Способ исследования молекулярного переноса в клетках крови

 

Изобретение может быть использовано для исследования аппарата накопления и переноса биогенных аминов клетками крови. Цель изобретения - определение относительного объема грйнул клеток и коэффициентов распределения красителя на цитоплазматической и гранулярной мембранах. В три образца с суспензией тромбоцитов добавляют три различные дозы, акридинового оранжевого. После инкубирования проб измеряют интенсивность флуоресценции каждого образца клеток. Излучение регистрируют при возбуждении на 480 нм и длине волны 530 нм. (Л 00 05 САЭ

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) А1 (5D 4 G N

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТИРЫТИЙ

1 (ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4031508/28- 1 4 (22) 03. 03. 86 (46) 30.12.87. Бюл. Ф 48 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) Е, Г, Попов, 3. А. Габбасов, И. Ю, Гаврилов, А. Г. Межлумян и Е, Я. Позин (53) 612.015(088.8) (56) Цитология, 1975, т. 27, Ф 7, с. 762-767. (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО ПЕРЕНОСА В КЛЕТКАХ КРОВИ (57) Изобретение может быть использовано для исследования аппарата накопления и переноса биогенных аминов клетками крови. Цель изобретения— определение относительного объема гранул клеток и коэффициентов распределения красителя на цитоплазма" тической и гранулярной мембранах, В три образца с суспенэией тромбоцитов добавляют три различные дозы, акриди" нового оранжевого. После инкубирования проб измеряют интенсивность флуоресценции каждого образца клеток. Из" лучение регистрируют при возбужден нии на 480 нм и длине волны 530 нм, 1 136

Изобретение относится к медицине,, в частности к методам цитологических исследований, и может быть использовано для исследования аппарата накопления и переноса биогенных аминов клетками крови.

Целью изобретения является определение относительного объема гранул клеток и коэффициентов распределения красителя на цитоплазматической и гранулярной мембранах.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу исследования молекулярного переноса в клетках крови в идентичные пробы клеток добавляют три различные концентрации флуоресцентного красителя и по измеренным значениям интенсивности флуоресценции этих трех проб вычисляют относительный. объем гранул клеток крови и коэффициенты распределения красите ля на плазматической и гранулярной мембранах по системе уравнений:

Р; =(1-Ч)»Р(С;)+Ч.«-(1= )»Р(К1»С; )+

+V» ЧчР (К1+К2»©, С =C /(1 Ч+К1»Ч-»-(1 И)+К1«К2«Ч»у) где F{C) " зависимость интенсивности флуоресценции даного красителя от его концентрации, С . — общее количество красите"

6 ля, добавленного в i-й образец клеток;

С. — концентрация красителя во

1 внеклеточной среде;

F. - интенсивность флуорес1 ценции i-го образца. клеток;

Ч - относительный объем клеток крови;

W — относительный объем гранул;

K 1 — коэффициент распределения красителя на цитоплазма" тической мембране;

K 2 — коэффициент распределения красителя на гранулярной мембране.

Пример 1. Проводили оценку объема серотонинсодержащих гранул тромбоцитов человека и коэффициентов распределения на плазматической и гранулярной мембранах флуоресцентного красителя акридинового оранжевого (АО). Интенсивность флуоресценции красителя измеряли на спектрофлуориметре Хитачи П F-2

3071 2

55 кюветное отделение которого было видоизменено для измерения сигнала из небольшого объема, прилегающего к передней грани кюветы. Кровь стабилизировали О, 13 M раствором цитрата натрия в соотношении 9: 1 (9 частей крови на 1 часть антикоагулянта).

После центрифугирования крови при

200g в течение 12 мин получали обогащенную тромбоцитами плазму ° Супернатант отбирали пластиковыми пипетками и хранили при комнатной температуре. В три одинаковых образца суспензии тромбоцитов (каждый объем в

1 мл) было добавлено три различные дозы А0, Конечные концентрации АО составили 2; 8 и 15 мкМ. После инкубирования проб при комнатной температуре в течение 90 мин измеряли интенсивность флуоресценции каждого образца клеток. Излучение регистрировали на длине волны 530 нм при возбуждении на 480 нм. Были получены следующие результаты: Р, — 0,016 отн. ед. при С,= 2 мкМ;

F = 0,026 отн. ед. при С = 8 мкМ;

F = 0,036 отн. ед, при С = 15 мкМ, з оэ

Относительный объем тромбоцитов в суспензии составил 0,95%.

3 ави симо сть инт енсивн ости флуоре сценции АО от его концентрации была снята в диапазоне концентраций 1

1000 мкМ. Кривая была приближена полиномом четвертой степени:

С=16«Р+15, 75«F +8, 75 «10 «F +2, 625«F

При этом сумма квадратов относительных ошибок по всем точкам составила

3%. Функция з ависимости F (С) в данном случае есть функция, обратная полученному полиному. Для машинного решения системы из трех полученных уравнений была применена комбинация методов глобального поиска и наискорейшего спуска. Прогон системы на м1якрокомпьютере дал следующие результаты: Kl = 12,5; K2=7000;

11=0 20. Согласно полученным данным, объем гранул составляет 20% от общего объема клеток.

Пример 2. Эксперимент проводился аналогично примеру 1, но были изменены конечные концентрации красителя в пробах в пределах вышеуказанного диапазоне концентраций, Результаты измерений следующие F =

= 0,009 отн. ед. при С ., = 0,5 мкМ;

Р = 0,017 отн. ед, при С„=2 мкМ; э э

Еэ= 0,028 отн. ед. при Соз= 8 мкМ.

71 4

Формула изобретения

13630

Составитель А. Агуреев

Редактор И. Рыбченко Техред Л.Сердюкова Корректор А. Тяска

Заказ 6398/34 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб °, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Относительный объем тромбоцитов в суспензии 0,83Х. Для трех искомых параметров после расчетов были получены следующие значения: K1=11,0;

K2=6900; W=0,19, Пример 3 ° Эксперимент проодился аналогично примеру 1. Результаты измерений следующие: F

= 0,027 отн. ед. при С „= 8 мкМ;

Р = 0,038 отн. ед. при С„= 15 мкМ;

0,046 отн. ед, при С з = 20 мкМ; относит ельный объем клеток О, 85 X.

После обсчета результатов получены следующие значения: Kl=10,0; K2=7100;

W =.0,21.

Из приведенных результатов видно, что предлагаемый способ позволяет оценить относительный объем гранул клеток и коэффициенты распределения

20 красителя на плазматической и гранулярной мембранах.

Способ исследования молекулярного переноса в клетках крови, включающий добавление в пробу флуоресцентного красителя, инкубацию до установления его равновесного распределения и измерение интенсивности флуоресценции, отличающийся тем, что, с целью определения относительного объема гранул клеток и коэффи- циентов распределения красителя на цитоплазматической и гранулярной мембранах, в идентичные пробы клеток . добавляют три различные концентрации акридинового оранжевого в интервале 0,5-20 мкМ, затем измеряют соответствующие величины интенсивности флуоресценции с последующим расчетом.