Способ получения натриевых солей производных мурамилпептидов

 

Изобретение касается производных пептидов,, в частности натриевых солей производных мурамилпептидов общей формулы (I) «tOH ко оЛ-он .- Z, tni-c(0)-Si 5 -чНfCOlNHi X(0 -NH-CttR.,-t(01N -CH-Cff2-CHi-CO-« где R,- С,-С,,-алкил; R,- С,-С4-алкил; А У-О-Р(О)(ONa)-0-CH2-chr4-CH2 -Rj , где У -O-CHj-С (0)-Ш-(СН2)2-, -Ш-(СН2)2-, -NH- -СН(СНз) С(0)-Ш-(СН272-; R4-H, -0- -С(0)-(СН;),4-СНз; Rj- -0-C(0)-(CHj),- -CHj, которые проявляют иммуностимулирующую активность и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности среди производных пептидов были получены новые соединения (I). Их синтез ведут конденсацией соединения формулы (I), где вместо А имеется группа К - ОН или -0-СН2-С(0)ОН, или -Ж-СН(СНз)- С(0)ОН, сначала с N-оксисукцинимидом или N-оксифталимидом в присутствии дициклогексилкарбодиимида в инертном растворителе, а затем с соединением общей (II) Н-Х- -О-Р(О)(ОН)-OCHj-chr -СИг-Rf, где X -Ш(СН,)2-при К - ОН или X - (CHJ)2- пpи К - -Ш-СН(СНз)-С(0)- -Ш-(СН2)2-, -ОСН2-С(0)-ОН; R и R имеют указанные значения с последующим переводом полученного соединения в натриевую соль. Испытания (I) показывают, что они малотоксичны и более активны, чем известный N-бензолил-мурамил-Ъ-аланил-В-изоглютамин. 1 табл. а ю СО v| сл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ социллистических

РЕСПУБЛИК

Î9) (11) А3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и AA"II EHITY с аан на "oí

:в -сю1-ь

q(owe ego}-ìí-сан -йа1мн-сн-сн;-сн,-сол

ГОсудАРстВенный НОмитет сссР пО делАм изОВРетекий и ОткРытий (21) 2954161/23-04 (22) 24.07,80 (31) 6893/79 (32) 25.07.79 (33) СН (46) 15.12.86. Бюл. Р 46 (71) Циба-Гейги АГ (CH) (72) Лайос Тарчай, Герхард Башанг, Альберт Хартманн (DE) и Ярослав Станек (CS) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Патент СССР F 660589, кл. С 07 С 103/52, 30 ° 04 ° 79. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАТРИЕВЫХ СОЛЕИ ПРОИЗВОДНЫХ МУРАМИЛПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается производных пептидов, в частности натриевых солей производных мурамилпептидов общей формулы (I) где R, — С1-С -алкил; Н =Н, СН,;

R>- С>-Са-алкил; А — -У-0-Р(0)(ONa)— (504 С 07 К 9 00 А 61 К 37/02

-О-СН -CHR -СН -R где У -О-СН

2 Ф 2 5 я

-С(о)- Н-(СН ),—, -МН-(СН ) —, -ИН-СН(CH,) C(O)-МН-(CH,),—; R -й, -0С (О) — (СН ) CHo; R> — -0 С(О) — (СН )1

-СН,, которые проявляют иммуностимулирующую активность и могут быть использованы в биологии и медицине.

Для выявления активности среди производных пептидов были получены новые соединения (Т). Их синтез ведут конденсацией соединения формулы (I), где вместо А имеется группа К вЂ” ОН или -О-СН,-С(О)ОН, или -NH-СН(СНа)—

-С(О)ОН, сначала с N-оксисукцинимидом или N-oêñèôòàëèìèäoì в присутствии дициклогексилкарбодиимида в инертном растворителе, а затем с соединением общей формулы (II) H-Х-О-P(0)(ОН) -ОСН, -CHR -СН, -R, где

Х вЂ” ИН(СН ) при К ОН или Х

NH(CH ) при К NH СН(СН ) С(О)

-ИН-(СН ) —, -ОСН2-С(О)-ОН; Р и R имеют указанные значения с последующим переводом полученного соединения в натриевую соль. Испытания (?) показывают, что они малотоксичны и более активны, чем известный N-бензолил-мурамил-L-аланил-D-изоглютамин.

1 табл.! 12?

Изобретение относится к способу . получения новых биологически активных соединений, а именно натриевых солей производных мурамилпептидовобщей формулы н-сов, R2,-CH R СОИН

Х

Со н-сн-соин-сн-сн2сн,сод (L j ф) где R,-- C, — С -алкил;

R - водород; СН

Е -С вЂ” С -алкил (Ф У

-NH-СН(СН ) -CONHCH СН, R водород (Т.) 0

Н вЂ” 0- С-(СН, у,-сН,;

7905 г эфира. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и растворяют в 5 мл диметилацетамида. Полученный раствор прибавляют по каплям к раствору 0,692 г (1,0 ммоль) 2-(1 !

2 — дипальмитоил-sn-глицеро-3 -фосфоСН20Н рил)-этиламина и 3,5 ммоль N-этилО морфолина в 25 мл смеси хлороформ—

0 ОН метанол — вода (65:25;4). Реакционо

НО 10 ную смесь перемешивают 8 ч при 25 С, N добавляют 130 мл воды и упаривают в вакууме. Оставшийся водный раствор фильтруют через тефлоновый фильтр типа Millipore-Felter (5 мкм). Фильтрат подвергают диализу в .ультрафильтрационной ячейке через мембрану Amicon 7И 10 последовательно против

400 мл воды, 200 мл 0,1 М водного раствора фосфата натрия и 850 мл во20 ды. Внутренний диализат фильтруют через фильтр Millipore (0,45 мкм) .

Фильтрат подвергают сублимационной

И

A — — Y — 0 — Р-ОСН СН-СН -Я сушке. В итоге получают 1,2 г (917)

1 i соединения I, (о ), = +13,9 (С 1; 107

ONG Ц 2 АсОН); (ecJ = -9 (С 0,882; вода) .

Найдено., 7.: С 53,89; Н 8,63; где У вЂ” -ОСН, -СОИН-СН, СН, вЂ, -NHCH,ÑH, â€, N 6,40; Р 2,22; Na 1,58.

Вычислено, 7: С 53,59; Н 8,75;

N ; Р 2,36; Na 1,75..

ИК-спектр: 3400, 2920, 2850, 1740, 1660., 1545, 1465, 1455, 1380, 1240, 1165, 1100, 1065, 960, 720 см

О

И

Б5- -0- С-(СН ) у,— СН

35 которые могут найти применение в экс- 4 периментальной биологии и медицине °

Цель изобретения — получение новых производных мурамилпептидов, обладающих более высокой иммуностимулирующей активностью в сочетании с низ- 4> кой токсичностыа.

Пример 1. Натриевая соль

N-ацетил-мурамил — L-аланил-D-изоглута( минил-L-алании-2 — (1 2 -дипальмитоЭ

HJI sII rJIHIIepo-3 -фосфорил) -9THJIBMH да (I) .

К раствору О, 84 г (1, 5 ммоль)

N-ацетил-мурамил-L-аланил-17-изоглутаминил-1.-аланина и 0,26 r (2,25 ммоль)

N-оксисукцинимида в 30 мл смеси диметилацетамид — хлороформ (2; 1) при перемешив анин доб авляют О, 46 г (2, 25 ммоль) дициклогексилкарбодиимида.Реакционную смесь перемешивают 5 ч,добавляют 165 мл

Пример 2. Натриевая соль

N-ацетил — мурамил-I.-аланил-D-изог( лутамин-2-(1,2 -дипальмитоил-зп( — глицеро — 3 -фосфорил) — этиламида (II ) .

Из 2,0 ммоль N-ацетил-мурамил-1.—

-аланил-17-изоглутамина и 1,4 ммоль

1 (2-(1,2 -дипальмитоил-sII-глицеро-3

-фосфорил)-этиламина аналогично примеру 1 получают 1.,52 г (887) соединения II, Е 0,31 (хлороформ — метанол — вода 65 25:4) (А) и 0,64 (хлороформ — метанол — уксусная кислота — вода 25:15:4:2) (Б).

Найдено, 7.: С 54,63; Н 8,25;

N 5,78; Р 2,40; Ne 1,59;

Вычислено,, 7: С 54,49; Н 8,35;

N 5,68; Р 2,51; Иа 1,86.

Пример 3. Натриевая соль

N-ацетил-дезметил((урамил-I. — àëàíèë-D-! (-Э-изоглутамин-2- (1, 2 -дипальмито1 ил-sII-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида (1Ш.

Из 1,5 ммоль И-ацетил-дезметилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина и

1277

45

Пример 9. Натриевая соль

N-ацетил-мурамил-L-о(;аминобутирид-Dt

-D-изоглутамийил-L-аланил-2-(1 2 (У

-дипальмитоил-sn-глицеро-3 -фосфорил)-этилмида (IX), 55

1,0 ммоль 2-(1,2 -дипальмитоил-sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламина аналогично примеру 1 получают 1,18 г (96 ) соединения III, Ry 0,29 (A), 0,65 (Б); (et) = + 1,0 (С 0,492; метиленхлорид — этанол 1:1).

Найдено, %: С 53,67; Н 8,16;

N 5,93; P 2,40; Na 1,71;

Вычислено, : С 53,88; Н 8,25;

N 5 71; P 2 53; Na 1,88.

II p и м е р 4, Натриевая соль

N-ацетил-мурамил — L-аланил-0-изоглуI таминил-1-окси-метилкарбонил-2-(1

I н

2 -дипальмитоил-sn-глицеро-3 -фосфо- 15 рил)-этиламида (IV) .

Из 1,5 ммоль N-ацетил-мурамил-L-аланил-Л-изоглутамин- -карбоксиме/ тилового эфира и 1,0 ммоль 2-(1,2

-дипальмитоил-sn-глицеро-3 -фосфо- 20 рил)-этиламина аналогично примеру 1 .получают 1,20 r (92 ) соединения IV, Ry 0,28 (А), 0,68 (Б);(ag = +15 (С

0 553 метиленхлорид — этанол i:1).

Найдено, : С 53,21; H 8,09;

N 5,18; P 2,38; Na 1,76;

Вычислено, .: С 53,40; Н 8,13;

N 5,37; .Р 2,38; Na 1,76.

ИК-спектр: 3400, 2920, 2855, 1745, 30

1665, 1S50 1470, 1380, 1240, 1170, 1100, 1065 720 см

Пример 5. Натриевая соль

N-ацетил-дезметилмурамил — Е-аланил-DI

-изоглутамин-2- (3 -пальмитоил-рац- 35

-глицеро-1 -фосфорил)-этиламида (V).

Из 1,5 ммоль N-ацетил-дезметилмурамил-Ь-аланил-Л-иэоглутамина и (1, О ммоль 2-(3 — пальмитоил-рац-глицеро-1 -фосфорил)-этиламина аналогич-40 но примеру i получают 0,69 г (69 ) соединения V, R 0,47 (А);(о о

=-1,0 (С 0,469; метиленхлорид — этанол 1:1) .

Найдено, : С 47,22; Н -7,17;

N 7,31; P 3,01; Na 2,14;

Вычислено, %: С 47,08; Н 7,24;

И 7,04; P 3,12; Na 2,31.

П р е р 6. Натриевая соль

N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-изоглютаминил-1.-аланил-2-(3 -пальмитоилI

-рац-глицеро-1 -фосфорил) -этиламида (VI) .

Из 1,5 ммоль N — ацетил-мурамил-I,—

-аланил-D èçîãë òàìèíèë-L-аланила и

1,0 ммоль 2-(3 -пальмитоил-рац-гли-! церо-1 -фосфорил)-этиламина аналогич905 4 но примеру 1 получают 0,862 г (80 ) соединения VIô P Оф22 (A);(<)р=+10фО (С 0,404; метиленхлорид — этанол

1:1) .

Найдено, %: C 47,71; Н 7,81;

N 7,55; P 2,71; Na 2,01;

Вйчислено, : С 47,92; Н 7,24;

N 7,80; P 2,88; Na 2, 14.

ИК-спектр: 3400, 2925, 2855, t730

1660, 1545, 1455, 1380, 1230, 1170, 1060, 960, 720 см

Пример 7. Натриевая соль

N-ацетил-дезметилмурамил-Ь-аланио-D-Э-изоглутаминил-Ь-аланил2-(1,2 -дипальмитоил-sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида (VIE).

Из 1,5 ммоль N-ацетил-дезметилмурамил-Е-аланил-D-изоглутаминил-L-алар I нина и 1,0 ммоль 2-(1,2 -дипальмитоил-sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламина аналогично примеру 1 получают 1,065 г (82 ) соединения VII, Ry 0,39 (А);

fg) = -2,0 (С 0,542; метиленхлорид— этанол 1: 1) .

Найдено, : С 53,69 Н 8,02;

N 6,38; P 2,24; Na 1,60;

Вычислено, : С 53,47; Н 8,14;

N 6,4S; P 2,38; Na 1,77.

Пример 8. Натриевая соль

N — àöåòèë-дезметилмурамил-L-аланил-6(-D-изоглутаминил-L-аланил-2-(3 -пальмитоил-рац-глицеро-1 -фосфорил)-этилI амида (VIII).

Из 1,5 ммоль N-ацетил-дезметилмурамил-Е-аланил-D-изоглутаминил-L-алаf нина и 1 О ммоль 2-(3 -пальмитоилУ

-рац-глицеро-1 -фосфорил) -этиламина аналогично примеру 1 получают 0,755 г (71 ) соединения VIII, Rg 0,16 (А), (s) в =-7, О (С 0,518; метиленхлорид— этанол 1: 1) .

Найдено, %: С 47,48; Н 7,09;

N 7,80; P 2,71; Na 2,01;

Вычислено, %: С 47,66; Н 7,19;

N 7,94; P 2,93; Na 2,17 °

Из 1,5 ммоль N-ацетил-мурамил-L-c4-аминобутирил-D-изоглутаминил-L-аланина аналогично примеру 1 полу12779 чают 1,198 r (89i!) соединения 1Х, R< 0,32 (А);(Ы), = +9,0 (С 0,415; метйленхлорид — этанол 1:1)., Найдено, X: С 53,74," Н 8,23;

N 6,04; Р 2,18; Na 1,54; 5

Вычислено, Ж: С 53,56; П 8,,18;

N 6,25; P 2,31; Na 1,71.

Пример 10. Натриевая соль

N-пропионил-нормурамил-L-аланил — П: — 10

-D-изоглутаминил-1. -алании-?(1,2 -ди-! ° пальмитоил-sI1 ãëèöåðî-3 -фосфорил)—

-э тиламида (Х) .

Из 1,5 ммоль N-пропианил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-I. †àëàнина, 2,25 ммоль И-оксифталимида, 2,25 ммоль дициклогексилкарбодиимида ! и 1,0 ммоль 2-(1,2 -дипальмитоил-sn— !

-sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламина аналогично примеру 1 получают 1, 15 г 20 (87Х) соединения Х, R> 0,16 (Л);

Ц =+5,0 0,547; уксусная кислота .

Найдено, 7: С 53,51; Н 8,26;

N 6,14; P 2,15; Na 1,55;

Вычислено, 7.: С 53,53; Н 8,,17;

N 6,35; Р 2,34; Na 1,74.

Иммуностимулирующая активность соединений I-X была изучена в опытах 30 п ч vo по способности увеличивать образование антител у мышей. Исследование проводили в сравнении с известным иммуностимулятором — N-бензоил — мурамил-L-аланил-D-иэоглютамн- 35 ном, который является структурным аналогом описываемых соединений.

Мышей иммунизировали путем внутрибрюшинного введения 10 мг БСА, Че-рез 9, 15 и 29 дней отобрали пробы 40 сыворотки крови и исследовали их на содержание антител к БСА с помощью метода пассивной гемагглютинации. В используемой дозе БСЛ для животных-. реципиентов является субиммуноген- 45 ным, т.е. после его введения антитела не образуются или образуются в очень небольшом количестве. Пт!и введенни мышам иммуностимулирующих веществ до или после введения антигена 50 титр антител в сыворотке повышается.

Иммуностимулирующий эффект выражается суммой 1ор, разностей титров за все три дня отбора проб, Соединения

I-X- u N-бензоил-мурамил-1.-аланил- 55

-D-изоглютамин (XI) вводили внутри-. брюшино в течение 5 дней после введения БСА. Были определены дозы, для которых сумма разностей титров на

05 6

"8 f rt 28-й день составляет 10.Острая токсичность соединений Е-Х была изучена на мышах. Полученные результаты представлены в таблице, Как видно из таблицы, соединения

Х-Х обладают высокой иммуностимулирующей активностью в сочетании с низкой токсичностью и по активности значительно превосходят известный структурный аналог — N-бензолил-мурамил-L -аланил-D-иэоглютамин.

Доза. мг/кг; ЛЛ .. мг/кг

Соединение

2260

0,1

?440

3С50 (IV

2150

2110

VII

2960

?780

5,0 тХ

0 д у

2310

2,", 3020

140,0

Х.L формулаизобретення

Способ получения натриевых солей производных мурамил-пептидов оощей формулы где R — С -С -алкил у водород у С1

R „-- С -С -алкил

Ф 9

ОН

Н0 н.— cQB

8 -CH 8 СО Н, 2

CONH-СН СОЫН CH-СН2СН7СОЛ

Ю О)) )277905 где Р, R и 7i> имеют указанные значения;

А, -ОН, -ОСН, СООН, -NH-СН(СН, ) СООН, (ь) где Y — -ОСН2 -CONH-СН СН, —, -NHCH CH, -NH-CH(CH )-CONHCH CH (z) К вЂ” водород, — О-С-(СНД1) — СН3

0

II

Bg- -О-С вЂ” (СН у — Сн где 7 — -NHCH, СН, —, NH CH(CН ) CONHCH CH (т.) 20 отличающийся тем, что, соединение общей формулы

СН ОН если Л вЂ” ОН и Y — NHCH СН если А(- -NH-СН(СН,)-CONHCH, СН, —, 25

НО

NH COB<

Я -СН 8 СОМН, 13

C0NH — СН COSH-ÑÍ вЂ” СН2СН2СОА (L) ID) -ОСН, СООН; R и R имеют указанные значения, и полученное соединение переводят в

его натриевую соль.

Составитель О. Галкин

Техред В.Кадар Корректор М. Демчик

Редактор И. Рыбченко

Заказ 6767/61 Тираж 343 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно- полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

О

ll

А — -у — О-p — ОСН СН вЂ” СИ - B 5

I сна R), конденсируют с N-оксисукцинимидом

1 или N-оксифталимидом в присутствии дициклогексилкарбодиимида в инертном органическом растворителе, а затем с соединением общей формулы

Н-Ъ - 0-Р-О-СН -СН-СН -Я 5 г г5 он R,