Штамм griсноsроrоn каsнiwаyама-продуцент вещества, обладающего стимулирующим действием на репаративные процессы кожи, и способ получения вещества, обладающего стимулирующим действием на репаративные процессы кожи

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ К

РЕСПУБЛИК

I 09) (3!) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3278848/28-13 (86) РСТ/)Р 80/00203/ (01.09.80) (22) 30.04 ° 81 (31) 112294/79 (32) 01 . 09. 79 (33) )Р (46) 30.07.87. Бюл. У 28 (75) Синеи Касиваяма ()Р) (53) 576,8.093.33(088.8) (54) ШТАММ FRICHÎSPORON KASHIWAYAMA—

1РОДУЦЕНТ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО СТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ НА РЕПАРАТИВНЫЕ

ПРОЦЕССЫ КОЖИ, И.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО СТИМУЛИРУЮЩИМ

ДЕЙСТВИЕМ НА РЕПАРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ

КОЖИ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству лекарственных препаратов. Цель изобретения — pasработка способа получения вещества, (51)4 С 12 Р i/02, С 12 N 1/16, А 61 К 35/72//(С 12 N 1/16

С 12 К 1:645) используемого для стимуляции ðaïaративных процессов кожи, а также выявление штамма — продуцента вещества, обладающего стимулирующим действием на репаративные процессы кожи. В качестве продуцента используют штамм Trichosporon kashivayama

РЕЕМ-Р4821 который характеризуется определенными признаками. Способ получения упомянутого вещества заключается в выращивании штамма

FERN-P 4821 в питательной среде, содержащей Ж (мас./об):0,3 глюкозы, 0,5 снятого молока и 0,05 дрожжевого экстракта, при рН 4,0-6,0 и 20-30С в течение 20 ч, затем культуральную ,жидкость фильтруют и отделяют фильтрат. Полученный фильтрат при необходимости концентрируют и/или высушивают. С полученным прапаратом можно готовить лечебные мази, косметические препараты. 1 н.з.п. ф-лы.

Штамм Trichosporon kashivayama депонирован в коллекции культур НИИ

15 ферментации, Япония, под номером

FERN-P 4821 и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Форма и размер (жидкая среда на солодовом экстракте МФ) .

После культивирования в течение

3 суток при 25 С наблюдаются клетки, имеющие прямоугольную или овальную форму и размер (3-4) х (2-20)мкм, после проведения культивирования в течение 5 сут и более форма клеток становится нерегулярной и, наконец, клетки становятся мицелиоидными.

Образование псевдомицелия (куль30 тура на предметном стекле, культуральная среда — агар с картофельным экстрактом).

Клетки псевдогифальные или псевдо мицелиальные, имеют характерные зигзагообразные .артроспоры, но без конидий. !

Аскоспоры. Аскоспор клетки не имеют.

Баллистоспоры, Баллистоспор клет- 40 ки не имеют.

Культуральные признаки.

Колония на агаровой культуральной среде со штриховой разводкой (агаровая культуральная среда на солодо- 45 вом экстракте МЧ ), Тусклая, белан, волосовидная и грубая поверхность, очень мягкая, без подъемов, но с реснитчатой периферической частью. 50

Пленка на жидкой культуральной среде (жидкая культуральная среда на солодовом экстракте М Ч ).

Белая, вол осовидная, хлопьевидная и прочная пленка. 55

На 507. (мас/мас) глюкозном агаре рост отсутствует, на 60Х (мас/мас) агаровой среде с дрожжевым экстрактом не растет.

1 13277

Изобретение относится к микробио= логии, в частности к микробиологическому производству лекарственных средств.

Цель изобретения — разработка способа получения вещества, используемого для стимуляции репаративных процессов ко и, и выявление штамма-продуцента, способного вырабатывать ве- 10 щество, обладающее стимулирующим действием на репаративные процессы кожи, 91

Физиологические признаки.

Ферментация углеводов °

Не ферментируют глюкозу, галактозу, сахарозу, лактозу, трегалозу, рафинозу и инулин.

Ассимиляция источников углерода.

D-глюкоза+, D-галактоза+, мальтоза-, рафиноза-, сахароза-, лактоза-, лактат натрия+, D-ксилоза+, эритрит-, П-маннит+, L-сорбоза+, инозитол-, трегалоза-, D-арабиноза-, Ь-арабиноза-, сукцинат натрия+, цитрат натрия+, ацетат натрия+, инулин-, растворимый крахмал-, этанол+, глицерин+, целлобиоза-, (+: используется, не используется).

Использование нитратов; не используются.

Использование нитритов: не ис- . пользуются.

Использование этиламина гидрохлорида: не используется.

Разложение глюкозида (арбутин)-: разлагается, Образование аналогов крахмала:не образуется.

Образование пигмента: не образу; ется.

Образование сложных эфиров: образуются.

Реакция с лакмусовым молоком: не коагулирует..

Потребность в витаминах: не требует.

Устойчивость к соли: критическая концентрация б-8Х. (мас./об).

Оптимальная температура 25 С.

Оптимальное значение рН 5,0.

Разложение мочевины: не разлагается.

Рост при 37 С: не растет.

Образование кислоты из глюкозы: не образуется.

Устойчивость к циклогексимиду: резистентен.

Жиры и масла разлагает. !

Выделяет при культивировании на среде, состоящей из 0,3Ж (мас,/об.) глюкозы, 0,5Х (мас./об.) снятого молока и 0,057 (мас,/об) дрожжевого экстракта, при рН 4,0-6,0 при 20-30 С в течение 20 ч биологически активное вещество, и фильтрат, содержащий данное вещество, имеет следующие свойства, Бесклеточный очищенный фильтрат надосадочной жидкости культурального продукта содержит небольшие ко1327791

0,1

1,0

Не выявлено (предел детектирования

О, 1 ч/мин

Содержание тяжелых металлов (в виде РЬ) Не выявлено (предел детектирования 1 ч/мин) Не выявлено (предел детектирования

0,01 ч/мин)

Не выявлено (предел детектирования

0,01 ч/мин) Содержание кадмия

Содержание кальция, 40 мг ° o

Содержание фосфора, мг.Х

Содержание муравьиной кислоты

14,7

9,8

Не выявлено (предел детектирования 0,1X) Содержание уксусной кислоты

Не выявлено (предел детектирования 0,01X) .

98,7

Содержание бутировой кислоты

Не выявлено (предел детектирования 0,01X) 55

Содержание молочной кислоты, 7

0,06 личества аминокислот, сахаридов и липидов. При проведении количественного анализа фильтрата оказалось, что суммарный азот составляет 0,0050,015Х а суммарный фосфор — 0,004, 5

-О, 014Х.

Характер и состояние.

Фильтрат представляет собой прозрачную жидкость цветом от бесцветного до слабо желтоватого и имеет слабый запах.

Пробы на подтверждение.

20 мл фильтрата упаривают на водяной бане до уменьшения объема приблизительно до 50 мл. Затем к концентрату добавляют 1 мл раствора нингидриновой пробы. После нагревания смеси в течение 30 мин жидкость преобретает фиолетовую окраску.

5 мп азотной кислоты добавляют к концентрату полученному проведением

Упариванием по известной методике, и смесь кипятят в течение 20 мин. После охлаждения смеси ее нейтрализуют 25

107-ным раствором гидроокиси натрия.

Затем к смеси добавляют 2 мл раствора аммоний-молибдатной пробы. Если смесь нагревают, жидкость приобретает желтоватую окраску, Если к жид- З0 кости добавляют 10Х-ный раствор гидроокиси натрия, она становится бесцветной.

К 5 мл фильтрата добавляют 10 мг индоЛа и 2 мл хлористоводородной кислоты, и смесь встряхивают достаточное время. Когда смесь затем нагревают в течение 10 мин, жидкость становится красной.

Физические характеристики:

Удельный вес

1, 000-1,015

Коэффициент преломления (n ) 1, 330-1, 340 рН (25 С)

4,5-5, 5

Остаток после испарения,X 0 5-2,0

Содержание воды (согласно методу

50 сушки при атмосферном давлении)7

Белки (коэффициент

6, 25) Следы

Содержание липидов (согласно методу экстракции в аппарате

Сокслета),7 0,2

Содержание волокон,7. О

Содержание золы,7

Содержание сахара,7

Суммарное содержание сухого вещества,7 (в пересчете на воду) 1,3

Содержание азота в аминоформе, мг.7. 10

Кислотность по титрованию, число мл 1 н щелочи оттитрованных для нейтрализации 100 г образца 0,6

Содержание азота в форме летучих оснований, м1 .Х 1

Содержание мышьяка (в виде As 0 ) Суммарное содержание рт-ути

1327791 (предел детектирования 0,03%) 0,02

Менее 30 клеток на

Не выявлено (пр едел детектирования 1 мкг.%)

Не выявлено (предел детектирования, 0,03 мг.%) /-/

/-// мл

/-// мл

Содержание ниацина

Не выявлено (предел детектирования

0,02 r/êã) Не выявлено (предел детектирова ния 0,02 мг.%)

4,9

Не выявлено(предел детектирования

0,005 г/кг) 0,42

Не выявлено (предел детектирования. 30

0,005 г/кг) Содержание витамина В<

Не выявлено (пр едел детектирования

0,01 MI %) Содержание витамина В, мг,X

0,02

Не выявлено (предел детектирования 2 мг.%) Содержание витамина Вь не выявлено (предел детектирова .

5 M

Не выявлено (предел детектирова-..: ния

0,05 мкг ° %) 0,09

Не выявлено

Содержание лимонной кислоты,7

Число жилых клеток

Е. coli

Staphylococcus

aura us

Число грибов

Число дрожжей

Содержание пропионовой кислоты

Содержание сорбиновой кислоты

Бензойная кислота, . г/кг

Сложный эфир и-гидроксибензойной кислоты

Суммарное содержание витамина С

Содержание витамина В

Ô2

Содержание пантогеновой кислоты, мг.%

Содержание холина

Содержание фолиевой кислоты

Суммарное содержание каротина

Значение рН

Аминокислотный состав аминокислоты в 100 r образца (цистин: метод окисления надмуравьиной кислотой, триптофан: анализ с помощью микроорганизмов)

Аргинин менее 0,0 1

Лизин менее 0,0 1

Гистидин менее 0,01

Фенилаланин . Менее 0,01

Тирозин Менее 0,01

Лейцин Менее 0,01

Из олейцин Менее 0,01

Метионин Менее 0,01

Валин Менее 0,01

Ал анин Менее 0,01

Глицин Менее 0,01

Пролив Менее 0,01

Глутаминовая кислота Менее 0,01

Серии Менее 0,01

Треонин Менее 0,0 1

Аспарагиновая кислота Менее 0,01

Триптофан Менее О, 01

Цистин Менее 0,01

Бесклеточная стерильная надосадочная жидкость может быть использована в качестве дерматологического лекарственного аппарата и без концентрирования. Однако предпочтительно конI центрировать бесклеточную стерильную надосадочную жидкость. Кроме того, возможно применение концентрата с высокой степенью концентрирования, превышающей 25, или сухого продукта. Подобный концентрат, имеющий высокую степень концентрации или

7 1327791 8 сухои продукт, может использоваться дерматит, предположительно вызван

-в качестве дерматологического лекар- причинами, не связанными с данным ственного препарата. Кроме того, лечением. Доля пациенток, для котодерматологический препарат может быть рых наблюдается значительное или умеполучен смешиванием подобного кон- 5 ренное улучшение, составляет 80Х. Кроцентрата, сильного концентрата или ме того, у 607 из 365 женщин, у котосухого продукта с кремом, мазевой рых состояние существенно улучшиосновой или другим носителем. лось, пятна на коже исчезли полносРезультаты испытания на токсич- тью. ность с использованием куриного эмб- 10 Проба на излечение трещин кожи и риона показывают, бесклеточный мел ких морщи но к . стерильный концентрат (степень концентрирования 4) токсичностью не об- Для банной пробы отбирают 962 женладает. Результаты кожной аллерги- щин из числа поступивших в дерматолоческой пробы на теле человека и про- 15 гические госпитали (150 женщин в возбы на непрерывное раздражение кожи расте 25-30 лет, 218 женщин в возчеловека показывают, что концентрат расте 30-35 лет,- 248 женщин в возрассовершенно нетоксичен для кожи чело- те 35-40 лет, 172 женщины в возрасвека. Результаты пробы на раздраже- те 40-50 лет и 174 женшины в возрасние слизистой оболочки глаза кролика 20 те свыше 45 лет) . После промывания показывают, что концентрат не явля- кожи лица поры кожи открываются озоется раздражителем совсем. Резуль- ном и паром, на кожу лица плотно нататы антибиотической пробы показыва- кладывают марлю, пропитанную концентют, что концентрат не содержит ан- ратом (степень концентрирования 2) тибиотических веществ. 25 .бесклеточной надосадочной жидкости

Дерматологический препарат оказы- и марлю покрывают лентой из пленки вает лечебный эффект в отношении Saran-Угар. Облучение инфракрасными кожных пятен, потрескавшейся кожи, лучами проводят в течение 15-20 мин контактных дерматитов и обожженой для улучшения проникания концентрата в кожу. Обнаружено, что после

Проба на излечение кожных пятен. одной обработки потрескавшаяся кожа

Отбирают 621 женщин, имеющих кож- значительно улучшилась у 698 женщин ные пятна на лице, за исключением (73X.), сравнительно улучшалась у пациентов имеющих заболевание женщин (163), состояние не изпечени или гинекологические наруше- 35,менилось у 72 женщин (7,7) ния, а также беременных женщин, по- и состояние не ухудшилось ни у одступивших в дерматологические гос- ной из женщин, остается 36 женщин питали для излечения кожных пятен. (4X) . Учитвая тот факт, что растресПосле промывания лица кожные поры от- кивание кожи развивается в конечном крывают воздействием озона и пара,и на40 счете в мелкие морщинки, можно счиобласть нахождения пятен наносят тать, что концентрат, являющийся марлю, пропитанную концентратом (сте- эффективным с точки зРения лечения пень концентрирования 2) бесклеточ- РастрескиваниЯ кожи, оказывает ной надосадочной жидкости. Нанесен- профилактический эффект, препятствуя ную марлю покрывают лентой пленки 45 образованию мелких морщинок. марки Saran Wrap и производят облучеПроба на лечебный эффект в отношении контактных дерматитов. ния проникновения концентрата в кожу.

Эту обраб тку проводят раз в неде " щая сыпью и жжением на веках обои продолжают в течение 3 мес,.Обнаружено,что состояние сильно улучшиих глаз, возникающими на сле щи дующи" и (58 4X) де ь после смены еней я век сравнительно улучшилось у 122 женфирма А на тени для век и мы Б диагноз — контактный дерматит. Дерщин (19,8X), никакого улучшения у матологом на пораженные участки на133 женщин (21,4X), состояние ухуд- несена марля, пропитанная концентрашилось у одной женщины (0,017) и том (степень концентрирования 2) бесконтактный дерматит возник у осталь- клеточной надосадочной жидкости. ных двух женщин (0,033). Контактный Не использовалось никаких стероид1327791

25

40

55 ных препаратов, противовоспалительных и антигис тами новых веще ств, Пациентке представлено около 20 мл концентрата, концентрат наносят на 30 мин дважды в сутки, т.е. утром и вечером, . Спустя 48 ч после начала лечения прекратилось жжение, а спустя 96 ч после начала лечения сыпь по существу исчезла. Спустя 1 неделю сыпь не наблюдается совсем:

Проба на лечение ожогов.

Женщина 47 лет имеющая ожог, возникший в результате обваривания горячей водой, на наружной части левого предплечья (ожог II степени) с высыпанием и припухлостью величиной с ладонь, а также мелкими пузырьками, обратилась к дерматологу спустя 1 ч после обваривания. Пораженный участок немедленно охлаждают проточной водой, на пораженный участок наносят марлю, пропитанную концентратом (степень концентрирования 2) бесклеточной стерильной надосадочной жидкости и на нее накладывают пер. гаментную бумагу. Затем на пораженный участок накладывают повязку.

Спустя 24 ч обнаружено, что мелкие пузырьки совершенно исчезли, хотя высыпание и припухлость остались и пациентка прекратила жаловаться на боль, Мужчину 30 лет, имеющего ожог в результате обваривания горячей водь1 на задней части правой ноги (ожог степени) с высыпанием и припухлостью размером с куриной яйцо, обрабатывают концентратом (степень концентрирования 2) бесклеточной стерильной надосадочной жидкости по методике, описанной вышее. Спустя 24 ч припухлость исчезла, хотя высыпание осталось, и пациент прекратил жаловаться на боль.

Таким образом, концентрат оказывает сильно выраженный лечебный эффект в отношении ожогов.

Пример 1. В перемешиваемый ферментационный аэротенк емкостью

1000 л загружают 800 л культуральной среды, имеющей описанный выше состав, и после стерилизации нагреванием и естественного охлаждения эту культуральную среду инокулируют затравкой, образованной осуществлением предварительной культивации при 28 С в течение 30 ч в 10 л той же культуральной среды в небольшом перемешиваемом ферментационном аэротенке. Затем культивацию проводят при 28 С в течение 70 ч в условиях аэрации и перемешивания. После завершения ферментации культуральную жидкость пропускают через фильтровальный аппарат модели

МР 293- 16 производства фирмы (Найгай Секухин Kore К.К." (фильтровальная бумага GL-90 производства фирмы "Тое Роси", 0,5 мкм) и через фильтровальный агрегат модели МР-293-4 производства той же фирмы (мембранный фильтр-TM-2 производства фирмы

"Тое Роси", 0,45 мкм) для удаления твердых частиц и клеток. Полученный фильтрат концентрируют в соответствии с методом использования мембраны обратного осмоса в аппарате модели производства фирмы "Байоинджиниринг Ко" так, чтобы объем уменьшился до 200 л. Полученный концентрат стерилиэуют с использованием теплообменника тарельчатого типа (производства фирмы "Иван Кикай Kore

К.К."), стерильно упаковывают в стеклянные емкости и хранят в холодильнике (5 С) .

Пример 2. Стерилизованный концентрат, полученный в примере 1, сушат вымораживанием и полученный порошок смешивают со стерильной мазевой основой с получением мази для кожи.

Пример 3. Косметический препарат получают введением 1 r стерилизованного концентрата, полученного в примере 1, в косметическую основу, состоящую из 1 г стеариновой кислоты, 7 г пчелиного воска, 4 r самоэмульгируемого глицерина моностеарата, 30 r жидкого парафина, 0,1 г водного ланолина и 40 r очищенной воды, и пластифицированием смеси в соответствии с традиционными методиками. Композицию разливают и упаковывают в ампулы, и упакованные ампулы направляют на продажу.

Пример 4. Лекарственный препарат лечения кожных заболеваний получают введением подходящих количеств пиридоксина гйдрохлорида f -оризанола, аллатоина, DL- d, †токоферола (витамина Е) и мятного масла в композицию, полученную в примере 3.

Формула изобретения

1.штамм Trichosporon kashiwayama

FERYi-P 4821 (Коллекция культур

ll 327791 12

FERN, Япония) — продуцент вещества, щей глюкозу О,ЗХ (мас./об), снятое обладающего стимулирующим действием молоко 0,5Ж (мас.o6), дрожжевой на репаративные процессы кожи. экстракт 0,057 (мас.об), при рН

2. Сйособ получения вещества, об- 4,0-6,0 и температуре 20-30 С, в аэладающего стимулирующим действием. на 5 робных условиях, затем отделяют биорепаративные процессы кожи, заклю- массу в стерильных условиях и получающийся в том, что штамм Trichospo- ченный стерильный фильтрат при необгоп kashiwayama FERN-P 4821 выращи- ходимости концентрируют и/или высушивают в питательной среде, содержа- вают.

Составитель Г.Смирнова

Редактор Н,Киштулинец Техред Л.Олийнык Корректор А.Тяскс

Заказ 3398/58 Тираж 499 Подписное, ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35,Раушская наб ., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4