Способ получения гамма-глобулина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАММАГЛОБУЛИНА путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта с сохранением степени специфической активности, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0,5-1,5%, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0,2-0,6%, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5-10%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1119697 А зш А 61 К 39/395

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ/

К А ВТОРСКОМУ СВИД=ТЕЛЬСТВУ

I (/ (21) 3446749/28-13 (22) 28.05.82 (46) 23.10.84. Бюл. № 39 (72) Ж. А. Шажко, В. А. Мищенко, Н. А. Улупов, В. В. Михалишин, Н. Н. Шуть

А . Б. Смирнов и Н. А. Яременко (71) Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт (53) 612.11.12 (088.8) (56) 1. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. Под ред. П. Н. Бурга-. сова. M., сМедицина», 1978, 315 — 321.

2. Шажко Ж. А. и др. Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии. Владимир.

1977, с. 152 — 154 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАММАГЛОБУЛИНА путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта с сохранением степени специфической активности, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0,5 — 1,5%, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0,2 — 0,6%, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5 — 10%.

1119697

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в клинической и диагностической работе, а также при изготовлении антительных препаратов для иммунохимических реакций и пассивной иммунизации.

Чистота препаратов антител, получаемых при использовании этого метода, зависит от того, сколь большая часть гамма-глобу.линов приходится на долю выделяемых антител, а также от степени предварительного tO удаления балластных веществ, главным образом липопр1ттеинов.

Известен способ получения гамма-глобулина путем его фракционирования по методине Кона спиртовым осаждением на холоде (11.

Использование спиртового метода Кона получения гамма-глобулина ограничено трудоемкостью, длительйостью процедуры, необходимостью большого количества холодильного оборудования. К тому же пре- 20 параты, полученные из молока и молозива, содержат кроме гамма-глобулина альбумин, сС. и р -глобулины и молочные сахара..

Известен также способ получения гаммаглобулина, включающий очистку сыворотки от балластных белков путем ее о4работки охлажденным хлороформом в их изоэлектрической точке при рН 5,0 — 5,6 с последующим концентрированием препарата известным образом, например путем обработки Зо жидкости сульфатом аммония 40 — 500/о-ного насыщения, сульфатом натрия в 18О/о-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленглнколем М.В. 6000 †100 дальтон в 8 в 10О/о-ной конечной концентрации (2).

Однако известные способы не обеспечи- З5 вают высокой степени очистки целевого продукта с сохранением необходимой степени специфической активности. Длительный и сложный технологический процесс включает открытые стадии и стадии, оказыва- 4р ющие денатурирующие воздействия на сывороточные белки, что является одной из причин снижения активности сывороток на 20 — 30о/оЦель изобретения — повышение степени очистки гамма-глобулина с сохранением 45 высокой специфической активности.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения гамма-глобу- лина путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0,5—

1,5 /о, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0,2 — 0,6 /р, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5 — 10 /о.

Учитывая сложный состав таких биологических жидкостей, как сыворотка крови, молоко, молозиво, желчь, феномен селективного выделения гамма-глобулина обработкой полиэтиленимином, хлороформом и полиакриловой кислотой можно объяснить следующим образом:. с помощью полиэтиленимина удаляются из биологической жидкости альбумин и основная часть мелкомолекулярных белков (преальбумин, трансферин, постальбумин и др.), полиэтиленимин флоккулирует в этом случае белки с малым суммарным зарядом; хлороформ денатурирует крупномолекулярные структурные компоненты, но с малым суммарным зарядом, в том числе липопротеины, глюкопротеины и в последующем переводит их в нерастворимое состояние; при обработке полиакриловой кислотой осаждаются альфа-2-макроглобулины и бета-глобулины, а также образовавшиеся на вышеуказанных этапах агрегаты денатурированного белка и остатки полиэтиленимина.

Селективное выделение гамма-глобулина возможно только вышеуказанной nooseредной обработкой. Изменение очередности обработки не дает подобного эффекта, так как присутствие в биологической жидкости мелкомолекулярных белков снижает эффективность удаления крупномолекулярных компонентов — липопротеинов, глюкопротеинов и др. После этой обработки в биологической жидкости, в основном, находятся крупномолекулярные белки, из которых в дальнейшем с помощью полиакриловой кислоты удается получить гамма-глобулин.

Пример 1. К 100 мл сыворотки крови крупного рогатого скота добавляют равное количество дистиллированной воды, а затем по каплям добавляют 10 мл 10О/q-ного водного раствора полиэтиленимина, создав таким образом его 0,5 /р-ную конечную концентрацию в смеси. Смесь перемешивают до образования флоккул в течение 5 — 10 мин

После образования флоккул в жидкость добавляют 10 мл хлороформа, что составляет 5О/р его конечной концентрации в растворе, и ее энергично гемогенизируют в течение 5 — 10 мин. После центрифугирования в течение 20 мин при 3000 об./мин в надосадочную жидкость добавляют 10 мл 4О/q-ной полиакриловой кислоты, что составляет

0,2 /р ее конечной концентрации в растворе.

Затем проводят центрифугирование при

3000 об./мин 20 мин. Для дальнейшего применения используют надосадочную жидкость. При необходимости получения препарата с более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным образом, например путем обработки жидкости сульфатом аммония 40 — 50О/р-ного насыщения, сульфатом натрия в !8 /р-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8—

10О/о-ной конечной концентрации. Полученный осадок ресуспендируют в заданном

1119697

3 объеме и используют для дальнейших исследований.

Пример 2. К 100 мл молока крупного рогатого скота (рН 7,0 — 7,5) добавляют

10 м 10 /О-ного водного раствора полиэтилнимина, создав таким образом его 1 /p-ную конечную концентрацию. Смесь перемешивают 5 — 10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют 5 мл хлороформа, что составлят 5 его конечной концентрации, и ее энергично гемогенизируют в течение 10

5 — 10 мин. После центрифугирования в течение 20 мин при 3000 об./мин в надосадочную жидкость добавляют 10 мл 4 /о-ной полиакриловой кислоты, что составляет 0,4О/О ее конечной концентрации. Затем сыворотку центрифугируют, а для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость, При необходимости получения препарата с более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным . образом, например путем об- щ работки жидкости сульфатом аммония 40—

- 50О/О-ного насыщения, сульфатом натрия в

18О/p-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8 — 10О/о-ной конечной концентрации. Полученный осадок суспендируют в заданном объеме и используют для дальнейших исследований.

Пример 3. К 100 мл молозива свиней (рН 7,0 — 7,6) добавляют 10.мл 10О/р-ного водного раствора полиэтиленимина, создав таким образом его 1 /О-ную конечную кон- 30 центрацию в растворе. Смесь перемешивают 5 — 10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют 10 мл хлороформа, что составляет 10 /о его конечной концентрации, и энергично гемогенизируют в течение 5 — 10 мин, а затем центрифугируют З5 при 3000 об./мин 20 мин. В надосадочную жидкость добавляют 10 мл 4О/p-ной полиакриловой кислоты, что составляет 0,4% ее конечной концентрации, и центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин. Последующее 40 концентрирование с помощью средств, указанных в примерах 1 и 2, не всегда целесообразно в связи с высоким содержанием антител в молозиве.

Пример 4. К 100 мл желчи свиней (рН

7,0 — 7,6) добавляют 15 мл 10О/о-ного водного раствора полиэтиленимина, что составляет 1,5 /О его конечной концентрации. Жидкость перемешивают 5 — 10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют

10 мл хлороформа, что составляет 10О/О его конечной концентрации, и ее энергично гомогенизируют 5 — 10 мин, а затем центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин. В надосадочную жидкость добавляют 15 мл 4%-ной полиакриловой кислоты, что составляет

О,бо/о ее конечной концентрации в растворе, и центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин

При необходимости получения препарата с

4 более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным образом, например путем обработки жидкости сульфатом аммония 40—

50О/р-ного насыщения, сульфатом натрия в

18О/О-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8 — 10 /р-ной конечной концентрации. Полученный осадок ресуспендируют в заданном объеме и используют для дальнейших исследований.

Результаты опытов по выделению гаммаглобулиновой фракции из молока и молозива представлены в табл. 1.

Данные табл, 1 свидетельствуют об универсальности способа получения гамма-глобулинов. Так при получении гамма-глобулинов из молозива, содержание белка уменьшилось в 7 раз, потери активности не было отмечено. На примере с молоком была отмечена небольшая потеря специфической активности в реакции нейтрализации, но не в РРИД.

В табл. 2 представлены результаты опытов по получению гамма-глобулинов с использованием известного (контрольного) и предлагаемого способов.

Из табл. 2 видно, что предлагаемый способ по сравнению с известным позволяетполучать гамма-глобулины со значительно большей удельной серологической активностью (1,33 — 7,54 раз). Эта закономерность подтверждена и с сыворотками других видов животных (табл. 3). Кроме того, необходимо отметить, что это подтверждено на примере вируснейтрализующих и преципити рующ их антител.

Из табл. 4 видно, что при обработке сыворотки по предлагаемому способу происходит селективное выделение гамма-глобулина.

Предлагаемый способ биологической жидкости дает возможность, в отличие от " ранее используемых способов, получить высококонцентрированный препарат с заданной активностью. Из проведенных опы- . тов выяснилось, что предлагаемый способ получения гамма-глобулина универсален; так как дает возможность получать гаммаглобулин не только из различных биологических жидкостей, но и из биологических жидкостей различных видов животных.

Преимущество предлагаемого способа заключается также в том, что получаемый антительный препарат имеет значительно большую удельную серологическую активность, чем полученный по известному способу, и имеет возможность регулирования активности в зависимости от степени концентрирования. Предлагаемый способ прост, воспроизводим, технологичен, легко выполнимый в аппаратном оформлении. Высокая удельная серологическая активность

19697

Таблица 1

Источник гамма2,9 0,5 1,5 1,17 3,35 3,35

12,5 1,8 ) 6,5 ; 6,5 ) 7,65 > 8,0

Молоко коровы

Молозиво свиньи

Таблица 2

Исходный препарат

Веиество для концентрирования

Ганна-глобулин

Характеристика сыворотки

Пень отбора

Внд кивотного

Белок, Х Индекс нейтря- Удельная се- Белок 2 Индекс нейт- Удельная селиэацин 1й рологнческая ралнэанин рологнческая

Hagio ) активность (19 HB4, ) активность

7 5

2,27

2,5

Иа,БО (ИИ ) 80

1,9

Очиненная

3,31

Сня

ll5,8

2,27

7,5

2,5

4,0 ч

2,27

ПЭГ

7,5

2 5

4,2

Контрольная (Ин ) 80 (ИИ ) 50

И,эх SO, 2,27

7,5

2,5

12,8

7,2

КРС

Очиненная

3,5

2,4

43,3

7,2

3,5

43,3

2,0

3,5

ПЭГ

7,2

43,3

4,8 (Ин ) 90

7,2

3,5

Контрольная

9,8

43,3

11

S в значительной степени исключает возможные при использовании обычной технологии перекрестные реакции, что особенно важно при диагностике инфекционных заболеваний.

Использование антительных препаратов, полученных предложенным способом, даст возможность получения высокоактивных и специфических диагностикумов (в т. ч. конъюгированных ферментами, флюоресци нами, изотопами, эритроцитами, стафилококками) при незначительных потерях дорогостоящих маркеров и других реактивов, используемых при конъюгации.

3,67 117,5

4,17 658,7

4,0 85,9

4,0 416,6

3,67 235

4>5 352,1

4,0 102,0

1119697

Таблица 3

Исходная сыворотка

Очищенная сыворотка

Вид сыворотки

Белок, Х

Белок, X

Удельная серологическая ак

Активность, РРИЛ (лог 2) Активног

РРИП (ло

Белок, 2

Удельная серологическая ак човиость тивиость тивность

8,0

Гнпернммуяная сыворотка 6,3 5,75 0,85 1,3 5 ° 55 3,6 1,37

6,75 морской свинки

Реконвалесцентные сыворотки свиней

l,5

6,9

8,0

Реконвапесцентные сы3,1

6,75

6,4 воротки КРС

Гипериммунные сыворотки

I кроликов

7,34 5 35 0 54 0 8 4 90 3,7 2.9

4,1

6,9

Таблица 4 улин

J -глобулин

40,0

13,0

30,0

КРС норма 7,5

17,0

0,75

7,0

14,8

85,2

Опыт

47,0

17,0

18,0

20,0

96,5

1,5

3,5

54,6

1,4 свинка опыт 6,5

4,8

13,7

80,4

Составитель Е. Колчина те11ред и. Верес Корректор В. Синицкая

Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 1 3035, Москва, )К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП <Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор А. Шишкина

Заказ 7505/5

Активность, РРИЛ лог.

6,8 6,35 1,18 1,0 5,9 3,7

7,9 5,90 0,85 0,15 5,35 5 3! амча-глобупнн, полученный по прелчагэемому способу

Свинья норма 7,5 опыт 6,5

Морская норма 6,2

Гамма-глобулии, полученный по предлагаемсму способу