Способ получения сесквитерпеновых производных или их солей

Авторы патента:

C07D493/02 - в которых конденсированная система содержит два гетероциклических кольца

C07D307/94 - спиро-конденсированные с карбоциклическими кольцами или циклическими системами, например гризеофульвины

A61P37/08 - противоаллергические средства (антиастматические средства A61P 11/06; офтальмологические противоаллергические средства A61P 27/14)

A61P37 - Лекарственные средства против иммунологических или аллергических заболеваний

A61P35 - Противоопухолевые средства

A61P29 - Анальгетики нецентрального действия, жаропонижающие или противовоспалительные средства, например противоревматические средства; нестероидные противовоспалительные средства (НПВС)

A61P17 - Лекарственные средства для лечения дерматологических заболеваний

A61P13/12 - почек

A61K31/343 - конденсированные с карбоциклическим кольцом, например кумаран, буфуралол, бифуналол, клобенфурол, амиодарон

Способ получения сесквитерпено вых со.единений общей формулы - o-rvft: . Н( СНо Где RI - формильная.группа; Rj - карбоксильная группа,, или R,«Rf внесте с атомами углерода бензольного кольца, с которым они связаны, образуют .лактоновое; кольцо но или их солей, о т л и ч а ю щ и и .т с я тем, что соединение формулы

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY

Н0 0. 0

НЗС СН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (2И 299 84 5 3/ 2 3-04 462$ 2633102/04 .(22) 28. 10. 80. (23) 30.06,78. (31) 78641 /77 (32) 30. 06. 77 (33) Япония (46) 23.11.83. Бюл. Р 43 (72) Масано Синохара, Хироцугу Каное, Есимаса Накано, Такетоси Изава,l

Ясуо Осиро и Васеи Миязаки (Япония) ,(71.) Оцука Фармасьютикал Ко, Лтд. (Япония) (53) 547.722.07(088.8) (56) 1. Вейганд-Хильгетаг. Методы эксперимента в органической химии.

5 Химин, 1968р с. 310-311. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕСКВИ1ЕРПЕНОВРХ СОЕДИНЕНИЙ ИЛИ ИХ СОЛЕЙ. (57) Способ получения сесквитерпено вых соединений общей формулы

H0 Ri ц2.

am SU an А

S(50 С 07 Х) 307/94; С 07 и 493/02//

A 61 К 31 34 где Й вЂ” формильная группа; вЂ” карбоксильная группа, или

R, Í - вместе с атомами углерода бензольного кольца, с которым ови связаны, образуют ,лактоновое„: кольцо или их солей, о т л и ч а ю щ и и вЂ” . с я тем, что соединение формулы

3 где R и Ng вЂ” одинаковые - формильная группа, .(подвергают окислению окисляющим агентом, таким как окись серебра или перманганат щелочного металла, при температуре окружающей среды в присутствии гидроокиси щелочного металла или кислородом, или возду:хом в присутствии гидроокиси щелочно го металла при 50 С, 1056901

Изобретение относится к способу получения новых соединений-сесквитерпеновых производных формулы

Н0

10 формильная группа; карбоксильная группа, или вместе с атомами углерода f5 бензольного кольца, с кото-. рым они связаны,образуют . лактоновое кольцо где 2 H 2

НО или их солей.

Эти соединения обладают антикомпле ментарной активностью - ингибирующей активностью против комплементной системы животных, против аутомунных за" болеваний, нефрита, ревматизма, коллагановых заболеваний, аллергических заболеваний и рака.

Способ основан на известной реак-! ции окисления формильной группы до карбоксильной группы окисью серебра или перманганатом металла в присутса-35 вии основания (lj .

Пель изобретения вЂ” пОлучение новых соединений общей формулы (1), обладающих ценными биологически активными свойствами. 40

11ель достигается согласно способу, который заключается в том, что соединение общей, формулы (11) R1

Среди полученных соединений, сое.

;динение у которого один .из g,. или gg является формильной группой, а дру- гой Й или Rq вЂ” карбоксильной груп50 пой формулы (1), и соединение формуль. (1), где R< и Й образуют вместе лактольный цикл формулы (I) в основном растворителе, находятся в виде равновесной смеси соединения (1b< ) и его таутомерного соединениявЂ” монокарбоновой кислоты (1Ь ).

Эти структуры подтверждены путем растворения соединения (1Ъ ) (кристаллического) в диметилсульфоксиде

60 и снятия спектров HNP во времени.

Через 20 мин после растворения наблюдается пик при 9,89 млн. дол., который является характеристическим сигналом альдегидного протона (-СНО), 5 в дополнение к пику при 6,36 млн.дол.

НО

HsC где И и К вЂ” одинаковые вЂ” формильная группа, (подвергают окисленыюокисляющим агентом, таким как окись серебра или перманганат щелочного металла, при температуре окружакщей среды в

:присутствии гидроокиси щелочного металла, или кислородом, или воздухом в приСутствии гидроокиси щелочнбго металла при 50 С. о

Окисление с, использованием .окисляющего агента ведут в подходящем растворителе, например всде или водосодержащем, или безводном органическом растворе, например спирте, таком, как метанол или этанол, пиридине, простом эфире, таком как диоксан, тетрагидрофуран или диэтиловый эфир, кетоне, таком как ацетон или метилэтилкетон, карбоновой кислоте, такой как уксусная или пропионовая кислота", сложном 9<,ире, таком как этилацетат, ароматическом углеводороде, таком как бензол или хлорбензол, гексаметиленфосфорамиде, диметилформамиде и диметилсульфоксиде. Подходящим количеством окисляющего агента является 1-10 эквивалентов, предпочтительно 1-2 эквивалента на формильную группу исходного соединения.

Контактный окислительный способ с использованием кислородсодержащего газа (воздух или кислород) может быть осуществлен, например, путем пропускания кислорода или воздуха в водный раствор гидроокиси натрия или гидроокиси калия в отсутствие катализатора, или путем пропускайия воздуха или кислорода в водный раствор;

После проведения указанной окислительной реакции окислякиций агент если он был использован, разлагают восстанавливакицим агентом, а затем удаляют неорганические побочные продукты фильтрованием, нейтрализацией, вакуумной перегонкой и т.п. При пропускании воздуха или т.п. через реакционную систему реакционную смесь обрабатывают активированным углем, а затем подкисляют, например, соляной кислотой для осаждения кристаллов, Реакционную смесь экстрагируют органическим растворителем, таким как этилацетат, а затем подвергают разделению и очистке, например, хроматографией на колонке или фракционной кристаллизацией.

1 0 6901 который является характеристическим сигналом лак то а. Интеграль кое соотношение . первого пика ко второму составляет примерно 73: 27. Через 2 ч после растворения пик при

9,89 млн. дол. несколько увеличивается, интегральное соотношение пиков достигает примерно 70:30. Такое интегральное соотношение достигается через 2 ч после растворения, едва изменяясь после этого. Этот результат показывает что соединение (?Ъ ) и соединение (lb<) находятся в равновесной смеси 7:3 в укаэанном растворителе. При использовании в ка честве растворителя метанола или пи- 15 ридина подобный ЯМР-спектроскопический анализ не приводит к конформации соединения (lb< ), которое является таутомером соединения (Ib ).

П р и.м е р 1. Растворяют 2,1 r gp нитрата серебра в 1 мл воды и прибавляют 3,5 мл 5,8 М водного . раствора гидроокиси натрия. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем прибавляют 25 раствор 1,0 г 6,7-диокси-2,5, 5,8а-, тетраметил-l, 2, 3, 4, 4а, 5, б, 7, 8, За-. декагидронафталин-1- спиро-2(б,-7 -диформил-4 -окси-2, 3 -дигидробензофурана ) в 2 мл этанола.

Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение

1,5 ч, устанавливают рН равным,,примерно, 2 с помощью 2 н. соляной кислоты. Реакционную смесь экстрагируют таким же количеством по объему этилацетата, отгоняют растворитель из экстракта при пониженном давлении. Остаток очищают хроматогра фией на колонке с силикагелем (си,ликагель )яаКо С-200 ), элюентом,4О является смесь хлороформ-этил-ацетат-. уксусная кислота 100:50:2 (по объему). Собирают фракцию, соответст. вующую 0,37 при тонкослойной хроматографии, используя смесь этил- 45 ацетат-хлороформ-уксусная кислота в объемном соотношении 50:50:2 в качестве проявляющего агента, или фракцию, соответствующую К = 0,71 при тонкослойной хроматографии с 50 использованием смеси бензол-бутанолуксусная кислота в объемном соот-. ношении 60:15:1 в качестве проявлякщего агента. Выпариванием растворителя из фракции получают 700 мг 55

4,б-диокси-8-оксо-2, 3, б, 8-тетрагицрофуро-(3,4-о) -бензофуран-2спиро-1. -(6, 7 -диокси-2, 5, 5 -Si тетраметил-1, 2 3, 4, 4а, 5, б, 7, 8, 8 а-декагидронаф- 6О талина в виде светло-желтых аморфных кристаллов. а >о -44,8оg С = 0,9, метанол)

Элементный анализ для С Н О01.

Вычислено, Ъ:: С 66,03; Н 7,18. 65

Найдено, Ъ: С 65,93; Н 7,21 ° () ЯМР вЂ” анализ проведен с использованием СД ОД (Д5Б) в качестве растворителя. (i i ) ЯМР вЂ” анализ проведен с использованием пиридина 8< (Д ЗЬ) в качестве растворителя. (ei() ЯМР вЂ” анализ проводят череэ

2 ч и через 63 ч после растворения (ЯМР вЂ” спектры через 2.ч и через

63 ч после растворения согласуются друг с другом) .

В качестве растворителя используют диметилсульфоксид

0,05 0,05 0,05

Условия измерения при получении

ЯМР вЂ” спектра следующие:

Спектральная амплитуда 9 ° 100 5 "100 8 .100

Фильтр, С 0,1 0 1 0,1

РР мощность,мй

Время развертки, мин 5 5 5

В ирина газвертки, млн. дол. 10 10 . 10

Конец развертки, млн.дол, 0 0 0

Пример 2. Суспендируют

0,64 г окиси серебра в 1 н. водном растворе гидроокиси натрия и прибавляют при перемешивании при комнатной температуре 1,0 г 6,7-диокси2,5, 5, 8а-,тетраметил-l, 2, 3, 4, 4а, 5, 6, 7, 8, 8а-декагидронафталин-1-спиро-2 -(б, 7 -диформил-4 вЂ” окси-2, 3 -дигидробензофурана) .

Смесь перемешивают при этой же температуре в течение 1 ч и промывают осадок 5 раз в 10 мл воды. Объеди няют промывные воды и фильтрат и прибавляют концентрированную соляную кислоту (36%), устанавливая рН

2-3 с последующим охлажденгим до

0-10ОС. Собирают выпавшие кристаллы фильтрованием, промывают 5 раз в

10 мл ледяной воды и сушат.

Растворяют сухие порошкообразные кристаллы в 50 мл этилацетата, отделяют нерастворимый материал фильтрованием. Концентрируют фильтрат до объема 5 мл при пониженном давлении.

К концентрированному раствору прибав.ляют 50 мл лигронина, смесь хорошо перемешивают и оставляют охлаждаться до 0-10 С.. Отфильтровывают выпавшие кристаллы, дважды промывают их 20 мл гидронина и сушат, получая 0,01 г

4,б-диокси-8-оксо-2, 3, 6, 8-тетрагидрофуро-(3, 4-g)-бензо-фуран-2спиро-1 вЂ (6, 7 -диокси-2, 5, 5, 8 а-тетраметил-1,-2, 3, 4, 4 а-

5 6 / 7, 8, 8 а-дакагидронафталина). Физико-химические свойства полу1056901 ленного соединения аналогичны приведенным в примере 1.

Пример 3. Растворяют 1,0 г

6,7-диокси-2, 5, 5, 8а-тетраметил1, 2, 3, 4, 4а, 5, б, 7, 8, Ва-äåêàгидронафталин-1-спиро-2 вЂ (б,7 -диформил-4 -окси-2, 3 дигидробензофурана) в 50 мл 10%-ного водного раствора гидроокиси натрия и в То ке время пропускают через раствор воздух при 50 С. Раствор перемешивают в тео чение 30 мин, подкисляют соляной к исло той до рН 2-3, выпавшие крис таллы отфильтровывают. Кристаллы промывают 10 мл .холодной воды 5 раз и сушат. Растворяют кристаллы в 50 мл 15 этилацетата и отделяют нерастворимый материал фильтрованием. Обрабатывают фильтрат активированньм углем и концентрируют до объема 5 мл при пониженном давлении. Концентрированный раст gp вор,. прибавляют и 50 мл лигронина при интенсивном перемешивании. Выпавшие в осадок кристаллы собирают фильтрованием, промывают лигроином и сушат.

Получают О, 72 г 4, б-диокси-8-оксо- 25

2, 3, 6, 8-тетрагидрофуро- (3, 4-P)вЂ” бензофуран-2-спиро-1 - (6, 7 -диокси

2, 5, 5, 8 а-тетраметил-1, 2, 3, 4 а, 5, б, 7, 8, 8 а-декагидронафталина). Физико-химические gp свойства полученного соединения аналогичны приведенным в примере 1.

Пример 4. Растворяют 1,0 г

6,7-диокси-2, 5, 5, 8а-тетраметил-

1, 2, 3, 4-4а-5, б, 7, 8, 8а-декагид-35 ронафталин-1-спиро .2, вЂ (6, 7 -диформил-4 -окси-2, 3 -дигидробензофурана) в 25 мл 1 н. водного раствора гидроокиси калия и прибавляют 50 мл водного раствора 0,578 r пермангана а калия частями при перемешивании.

После исчезновения окраски перманганата калия прекращают перемешивание.

Отфильтровывают осадок, используя селлаит в качестве вспомогательного вещества для фильтрования. Фильтрат подкисляют соляной кислотой до рН 2-3.

Отфильтровывают выпавшие в осадок кристаллы, промывают 10 мл воды

3 раза и затем сушат.,Высушенные кристаллы растворяют в 30 мл этил-,50 ацетата. Отфильтровывают нерастворимый материал, фильтрат обесцвечивают и концентрируют при пониженном давлении. К концентрированному раствору прибавляют 50 мл лигроина и перемешивают смесь. Отфильтровывают выпавшие в осадок кристаллы, промывают лигроином и сушат при

60 С при пониженном давлении. Получают О, 9 r 44,б-диокси-8-оксо- 2,3- gp

6,. 8-тетрагидрофуро-(3, 4-g)-бензофу

Ран-2-спиРо-1 - (6, 7-диокси-2, 5, 5, 8 а-тетраметил-1, 2, 3, 4, 4а, 5, б, 7, 8, 8 а-денагидронафталина (1Ъ„ ). Физико-хими- 65 ческие свойства полученного соединения аналогичны приведенным в примере 1.

Пример 5.К5мл04н. водного раствора гидроокиси натрия и 5 мл этанола прибавляют 418 мг

4,б-диокси-8-оксо-2, 3, б, 8-тетрагидрофурс-(3, 4-p)-бензофуран-2, спиро-1 -(б, 7 -диокси-2, 5, 5, 8 а-декагидронафталина). Смесь перемешивают при 30-40 С в течение

30 мин в токе азота ° После реакции отгоняют растворитель при пониженном давлении. Остаток сушат, затем и прибавляют туда 10 мл ацетона.

Отфильтровывают часть, растворимую в ацетоне. Оставшиеся сырые кристаллы перекристаллизовывают из смеси вода-ацетон. Получают 342 мг динатриевой соли б., 7-диокси-2, 5, 5, 8атетраметил-1 2, 3, 4, 4а, 5, б, 7, 8, 8а-декагидронафталин-1-спиро-2 -(7-карбоксилат-6 -формил-4 -оксид-2, 3 -дигидробенэофурана в виде светло-желтых аморфных кристаллов:

Ыг вЂ” 44,2 (C = 1,25, Н О).

Элементный анализ для С Н 8 О К а

Вычислено, Ъ; С 59,74; Н 6,10.

Найдено, В: С 59,48; Н 5,91.

Уль тра-ф иоле товый спек траль ный анализ: Н О 252. нм (Е = 20500),3 qq

330 нм (E 45900) .

ЯМР-анализ проводят, используя

Д О (ASS) в качестве растворителя.

Условия ЯМР-измерений следующие: спектральная амплитуда 9 100; время развертки 5 мин; фильтр 0,1 c,øèðèна развертки 1 0 млн, дол., PF мощность 0,05 MG; конец развертки

0 млн.дол.

Пример 6. Растворяют в

10 мл этилацетата 418 мг 4,б-диокси8-оксо-2, 3-6, 8-тетрагидрофуровЂ(3, 4-g) -бензофуран-2-спиро-1 -(б, 7 -диокси-2,5,5,8 а-тетраме-

7, 8, 8 а-декагидронафталина) и йри перемешивании прибавляют

0,33 моль б н. водного раствора гид- роокиси натрия. Смесь перемешивают

10 мин в токе азота. Отфильтровывают выпавшие кристаллы, промывают их три раза 10 мл этилацетата и сушат. Получают 390 мг динатриевой соли б, 7диокси-2, 5, 5, 8а-тетраметил-1, 2, 3, 4, 4а, 5; б, 7,,8, 8а, декагидронафталин-1-спиро-2 вЂ (7 -карбоксилат-б -формил-4 -оксид-2, 3 вЂ”

-дигидробензофурана (1Ь„ ) в виде светло-желтых аморфных кристаллов.

Физико-химические свойства полученного соединения аналогичны приведенным в примере 5.

Термин комплемент относится к комплексной группе протеинов в жидкостях тела, которая, работая вместе с антителами и другими фак105б901 торами, играет важную роль как переносчик иммунных, аллергических, иммунохимических и/или иммунопатологических реакций. Реакции, в которых участвует коглплемент, происходят в сыворотке крови или в других жидкостях тела и, следовательно, рассматриваются как гуморальные реакции.

Известны соединения, обладающие антикомплементарной активностью, такие как этилендиаминотетрауксусная 10 кислота (ЭДТУК), Сальдокс, флориэин, оксибензольные производные, гуанидины и феноксиацетамиды, фосфонатные эфиры, хлорофиллин, глицирризин и т.п.. 15

Однако эти соединения являются неудовлетворительными для практических целей, так как являются высокотоксичными или обладают низкой антикомплементарной активностью. В настоящее время не имеется коммерческц доступных антикомплементарных соединений или агентов.

Терапевтические агенты..Полученные сесквитерпеновые производные, общей формулы (r) и их соли явля ются полезными как препараты для лечения нефрита. В этом случае их вводят в фармацевтические рецептуры вместе с обычными фармацевтическими приемлемыми носителями, которыми являются, например, разбавители или экципиенты, такие как наполнители, расширители, связующие, смачивающие агенты, деэинтеграторы, поверхностно-активные агенты и смазки, которые обычно применяют для приготовления лекарств, зависящих от способа введения единичных форм дозы.

Для лечения могут быть выбраны .в соответствии с целью лечения раз- 40 личные формы дозы и способы введения лекарства как средства лечения нефрита, Типичныги формами дозы являются таблетки, пилюли, порошки, . жидкие препараты,суспензии, эмульсии 45 гранулы, капсулы, свечи и препараты,, для инъекции-жидкости, суспензии, эмульсии и т.п.

При формовании фармацевтического состава в виде таблетки, содержащей . сесквитерпеновое производное общей формулы (I) или его соль в качестве активного ингредиента, можно использовать широкий ассортимент известных носителей. Примерами подходящих 55 носителей являются экципиенты (лактоза, сахароза, элористый натрий, раствор глюкозы, мочевина, крахмал, карбонат кальция, каолин, кристаллическая целлюлоза и кремниевая кис- 60 лота), связующие (вода, этанол, про. пансл, простой сироп, глюкоза, крахмальный раствор, раствор желатина, карбоксиметилцеллюлоза, шеллак, метилцеллюлоза, фосфат калия и поли- 65 винилпирролидон), дезинтегрирующие агенты (сухой крахмал, альдегид натрия, агаровый. порошок, порошок ламинарии, кислый карбонат натрия, Твин, лаурилсульфат натрия, моноглицерид стеариновой кислоты, крахмал и лактоза), ингибиторы дезинтегриро-. вания (сахароза, глицериновый эфир стеариновой кислоты, крахмал, масло,какао и гидрированные масла), проматоры абсорбции (четвертичные аммониевые основания и лаурилсульфат натрия), задерживающие увлажнение агенты (глицерин и крахмал), абсорбенты .(крахмал, лактоза, каолин, бентонит и коллоидная кремниевая кислота) и смазки (очищенный. тальк, соли стеариновой кислоты, порошок борной кислоты).

При формовании фармацевтического состава в виде пилюль может быть использован широкий ассортимент известных носителей. Примерами подходящих носителей являются экципиенты (глюкоза, лактоза, крахмал, масло, какао, отвержденные растительные масла, каолин и тальк), связующие (порошок аравийской камеди, порошок трагаканта, желатин и этанол) и дизентегрирующие агенты (ламинария и агар). Пилюли и таблетки могут быть покрыты сахаром, желатином, пленкой, могут быть покрыты двумя или более слоями.

При формовании фармацевтического состава в виде свечей может быть использован широкий ассортимент из- вестных носителей, например, масло, какао, высшие спирты, сложные эфиры высших спиртов, желатин и поусинтетические глицериды.

Когда из фармацевтического состава готовят препарат для инъекций, полученный жидкий раствор или суспензию предпочтительно стерилизуют и бни являются изотоническими по отношению к крови. При формулировании фармацевтического состава в виде раствора, суспензии или эмульсии могут быть использованы любые известные разбавители, например вода, этанол, пропиленгликоль, этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтиленсорбит и сорбитановые сложные эфиры.

В терапевтический He(lpHTQBHA агент могут быть введены хлористый,натрий, глюкоза или глицерин в количестве, достаточном для получения изотонических растворов. Кроме того, терапевтический агент может содержать обычные растворимые вспомогательные вещества,:буферы, болеутолякщие агентц1 и консерванты, в некоторых случаях могут быть введены окрашивающие агенты отдушки, ароматизирукщие вещества, подслащиватели и другие лекарства.

1056901

Количество соединения общей формулы (J) или его фармацевтически приемлемых солей, которое в качестве активного ингредиента может быть введено. в фармацевтический состав, полезный при лечении нефрита, не ограничива5 ется и может меняться в очень широких пределах. Пригодньм терапевтически, эффективным количеством обычно является 1-70% от веса, предпочтительно 5-50% от веса всего состава. 10

Не имеется особых ограничений по способу применения терапевтического агента как агента для лечения нейри- та. Терапевтический агент может быть введен любым способом, пригодным для конкретиой формы терапевтического агента. Например, таблетки, пилюли, жидкие препараты, суспензии, эмульсии, гранулы и капсулы принимаются орально. Препараты для инъекций вво- Щ дят внутривенно одни или вместе с обычными вспомогательными агентами (глюкоза и аминокислоты). Кроме того, если требуется, терапевтический агент может быть введен просто внут- 25 римышечно, внутрикожно, подкожно или внутрибрюшиано.

Дозировка лекарства для лечения нефрита обычно выбирается в соответствии с целью использования, симптомами и т.п.

Дозировка соединения формулы (1)0,5-20 мг/кг веса тела в день, в одной или нескольких дозах.

Соединения .формулы (1) обладают антикомплиментарными активностями и являются полезными также как терапевтические агенты для лечения ауто-иммунных болезней, коллагеновых заболеваний и ревматизма.

Результаты испытаний фармакологических действий соединений общей формулы .(1) и их солей.

Испытуемое соединение (1Ь ) (динатриевая соль} имеет различные заместители:

Каждое из испытуемых соединений, указанных в табл.3, вводили внутрибрюшинно крысам больным нефритом типа

Гейманна (все тела от 300 до 350 r) один раз в день в течение 7 дн., а затем измеряли количество протеинмочевины, мг/день, как опйсано выше.

СР испольэовали для сравнения, а для контроля использовали физиологический раствор. Для каждого испытуемого соединения делали три репли

Лнтйкомплиментарная ак rHBíîñòü. измерена и подтверждена с помощью испытательной методики. В частности, в испытуемую трубку загружали

0,5 мл водной дисперсии каждого из испытуемый соединений, 0,5 мл иммунных частиц (EA) содержащих

1 108 клеток/мл, 1 мл 5-кратно разбавленного раствора Веронального буферного раствора (C V В ), содер. жащего изотонический желатин и

0 5 мл комплементной сыворотки

I р,+Ф (g. р. с. ), разбавленной в 1 50 раз йч ь разбавленной жидкостью. Смесь вы-! держивают нагретой до 37 С в течение

60 мин. Затем прибавляют 5 мл, охлажде нного на льду физиологического солевого раствора. Смесь центрифу- гируют. Измеряют адсорбцию всплывшего слоя отделенного при 0+fr и оп- ределяют продолжительность ингибирования гемолиза иммунных частиц испытуемым соединением. В табл.1, приведена величин активности

50%-ного ингибирования гемолиза g (мл), измеренная указанным методом, Острая токсичность. ВеличиныЮу

:для испытуемых соединений при оральном введении для крыс приведены в табл.1.

Терапевтическое действие на нефрит нефротоксинного типа. Кору почки крысы гомогенизируют в равном количестве физиологического раствора.

Гомогенизированную смесь смешивают с комплексной вспомогательной добавкой фрейнда (продукт компании Дифко) в объемном соотношении 1:1. Инжектируют 2 мл полученной смеси внутримышечно кролику (масса тела 3100 г) для иммунизации. Через 1,5 мес берут кровь из средца кролика и готовят сыворотку. Полученную сыворотку инактивируют при 56 С в течение 30.мин. затем высаливают 40%-ным насыщен-, ным водным раствором сульфата аммония и фракционируют. Собирают фракцию иммуноглобулин-g-глобулина (1gG ), чтобы получить HT.

Подв одят о це нк у, испо ль э уя самцов крыс Вистар весом от 150 до

160 г. Для каждого соединения делают три репликации. Испытуемое соединение вводят внутрибрюшинно, один раз каждые 24 ч в течение 7 дн.

Спустя 1 ч после введения испытуемого- соединения на третий день применяют НТ. НТ инжектируют внутривенно в количестве 1 мл в хвостовую вену каждой крысы. В качестве сравнительного соединения используют хлорофиллин (CP), а для контроля физиологический солевой раствор.

Измеряют общий уровень протеинмочевины в общем количестве мочи, выделенной за 24 ч, турбидиметрическим методом, применяя бычий сывороточный альбумин в качестве контроля в сочетании с сульфосалициловой кислотой. Полученные результаты приведены в табл.2.

1 056901

0,5

1,0

0,2

0,1

0,2

0,3

0,05 . 65 кации. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Уровень протеинмочевины у здоровой крысы составляет от 0,5 до 5 мг/дн.

Когда уровень протеинмочевины превышает этот интервал становится больше

10 мг/дн., можно с уверенностью сказать, что возник нефрит. Как видно из результатов табл.2, нефрит встречается в контрольной группе.

Р других группах количество протеин- 10 ючевины через 10 дн. после введения является по существу таким же, как у здоровой крысы. Следовательно, введение предлагаемых соединений ингибирует первичную и вторичную ре 15 акции.

Когда такой же тест проводили с пред лагаемыми соединения> и было обнаружено,что все они ингибирукт первичную ре. акцию нефрита нефротокси нного типа. 20

Терапевтическое действие на нефрит типа Гейманна. В тесте были использованы самцы крыс Вистер весом от 180 до 200 г. Кора почки крысы была экстрагирована и гомогенизиро- 75 вана с равным количеством по объему физиологического раствора. Гомогенат центрифугируют при 1500G в течение 1 ч. Всплывший верхний слой очищают и смешивают с комплектной вспомогательной добавкой Фрейнда 37 Й .в объемном соотношении 0,4:1. Полученную смесь инжектируют внутрибрюшинно крысам в количестве 0,5 мл на крысу.

После этого такое же количество вспо- З5 могательной добавки вводили каждые

2 нед. до тех пор, пока уровень протеин-мочевины не превысил 100 мг/дн (в течение 6-8 нед).

Через 2-3 нед. после начала испытания вес тела крысы увеличивается 40 до 400-500 г и нормальный уровень протеинмочевины равен 5-15 мг/дн. Как видно из результатов табл.3 предлагаемые соединения могут лечить нефрит типа Гейманна. 45

Этот тест проводили с другими соединениями формулы и также была найдена сушственная активность при лечении нефрита типа Геймана.

Пример 7. В колбу Сакагуши емкостью 500 мл загружают 100 мл культурной среды (состав приведен ниже) и Stack q Ь о t rqssp К-76 культиви. руют при 28 С и рН 6 в течение 4 дн. со встряхиванием. Рецептура культурной среды, %:

Глицерин

Крахмал

Лактоза

Порошкообразные соевые бобы 0,5 60

Лрожд ев о и экстракт

Солодовый экстракт

СаСО

Ng50

В",30-литровый сосУд для ферментации загружают 20 л культурной среды укаэанного состава. Одну колбу результирукщей высеянной культуры культивируют при температуре куль. турной среды 28 С в течение 5 дн. при перемешивании со скоростью

400 об/мин и аэрировании, проводимом со скоростью 1 л на 1 л культурной среды в минуту. Результирукщий культурный бульон центрифугируют со скоростью 8000 об/мин для удаления микробных клеток. В супернатант добавляют 5 л метанола, смесь перемешивают и отстаивают в течение 3 ч.

Смесь центрифугируют и удаляют твердые частицы. Супернатант экстрагируют равным объемом этилацетата.

Растворитель этилацетатного слоя отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в метаноле и .пропускают через колонку с активированным углем. Элюат концентрируют до сухого остатка при пониженном давлении. Сухую массу растворяют в смеси хлороформ вЂ” этилацетат 1:1 (по объему) и подвергают гель-фильтрации через колонку с

Сефадексом ьН-20. Фильтрат подвергают тонкослойной хроматографии (с использованием в качестве несущего растворителя смеси этилацетатхлороформ-уксусная кислота в объемных соотношениях 50:50:2) и собирают фракцию с Ry = 0,34, обладакщую антикомплементарной активностью. В другом варианте фильтрат подвергают тонкослойной хроматографии (с использованием в качестве .несущего растворителя смеси бензол вЂ” бутанолуксусная кислота в объемных соотношениях 60:15:5) и собирают фракцию с Ry = 0,58, обладающую антикомплементарной активностью. Выпариванием растворителя из фракции получают 2,0 г 6,7-диокси-2, 5, 5, 8атетраметил 1, 2, 3, 4, 4а, 5, 6, 7, 8, 8а-декагидронафталин-1-спиро-2 вЂ (6, 7 -диформил-4 -окси-2, 3 -дигидробенэофурана), представлякщего собой бледно-желтое слабокислотное соединение, обладакщее антикомплементарной активностью. Полу чение этого соединения подтверждается следующими физико-химическими свойствами. р вЂ” 48 (С 2,5, метанол) . Элементный анализ для С Н дОв.

Вычислено, %: С 68, 64; Н 7, 51.

Найдено, %: С 68,58; H 7,55.

Анализ ультрафиолетового спектра поглощения (УФ): этанол + 246 нм (E = 16474), h mage 307 нм (= 6659) °

ЯМР-анализ проводили с использованин в качестве растворителя пиридина - dg (2, 2-диметил-2-сила13

1056901 пентан-5-сульфонат натрия) (ДСС) в качестве внешнего стандарта.

Условия измерения ЯМР следующие:

Амплитуда спектра 4 "100

Фильтр, с 0,1

Выход радио5 частоты, ХГц 0,5

Время развертки, мин (яирина развертки, млн дол 10

Конец развертки, млн, дол, 0

Пример 8, В колбу Сакагуши емкостью 500 мл загружают 100 мл культурной среды, имеющей представ- 15 ленную ниже рецептуру, и известный, штамм 5МсЬ Ьо Ьгу э СЬа тра vum

ИфО 5389 культивируют в среде при температуре 28оС в течение 4 дн. при рН б со встряхиванием. Рецептура культурной среды, Ъ:

Глицерин 0,5

Крахмал 1.,0

Лактоза 0,2

Порошок из соевых бобов 0 5

Дрожжевой экстракт О, 1

Солодовый экстракт 0,2

СаСО 0,3

МЯ504 0,05 30

В 30-литровый сосуд для ферментации загружают 20 л культурной среды,, укаэанного состава и две колбы с результирукгей высеянной культурой культивируют. при 28 С в течение 5 дн. с перемешиванием со скоростью

30 об/мин и при аэрировании, проводи MQ со скоростью 1 л на 1 л среды в минуту. Результирукщий культурный бульон центрифугируют со скоростью

8000 об/мин для удаления. микробных 40 клеток.

В супернатант добавляют 5 л метанола, смесь перемешивают и отстаивают в течение 3 ч. Смесь центрифугируют 45 и твердые частицы удаляют. Супернатант экстрагируют равным объемом этилацетата. Растворитель этилацетатного слоя удаляют при пониженном давлении, проводя концентрацию до сухо- . 50 го остатка. Остаток растворяют в метаноле и пропускают через колонку с активированным углем. Элюат кон.центрируют до cyxoro остатка при пониженном давлении, растворяют в смеси хлороформа и этилацетата 1:1 (по объему) и подвергают Гель-фильтрации через колонку с Сефадексом

ЬН-?0. Собирают фракцию активного пика тонко-слойной хроматографии.

Выпариванием растворителя получают 60

2,2 r (6,7-диокси-2,5,5,8а-тетраметил-1,2 3,4,4а,5, 6,7,8,8а-дакагидронафталин-1-спиро-2-(6,, 7 -дифор.вЂ”, 4 -oxen 2 3 дигидробензофуран представляющйй собой бледно-желтое 5

0,5

0,1

0,2

0,3

0,05

Так получают б, 7-диокси-

-2, 5, 5, 8а-тетраметил-1, 2-3,4,4а, 5, б, 7, 8, 8а-декагидронафталин-1-спиро-2 -(6, 7 -диформил-4 .-окси2 З-дигидробензофуран), представляющий собой бледно-желтое слабокислое соединение, обладающее антикомплементарной активностью. Физикохимические свойства данного соединения соответствуют свойствам сое динения, полученного в примере 1.

Пример ll. 500 мл динатриевой соли соединения (Ib g и 250 мл глюкозы растворяют в дистиллированной воде для инъекций до общего количества 5 мл. Раствор выливают в ампулу емкостью 5 мл. Ампулу продувают азотом и нагревают в теслабокислотное соединение, обладающее антикомплементарной активностью.

Это соединение имеет физико-химические свойства аналогичны соединению в примере 1.

Пример 9.5taehgbotrqssp,Т.789 культивируют и очищают по примеру 7, за исключением того, что используется приведенная ниже культурная среда., рН которой 7,5, и температура культивирования поддерживается равной

32оС.

Состав культурной среды, Ъ:

Глицерин 0,5

Глюкоза 1,2, Настойка пшеницы 0,5

Сухие дрожжи 0,1

Солодовый экстракт 0,2

Мдв04

0 05

КаСР 0,3

Так получают б, 7-диокс и- 2, 5, 5, 8авЂ” тетраметил- l, 2, 3, 4, 4а, 5, б, 7, 8, 8а-декагидронафталин-1-спиро-2 (б,7 -диформил-4 -окси-2,3 -дигидробензофуран), представ лякщий собой светло-желтое слабокислотное соедине ние, имеющее антикомплементарную активность. Физико-химические свойства данного соединения соответствуют свойствам соединения, полученного в примере 7, Пример 10.б асИЧЪоЬ gs

T-791 культивируют и очищают по примеру 7, за исключением того, что культурная среда имеет указанный ниже состав и ее рН доводят до 5,5, температура среды поддерживается равной 25 С.

Состав культурной среды, Ъ:

Глицерин 0,5

Крахмал 1,0

Сахароза 0,2

Порошок из соевых бобов

Иептон

Солодовый экстракт

Hg50g

НСЕ

1056901

Табли.ца1

Величина антикомплементарной Величина LD

Испытуемое соединение

500

1в

С g«>h ee,n чение 15 мин при 121 С для стерилизации раствора, чтобы получить препарат для инъекции..

Пример 12. Используют

500 мг соединения (Ib) 5 мг сульфита натрия и дистиллированную водуq для инъекций до общего количества

5 мл. Препарат для инъкции готовят о методике примера 7.

Пример 13. Используют

500.мг соединения (1Ь), 5 мг сульфита натрия и дистиллированную воду для инъекций до общего количества

5 мл. Готовят препарат для инъекции по методике примера 1.

Пример 14. Используют 750 Mr)5 соединения (1Ь) и полусинтетическое глицеридное основание до общего количества 2000 мг.

Прибавляют соединение (Ib) к цолусинтетическому глицерцдному основанию20 смешивают и суспендируют при 5(PC..

Смесь помещают в форму и дают ей са-мопроизвольно остыть. Продукт удаляют и, таким образом, получают свечу.

Пример 15. Используют

750 мг соединения, полученного в примере 1, 90 мг витамина E и полусинтетическое глицеридное основание до общего количества 2000 мг, Свечуготовят по методике примера 10.

Пример 16. 150 мг соединения (Lb) 40 г Авиула, (торговое наименование продукта фирмы Асахи Касей)

Кабушихи Кайша),. 30 r кукурузного крахмала и 2 r стеарата магния смешивают и измельчают, а затем

35 таблетируют с помощью pounder è покрывают сахаром (R 10 мм), Полу"ченные таблетки покрывают пленкой покрывающего агента, состоящего из.

10 r TC-5 (торговое наименование 40 оксипропилметилцелл этозы 3 г полиэтиленгликоля 6000 продукт фирмы бhinetsu Chem !nd),40 г касторового .масла и 40 r метанола для производства таблеток, покрытых пленкой. 45

Пример 17. 100 r соединения (1Ъ), 40 г Авиуала, 30 г кукурузного

,крахмала и 2 г стеарата магния сме шивают,измельчают, таблетируют с помо« щью pounder и покрывают сахаром (410 км).

Полученные таблетки покрывают пленкой из пленкообразующего агента, состоя,щего из 5,7 г сополимераметилакрилата метакриловой кислоты, 0,6 г триаце- тина и 50,4 г этонола, для образования кишечных покрытых таблеток.

Пример 18. 150 г соединения (16) 1 r лимонной кислоты, 33,5 г лактозы, 70 г дикальцийфосфата, 30 г Плон 1=68- Плуроник Г-68 и 15 r лаурилсульфата натрия смешивают.

Смесь просеивают через сито 9 60 и подвергают влажному гранулированию со спиртовым раствором, состоящим из 15 г поливинилпирролидона, 4,5 r

Карбовакса 1500 (полиэтиленгликоль) и 45 r Карбовакса 6000 (полиэтиленгликоль). В некоторых случаях прибавляют этанол (подходящее количестВо) для превращения порошка.в пастообраэную массу. Прибавляют 30 г кукурузного крахмала и продолжают смешивание до тех пор, пока не образуются однородные частицы. Частицы пропускают через сито Р 10, помещенное в желоб, сушат в печи при 100оC гв течение 12-14 ч, Высушенные частицы= просеивают через сито Р 16 и смешивают с 3 r сухого лаурилсульфата натрия и 3 r сухого стеарата магния.

Смесь прессуют в желаемую форму на таблетной машине.

Полученные таким образом сердце= винки обрабатывают лаком и обсыпают тальком, чтобы предохранить от поглощения влаги. Сердцевинки покрывают первым слоем, а затем лаком требующееся количество раз, для перорального введения. Чтобы полностью закруглить и сгладить таблетки снова наносят первый и сглаживающий слой, а окрашивающее покрытие наносят до тех пор, пока не получают желаемый цвет. После сушки покрытие таблетки полируют для придания таблеткам равномерного блеска.

1056901

Таблица г

Соедине-, Доза, ние .. мр крысу.

Количество протеинмочевины, мг/день

Номер репликации

1 дн. 4 дн. 7 дн. 10 дн.

Соединение (Щ

0,7

1,8

1 2,7

2 4,1

3 2,3