Способ получения сесквитерпенового производного

 

ОП ИСАНИЕ

И ЗОБРЕТЕ Н ИЯ

К AAYKHT3f

Союз Советских

Социалистических

Республик (»)980620

Ф

/ н= ,, г (61)Дополнительный к патенту(22) Заявлено 30. 06. 78(21) 2633102/23-04 (23) Приоритет - (32) 30. 06. 77 (31) 786 41/77 (331 Ялани я (51) М, .Кл.

С 07 О 307/94

С 12 P 17/04

//А 61 К 31/34

Государстеенный немнтет

СССР

Опубликовано07.12.82.Бюллетень № 45 (53) УДК g47.728..07(088.8) яо делам нзобретеннй я еткрытнй

Лата опубликования описания 07.12.82

) ностранцы

Масанао Синохара, Хироцугу Каисе, Есимаса Накано, Такетоси Изава, Ясуо Осиро и. Вас (Япония)

1 (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Оцука Фармасьютикал Ко,:Лтд" (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕСКВИТЕРПЕНОВОГО

ПРОИЗВОДНОГО

CHQ

СНО

С(Сн,), ОН

НО нс сн, !

Н(СН )2

Изобретение относится к способу получения сесквитерпенового производного формулы или его фармацевтически приемлемой соли, обладающего фармакологической активностью, Известен способ получения сесквитерпенового углеводорода - гвайазулена формулы заключающийся в том, что гвайол Формулы дегидратируют с помощью муравьиной кислоты и затем дегидрируют серой и 220оC 1

Однако в литературе не описан, 15 способ получения сесквитерпенового производного формулы I, которые могут найти применение в медицине в качестве фармацевтического препарата.

Зт Цель изобретения - способ получения нового фармакологически активного сесквитерпенового производного формулы I.

Поставленная цель дости гает ся

25 способом получения сесквитерпеново0620

3 98

ro производного формулы I заключающимся в том, что проводят зробное культивирование микроорганизма вида Stachybotrys в питательной среде, содержащей один или более усвояемых источников азота, такие как

> соевая пудра, соевое масло, жидкость от замачивания кукурузы, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, овсяная мука, мясной экстракт, гидролизованный казеин, соли аммония, нитраты, глицерин или углеводь!, такие как глюкоза, мальтоза, лактоза, саха— роза, меласса или крахмал, неорганические соли, такие как соли кальция, карбонаты, хлористый натрий, сульфат магния или фосфорная кислота, и микроэлементы, такие как железо, медь, магний, цинк при рН 3,5-11,5 и температуре 15-35 С с последующим выделением целевого продукта из культурального бульона, Из микроорганизмов предпочтительно используют Stachybotrys altermans

iF0 9355, Stachybotrys chariarum

1ГО 5369, Stachybotrys chartarum

iF0 7222, Stachybotrys суlindrospoга 8853, Stachybotrys echinata 7525, Stachybotrys renifornus 7067, Stachybotrys sp. К-76, Stachybotrys sp.

T-789 или Stachybotrys sp. Т-791.

Сесквитерпеновое производное формулы I обладает антикомплементарной активностью и может найти применение в качестве активного ингредиента в лекарствах, эффективных против аутоимунных заболеваний, нефрита, Ревматизма, коллагеновых заболеваний, аллергических заболеваний и рака.

Микроорганизмы вначале культивируют в среде, содержащей обычные источники питания и добавки, Источниками азота, обычно используемыми в культивируемом субстрате, являются, например, порошок соевых бобов, соевое масло, жидкость от замачивания кукурузы, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, овсяная„ мука, мясной экстракт, гидролизованный казеин, аммонийные соли, и нитратные соли. Примерами подходящих источников углерода являются глюкоза, глицерин, мальтоза, крахмал, лактоза, сахароза и меласса. Примерами добавок в питательную среду являются такие неорганические соли, как карбонат кальция, хлористый натрий, сульфат магния, и фосфорная кисло4 та. Питательная среда содержит незначительные количества солей таких металлов, как железо, медь, марганец и цинк. Культивация может осуществляться в обычной водной среде, содержащей указанный выше субстрат с использованием техники поверхностной культивации или техники погружной культивации с азрированием и перемешиванием, Предпочтительно является погружная культивация с аэрированием и перемешиванием, Культи вацию проводят при 2032 С в течение 3-7 дней, обычно при аэрировании, поддерживая рН питательной среды 4 5-9 5.

После культивации полученное вещество выделяют из культурального бульона, Способ выделения особо не ограничивается и могут быть использованы различные известные способы, применяемые в зависимости от физико-химических свойств полученных веществ, Выделение может быть осуществлено, например, с помощью метода, использующего различие в растворимости между продуктами и примесями, метода, использующего различия в адсорбционной способности и средстве к обычным адсорбентам, таким как активированный уголь, ХАД-2, силика гель, ионообменные смолы, или Сефадекс, метода, использующего различия в коэффициенте

- распределения между двумя жидкими фазами, и комбинации таких методов.

Обычно культуральный бульон фильтруют или концентрируют обычным образом для удаления клеточной массы.

Затем добавляю1 метанол к всплывшему слою жидкости, смесь перемешива" ют и оставляют стоять 2-3 ч. Осадок отделяют с помощью дополнительного центрифугирования. Остаток экстрагируют равным объемом этилацетата и отгоняют растворитель. Экстракт помещают в метанол и метанольный раствор пропускают через колонку с активированным углем, из элюата отгоняют растворитель. Остаток подвергают гель-фильтрации íà Сефадексе LH-30. Каждую из полученных фракций подвергают тесту на антикомплементарную активность. Собирают активные фракции и отгоняют растворитель, получают чистый 6,7-диокси-2,5,5,8а-теураметил-1,2,3 „4,4а,5,6,7,8, Ra-декагидронафталин -1-спиро:Й- (6, 7 9806

1Î

5

-диформил-4 -окси-2,3 -дигидро( бензофуран), Пример 1, B колбу Сакагуши на 500 мл загружают 100 мл питательной среды следующего состава и культивируют Stachybotrys sp. К-76 при

28 С и рН 6, при встряхивании, Состав питательной среды, Глицерин 015

Крахмал

Лактоза 0 2

Порошок соевых бобов 0,5

Экстракт дрожжей 0,1

Мясной экстракт 0,2

СаСО 0,3 мц о„ 0,05

В ферментатор, емкостью 30 л, загружают 20 л питательной среды приведенного выше состава и одну кол- z0 бу полученной посевной культуры культивируют в питательной среде при 28 С в течение 5 дней при перемешивании со скоростью 300 об/мин и циркуляцией воздуха со скоростью 25

1 л/л питательной среды в минуту, Полученный культуральный бульон центрифугируют со скоростью 8000 об/мин для удаления микробных клеток. К верхнему всплывшему слою жидкости при- зв бавляют 5 л метанола, смесь перемешивают, а затем оставляют на 3 ч, Смесь центрифугируют для удаления осадка и отделяют верхний всплывший слой, остаток экстрагируют равным по объему количеством этилацетата, Отгоняют растворитель из этилацетатного слоя при пониженном давлении. Остаток растворяют в метаноле и пропускают через колонку с активированным углем, Концентрируют элюат досуха при пониженном давлении, Сухую массу раствсряют в смеси хлороформа с этилацетатом (1:1) и подвергают гельфильтрации через колонку с Сефадек- 45 сом L,Н-20. фильтрат подвергают тонкослойной хроматографии, используя смесь этилацетата, хлороформа и уксусной кислоты (объемное соотношение

50:50:4) в качестве растворителя, и

50 собирают фракцию, обладающую антикомплементарной а кти вност ью, соответствующую Rg 0,34. Альтернативно фильтрат подвергают тонкослойной хроматографии, используя смесь бензола, бутанола и уксусной кислоты (объемное соотношение 60:15:5) и собирают фракцию, обладающую антикомплементарной активностью, соответ20 6 ст вующую. + =0, 58, Выпариванием ра створителя из фракции получают 2,0 r

6 7-диокси-2,5,5,8à-тетраметил-1,2, 3, 4,4а,5,6,7, 8, 8а-дека гидронафталин-l -спиро-2 - -(6,7 -диформил-4 -.

-окси-2,3 -дигидробензофурана), 3<3 1 =-48 (С=2,5; метанол)

Уф-спектр (этанол): A g 246 нм (Е =16474) и 307 нм (Е =6659), Пример 2, В колбу Сакагуши, емкостью 500 мл, загружают 100 мл питательной среды, имеющей следующий состав, и культивируют на ней известный штамм Stachyhotrys chartarum 3F0 5369, при 28 С в течение

4 дней при рН 6, с обратным встряхиванием.

Состав питательной среды, Глицерин 0>5

Крахмал 1,0

Ла ктоза 02

Порошок соевых бобов 0,5, Экстракт дрожжей 0,1

Мясной экстракт 0,2

СаСО 0)3

SgSO 0,05

В ферментатор, емкостью 30 л, загружают 20 л питательной среды и засевают двумя колбами полученной культуры, культивируют при 28 С в течение 5 дней при перемешивании со скоростью 300 об/мин при скорости циркуляции воздуха 1 л/л среды s минуту. Полученный культуральный бульон центрифугируют со. скоростью

8000 об/мин для удаления микробных клеток. К всплывшему верхнему слою прибавляют 5 л метанола, смесь перемешивают и оставляют на 3 ч. Смесь центрифугируют для удаления осадка, всплывший верхний слой удаляют, остаток экстрагируют равным количеством по объему этилацетата, Удаляют растворитель из этилацетатного слоя, концентрируя досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в метаноле и пропускают через колонку с активированным углем, Элюат концентри" руют досуха, при пониженном давлении, растворяют в смеси хлороформа и этилацетата (1 :1) и подвергают гель-хроматографии на колонке с Сефадексом

LH-20. Собирают фракции, имеющие величины К, приведенные в примере

1, При выпаривании растворителя получают 2,2 г 6,7-диокси-2,5,5,8а-тетраметил-1,2,3,4,4а,5,6,7,8,8а980620

-дека гидронафтали н-1- спи ро-2 -(6, 7 -,диформил-4 -окси-2",3 -дигидробензофурана ).

П р и N e р 3. Stachybotrys sp.

Т-789 культивируют и очищают аналогично примеру 1, с тем исключением, что используют другую питатель. ную среду, регулируя рН на уровне

7,5 при температуре культивации 32 С. б

Состав питательной среды, Ф: io

Глицерин 0 5

Глюкоза 1,2

Жидкость от замачивания кукурузы 0,5 35

Сухие дрожжи 0,1

Солодовый экстракт ОФ2

SgSO 0,05

ИаС1 0,3

Получают 6,7-диокси-2,5,5,8а-тетраметил-l, 2,3-4, 4а,5,6,7 8, 8а-дека гидр онафт алин-1 - спиро-2 - (6, 7 -диформил-1 -окси"2,3 -дигидробензофуран).

Пример 4. Культивируют Stachybotrys sp. Т-791 и очищают по примеру 1, с тем исключением, что питательная среда имеет следующий состав и рН 5,5, а температуру культи- зо вации поддерживают равной 25ОС.

Состав питательной среды, Гли цери н 0 5

Крахмал 1,0

Сахароза 0,2

Порошок соевых бобов 0,5

Пептон О,1

Солодовой экстракт 0,2

WgSO 0 3

НС1 ОФ05

Получают 6, 7-диск си-2, 5, 5, Яа-тетраметил-1,2-,3, 4, 4а, 5,6, 7, 8, 8а-декагидронафталин-1-спиро-2 - (6,7 -диформил- М -окси-2, 3 " ди гидробен зофуран).

Пример 5. Микроорганизм Stachybdtrys sp, К-76 подвергают культивированию и очистке аналогично примеру 1, за исключением того, что в данном случае процесс проводят в питательной среде нижеследующего состава и продолжительность культивирования равна 5 дням.

5S

Состав питательной среды:

Овсяная мука, г 30

Крахмав, r 10

Первичный кислый фосфат калия, r 1

Минеральные микродобавки, мл 1

Вода, мл 1000

Получают 2,1 г 6,7-диокси-2,5, 5,8а-тетраметил-1,2 3 4 4aр5,6 7

8 8а-декагидронафталин-1-спиро-2

-(6,7 -диформил-4 -окси-2,3 -дигидробензофурана).

П р и q е р 6. Микроорганизм Stachybotrys sp. К-76 подвергают культивированию и очистке по примеру 1, за исключением того, что в данном случае процесс проводят в питательной среде нижеследующего состава и продолжительность культивирования равна 5 дням.

Состав питательной среды

Нитрат натрь;, г 3

Вторичный кислый фосфат калия, г 1

Гептагидрат сульфата магния, г 0,5

Хлорид калия, г 0,5

Минеральные микродобавки, мл 1

Крахмал, г 3.0

Вода, мл 1000:

Получают 2,0 г 6,7-диокси-2,5,5, За-тет раме тил- l, 2,3, 4, 4а, б, 7 8, 8а-дека гидронафталин-1-спиро-2 - (6, 7 -диформил-4 -окси-2, 3 -ди гидробензофу ра на ), П р и и е р 7, Микроорганизм Stachybotrys sp, K-76 подвергают культивированию и очистке аналогично примеру 1, но в данном случае процесс проводят в питательной среде нижеследующего состава и продолжительность культивирования равна 5 дням.

Состав питательной среды

Гидролизованный казеин, r 5

Крахмал, г 20

Первичный кислый фосфат калия, r 1

Минеральные микродобавки, мл 1

Гептагидрат сульФата магния, г 0,5

Вода, мл 1,000

Получают 2,2 r 6,7-диокси-2,5,5, 8а-тетраметил-l,2,3,4,4à,5„6,7,8, 8а"декагидронафталин-1-спиро-2 -(6 7 -диформил-4 -окси-2, 3 -ди гидробензофурана), 980620

СНО

НО

0,5

0,1

Формула изобретения

Составитель Т,Левашова

Редактор Т.Киселева : Техред М.Коштура

Корре ар 8 Пр акаэ 9 95/ 0 йраж 5 одписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж"35, Раушская наб,, д. 4/5

Филиал ПП атент, г, жгород, ул. Проектная, Пример 8. Микроорганизм Stachybotrys sp. К-76 подвергают культивированию и очистке аналогично примеру 1, но процесс проводят в питательной среде нижеследующего состава и продолжительность культивирования равна 5 дням.

Состав питательной среды

Сульфат аммония, r 1

Крахмал, r 20

Гептагидрат сульфата магния, г

Первичный кислый фосфат калия, г 1

Минеральные микродабавки, мл 1

Вода, мл 1,000

Получают 1,9 r 6,7-диокси-.2,5,5, 8а-тетраметил-1,2,3,4,4а,5,6,7,8, 8а-декагидронафталин-1-спиро-2 -(6, / /

7 -диформил-4 -окси-2,3 -дигидро бензофурана) .

В примерах 5-8 используют добавки микроэлементов следующего состаеа:

Гептагидрат сульфата двухвалентного железа, r 0,1

Тетрагидрат хлорида двухвалентного марганца/ г 0 1

Гептагидрат сульфата цинка, г

Пентагидрат сульфата меди, г 0„01

Вода, мл 100

Раствор добавляют в качестве

1 мл на каждые 1000 мл питательной среды.

1, Способ получения сесквитерпенового производного формулы

НО н с сн, или его фармацевтически приемлемой соли, отличающийсятем, что проводят аэробное культивирование микроорганизма вида Stachybotrys в питательной среде, содержащей один или более усвояемых источников азота, таких как соевая пудра, соевое масло, жидкость от замачивания кукурузы, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, овсяная мука мясной экстракт, гидролизованный казеин, соли аммония, нитраты, глицерин или углеводы, такие как глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, меласса или крахмал, неорганические соли, такие как соли кальция, карбонаты, хлористый натрий, сульфат магния или фосфорная кислота,и микроэлементы такие же как железо, медь, магний, цинк, при рН 3,5-11,5 и температуре 15-35 С с последующим выделением целевого продук" та из культурального бульона.

2 Способ по и 1, о т л и ч ю щ и й.с я тем, что микроорганизм выбирают из группы, состоящей из

Stachybotrys altermans 3 FO 9355, Stachybotrys chaгiàгап 3F0 5369, Stachybotrys chartarum 3F0 7222, Stachybotrys cy l indtospora 8853, Stachybotrys echinata 7525, Stachybotrys renifornus 7067, Stachybotrys sp ° К-76, Stachybotrys sр. Т-789ф и Stachybotrys sp. T-791 °

Источники информации принятые во внимание при экспертизе

1, Фиэер Я,, Фиэер М. Органичес- кая химия.М.,"Химия",1970,т.2,с.502.