНК из человеческой плаценты в присутствии активной PHK- полимеразы hlictococcus

1ysodeikt iud или E seher i ch i a coli в течение 2-4 ч при t =20"40 С в триссолянокислом буферном растворе при рН 7,0-8,0, образовавшуюся в резу тьтате реакции РНК отделяют от белка обычным способом, отделенную от бел" ка РНК центрифугируют с использованием Св С1 в качестве амортизатора, целевой продукт осаждают этанолом и выдерживают в термостате при t=70o

100 С, затем быстро охлаждают до комнатной температуры или ниже.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Японии М 2008/75, кл. 113 E 4, 1975.