Способ определения аденилаткиназной активности сыворотки крови

 

ОПИСАИИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТВЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 25.03.81(21) . 3268278/28-1 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 23.12.82. бюллетень йо 4

Государствеииый комитет

СССР

А0 делам изобретеиий и открытий

Дата опубликования описания 2а1282

/ ау

L„"

Л.Т. Малая, П.A. Калиман, В. В. Лемешко, и М.A.Âëàñåíêî (72) Авторы изобретения

Харьковский медицинский институт и Харьковский ордена

Трудового Красного Знамени государственный университет (71) Заявители . (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНИЛАТКИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

CblBOPOTKH КРОВИ

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для диагностики ряда заболеваний деструктивного характера, таких как мышечные дистрофии, острый инфаркт. миокарда, острый гепатит.

Известен способ определения аде.нилаткинаэной активности путем определения АДФ с помощью ферментат вной пируваткинаэной-лактатдегидрогенаэной системы.с последующей регистрацией уменьшения концентрации добавленного пиридиннуклеотида НАДИ jlJ.

Однако известный способ не позво"ляет достоверно определить аденилат- !5 кинаэную активность.

Наиболее близкой к предлагаемому является способ определения аденилаткиназной активности сыворотки крови путем измерения концентрации восста- 20 новленной форьы пириэиннуклеотида (2).

Однако известный способ не позволяет достаточно точно определять аденилаткинаэную активность сыворотки крови.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается тем, что при осуществлении способа определения аде" нилаткиназной активности сыворотки крови путем измерения концентрации восстановленной формы пиризиннуклеотида предварительно гемолиэируют с разной степенью две пробы крови исследуемого, отделяют сыворотку, далее" определяют в ней концентрацию гемоглобина и восстановленной форвы пиридиннуклеотида, а аденилаткиназную активность определяют по формуле

А - Аи — ° Н

Нв- Н где А - аденилаткиназная активность сыворотки,рассчитанная по восстановленному пиридиниуклеотидут

A A" - аденилаткиназная актив ность в двух пробах сыворотки

На, Не - измеренные концентрации гемоглобина в первой и второй пробах.

Способ осуществляют следующим образом.

У обследуемого берут из вены 2 мп крови, разливают по 1 мл в две центрифужные пробирки. В одной из пробирок кровь перемешивают стеклянной палочкой для создания повьааенного гемолиэа.

983543 и

5 Сыворотку получают, помещая проби1 ки с кровью в центрифугу,"и центр фугируют в течение 15 мин со скоростью 3000 об/мин. Отделившуюся в каждой пробирке сыворотку сливают в две чистые пробирки и сохраняют при -2 0 до измерения в них концентрации гемоглобина и определения обцей аденилаткиназной активности.

Определение концентрации гемоглобина в каждой из полученных проб сыворотки осуществляют следующим образом ..

Предварительно смешивают 2 об. ч.

0,1 N ацетатного буфера с рН 4,5-4,6, 1 об. ч. 0 1%-ного раствора бенэидина в ацетатном буфере и 1 об. ч.

0,3Ъ-ного раствора перекиси водорода.

Затем к 8 мл полученной смеси добавляют 0,04 мл сыворотки крови, перемешивают и наливают в кювету фотоколориметра. Через 5 мин, в течение которых обычно развивается максимальная окраска, определяют концентрацию гемоглобина по калибровочному графику. Концентрация ге глобина в первой пробе 9 мгЪ, концентрация гемог" лобина во второй пробе 19 мгВ.

После определения концентрации.гемоглобина в каждой из проб сыворотки определяют общую аденилаткинаэную активность следующим образом. Используют реактивы следующего состава

- "еакционная среда

100 мм-ный раствор трнсацетатного буфера, рН 7 0

2 мм-ный раствор хлористого магния. 35

0,1 мм-ный раствор трилона Б

40 мм-ный раствор глюкозы

0,2Ъ-ный раствор меркаптозтанола

0,4 мм-ный раствор НАДФ

Раствор глюкоэо«6--фосфатдегидро- 40 геиазы 25 ед/мл

Раствор гексокинаэы в 40 мм-ном растворе глюкозы 25 ед/мл

50 мм-ный раствор АДФ

50 мм-ный раствор АТФ 45

Затем термостатируемую ячейку флуориметра добавляют 1 мл термостатированной реакционной среды, 0,02 мп раствора глюкозо-6-фосфат-дигидрогеназы, 0,02 мл раствора гексокиназы и 0,02 мл раствора АДФ. После чего шторку флуориметра открывают и s течение 2 мин регистрируют на ленте самопишущего потенциометра исходный уровень флуоресцеиции. Далее в ту же ячейку добавляют 0,02 мл сыворотки крови и в течение 5-7 мин регистрируют увеличение интенсивности флуоресценции, связанное с увеличением концентрации образуюцегбся НАДФН.

Обцую аденилаткийазную активность 60 рассчитывают по количеству НАДФН (в наномолях), образующегося в 1 мл сыворотки за 1 мин. Результаты опреде" .ления следующие величина аденилаткиназной активности в пробе сыворотки с концентрацией гемоглобина 9 мг В (Н / 58 нмоль/мл мин (A "J а в пробе сыворотки с концентрацией гемоглобина 19 mr% — 88 нмоль/мл.мин.

Подставляя найденные значения в .формулу, находят искомую аденилаткиназную активность

1 я

Л=Л ° К я 8

8 6 где A — аденилаткиназная актив- ность сыворотки, рассчитанная по восстановленному пиридиннуклеотиду

A, A " аденилаткиназная актив- ность в двух пробах сыворотки

Н> Н вЂ” измеренные концентрации гемоглобина в первой и второй пробах, 88-58 нмоль

A=58- ----- -9=58-27=3-1

19-9 мл ° мин

Предложенный способ обеспечивает воэможность .определения аденилаткиназной активности незритроцитарного происхождения, как критерия заболеваний деструктивного характера, связанного непосредственно с деструктивными изменениями в органах и тканях и нв зависяцего от других факторов, таких как гемолиэ,что в результате значительно повысит. достоверность и точность диагностики такого ряда заболеваний.

Формула изобретения

Способ определения аденилаткиназной активности сыворотки крови путем измерения концентрации восстановленной формы цириэиннуклеотнда, о т л ич а ю ц и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, предварительно гемолиэируют с разной степенью две пробы крови исследуемого, отделяют сыворотку, далее определяют в -ней концентрацию гемоглобина и восстановленной формы пиридиннуклеотида, а аденилаткиназную активность вычисляют по формуле я яя А Л и

1 п 8. нв-"й где A - аденилаткннаэная активность сыворотки, рассчитанная по восстановленному пиридиннуклеотиду

A,,А" — аденилаткиназная активность в двух пробах сыворотки

f Н

Н8, Н8 †.измеренные концентрации гемоглобина в первой и второй пробах.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Adam Н. Methods of Ensimatic

Analysis, Academic Pressð N-Х, 1965, рр. 573-577.

2. Kaplan 010. Metods in Ensimology М.О.V.Õ,1967, рр. 448-463.