Способ очистки человеческого фибробластного интерферона

 

Изобретение относится к медицине . Цель изобретения - повышение производительности процесса. Подкисленный раствор интерферона пропускают через колонку с поперечно сшитым декстраном. Интерферон элюируют фосфатным буфером. Часть элюента пропускают через колонку с металлхелатным носителем. Затем интерферон элюируют раствором гистидина с хлористым натрием. Полученный элюент содержит незначительное количество пирогенных веществ, соответствующее требованиям для биологических веществ . 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕа1УЬЛИН

ВСЕСЖРРДД Я

В g " j3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY

ЫБ П %/1 7r6 4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАм изОБРетений и ОтнРытий (21) 2838809/28-14 (22) 06.11.79 (31) 137035/78 (32) 07.11.78 (33) ЛР (46) 15.04.88; Бюл. Р 14 (71) Торэй Индастриз Инкорпорейтед (ЗР) (72) Казуо Хосои и Хитоси Озава (JP) (53) 664.38 (088.8) (56) J. Biol Chem, 252, р. 5934; 1978. (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО

ФИБРОБЛАСТНОГО ИНТЕРФЕРОНА

„„80 ÄÄ 1389667 А 3 (51)4 А 61 К 45/02, С 07 К 15/26 (57) Изобретение относится к медицине. Цель изобретения — повышение производительности процесса. Подкисленный раствор интерферона пропускают через колонку с поперечно сшитым декстраном. Интерферон элюируют фосфатным буфером. Часть элюента пропускают через колонку с металлхелатным носителем. Затем интерферон элюируют раствором гистидина с хлористым натрием. Полученный элюент содержит незначительное количество пирогенных веществ, соответствующее требованиям для биологических веществ. 2 табл.

1389667

Изобретение относится к медицине и касается способа очистки человеческого фибробластного интерферона.

Целью изобретения является повы5 шение степени очистки человеческого фибробластного интерферона, которая достигается за счет хроматографии на поперечно сшитом декстране, содержащей сульфонильные группы, и на производных агарозы, включающих карбоксиметиламиногруппу и ион Са++, или Мх, или Zn++, или Cu+

Способ осуществляют следующим образом. 15

Раствор человеческого фибробластного интерферона с рН 1-3 пропускают через колонку с SP-сефадексом, ко лонку промывают водой, элюцию интерФерона осуществляют при рН 7,0-11,0 20 и затем через колонку с эпоксиактивированной сефарозой-68, содержащей бискарбоксиметиламиногруппу, а в качестве иона металла Са++, или

Ni, или Zn +, или Cu++ элюцию интерферона осуществляют раствором гистидина.

Пример 1. Интерферонсодержацую жидкость готовят обработкой человеческих фибробластных клеток 30 (обычная диплоидная культура) посредством Поли-И: Поли-С в среде

Игла-Ием с последующей, обработкой циклогексимидом и актиномицином Д (супериндукция).

Раствор интерферона (рН 7,4), имеющий активность интерферона

3200 NE/ìë и концентрацию белка

20 мкг/мл, доводят до рН 2,0 соляной кислотой и пропускают через колонку 40 с поперечно сшитым декстраном, содержащим сульфонильную группу, SP— сефадексом (200 мл, 4,6 см х 12 см) °

После пропускания 60 л раствора, содержащего интерферон (с общей ак- 45 тивностью 1,9 х 10 ИЕ), колонку про8 мывают 2 л воды. Элюат содержал

9,5 х 10 ИЕ (SX) активности интерфе5 рона. Колонку затем промывают 0,1 И

Na-фосфатным буфером при рН 8,3, 50 причем интерферон выходил в первых

2 28 л элюента. Эта фракция содер t

9 жала 1,8 х 10 ИЕ (94X) активности интерферона и 23 мг белка. Удельная активность была 8 х 10 NE/Mã. белка.

Концентрация составляла 26 раз и степень очистки 50 раз.

Носитель для металл-хелатной хроматографии приготавливают по методу Пората. Имидоуксусную кислоту (14г) и карбонат натрия (20г) растворяют в воде (100 мл) и подвергают воздействию эпокси-активированную сефарозу — 6В (135 мл, влажный объем) в течение 16 ч при 56 С. После фильтрации и промывания носитель обрабатывают 1 И этанол-амином (100 мл) в течение 4 ч при 56 С, фильтруют, промывают и хранят при

4 С.

Колонку для Zn++ — хелатной хроматографии (45 мл, 3 см х 6,4 см) приготавливают пропусканием 17-ного раствора хлорида цинка через носитель в колонке. Через эту колонку пропускают 2,28 л элюента с колонки с SP-сефадексом и 800 мл физиологического раствора. Раствор, который проходил через колонку, и промывной раствор содержали 8 х 10 ME (4X) активности интерферона. Колонку затем промывают 0,1 И раствором

Na-фосфатного буфера (pH 4,5), содержащим физиологический раствор (1:9, объем на объем). Первая фракция (262 мл) содержала 1,4 х 10 ИЕ (72%) активности интерферона. Концентрация интерферона в этой фракции была 5,3 х 10 ИЕ/мл и концентрация белка — 2 мкг/мл с удельной активностью 2,7 х 10 ИЕ/мг белка, 6 что указывает на очистку в 1700 раз и концентрацию в 166 раз по сравнению с исходным раствором.

Исходный раствор интерферона, содержащий пирогенные вещества, давал положительную реакцию при проверхепо Лимулюс-тесту. Часть пирогенных веществ после прохождения через

SP-сефадекс без снижения активности интерферона снова давала положительную реакцию при проверке по Лимулюстесту. Оставшиеся пирогенные вещества не задерживались на Zn++ -хелатной колонке и удалялись в процессе пропускания через колонку и промывания. Элюент с металл-хелатной колонки содержал незначительные количества пирогенных веществ.

Часть конечной фракции элюента после фильтрации через 0,2 ммк фильтр вводили внутривенно трем кроликам (1,5.х 10 ИЕ/кг веса тела).

Сумма повышения температуры составляла 0,63 С.

Пример 2. В качестве исходного раствора интерферона используют

1389667 интерферон, подобный по примеру 1.

Подкисленный раствор интерферона (48 л, содержащих 5000 ИЕ/мл, общая активность 2,4 х 10 HE) с содержанием белка 25 мкг/мл пропускают через колонку с 200 мл SP-сефадекса и ко" лонку промывают 2 л воды. Интерферон элюируют 2,0 л фосфатного буфера рН 8,3. Получили 2 х 10 ИЕ(833) 10 активности и 100 мг (10,4X) белка (концентрация в 20 раз и очистка в

10 pas). Часть элюента из колонки с

SP-сефадексом (200 мл с активностью

2 х 10, содержанием общего белка . 10 мг) пропускают со скоростью

8 мл/ч через колонку с 2 мл Со хелатного носителя. После промывания

20 мп воды и 20 мл физиологического раствора интерферон элюируют 0,2 И раствора гистидина, содержащим

0,2 М хлористого натрия рН 7,5. Элюент (6,0 мл) содержал 2,3 х !О ИЕ/мл

6 интерферона (общая активность, 13,8 х 10 ИЕ/693) и 15 мкг/мл белка (общее количество белка 0,09 мг, выход 0,9Х. Удельная активность этой фракции составила 1,5 х 10 ИЕ/мг белка, концентрация составила 460 раз, очистка — 750 раз по сравнению с исходным раствором интерферона.

Пример 3. Способ осуществляется согласно примеру 2 за исключением того, что используют Ni ++-хек ф латную колонку вместо Со -хелатный колонки, Элюент (6,0 мл) содержал 2,3 мл х х 10 ИЕ/мл (выход 69X) и 50 мкг/мл белка (выход 37). Удельная активность составляла 5 х 10 ИЕ/мп бел7 ка.

Пример 4. Способ осуществляется согласно примеру 2 эа исключением того, что Еп -хелатная колонI ка используется вместо Со +-хелат45 ной колонки.

Элюент (6,0 мл) содержал 2,3 х х 10 МЕ/мл (выход 69X) и 30 мкг/мп белка (выход 1,8X) . Удельная активность 8 х 10 МЕ/мг белка.

Пример 5. Способ осуществляют согласно примеру 2 за исключ+ чением того, что Си -хелатная колонка используется вместо Со -хелатной колонки.

Элюент (6,0 мп) содержал 1,8 х х 10 МЕ/мл (выход 54 ) и 150 мкг/мп белка (выход 9X). Удельная активность 1,2 х 10 МЕ/мг.

Пример 6. Элюцию интерферона с колонки с SP-сефадексом проводят при рН 11,0.

Исходный интерферон в среде

Игла-Мем с общей активностью

3,2 х 10 ЫЕ, общим белком 89 мг, удельной активностью 3,6 х 10 МЕ/мг

5 доводят до рН 2,0 добавлением 6

N HCl, затем смешивают с 3,0 г

SP-сефадекса С-25 (Pharmacia) и перемешивают в течение ночи при 4 С.

После отстаивания в течение 3 ч супернатант удаляют и SP-сефадекс промывают 3 раза 50 мл дистиллированной воды. Суспензию SP-сефадекс (объем в набухшем состоянии около

20 мп) в 40 мп дистиллированной воды разделяют между 20 пластиковыми пробирками. В каждую из этих пробирок прибавляют по 10 мп О, 1 М фосфата натрия (одноосновного, двухосновного или трехосновного),доводя рН соответственно до 3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12.

Пробирки, содержащие SP-сефадекс и фосфатный буфер для перемешивания тщательно, встряхивают в течение

1 ч и супернатант из каждой пробирки пропускают через фильтр 0,2 ммк.

После этого определяют активность интерферона в 10; фнльтратах (см. табл. 1).

Интерферон элюируется при рН 7,0113 О.

Il р и м е р 7. Интерферон в 0,1 М растворе фосфата натрия (рН 7,6)

16 мп с общей активностью 8 х 10 МЕ, общим белком 8 мг удельной актив(t костью 10 х 10 ИЕ/мг белка, элюированный с SP-сефадекса, пропускают через колонку с Zn++-хелатной ага— розой в количестве 2 мп и колонку промывают О, 1 М раствором фосфата натрия и дистиллированной водой.

После этого Zn+ -хелатную агарозу разделяют на 4 порции и помещают в 4 пластиковые пробирки. В каждую пробирку прибавляют 5 мп забуференного 0,2 М раствора ацетата натрия, содержащего хлорид натрия в кон центрации 1 М и имеющего рН соответственно 1,5; 3 0; 4 5; 6,0, тщательно перемешивают в течение нескольких минут и определяют активность интерферона в каждой пробирке (см. табл.2).

Интерферон элюируется при рН 3,05,5.

5 138966

По известному способу объем Zn хелатного носителя применяется для очистки 14 объемов интерферона, а в предлагаемом способе 1 объем но5 сителя применяется для очистки

1000-6000 объемов интерферона.

Формула изобретения

Способ очистки человеческого фибробластного интерферона, путем металл-хелатной хроматографии, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения производительности процес- 15

Т рН Интерферои, ME

Выход,Х Удельная активность, ИЕ/мг белка (0,6 с0,6

0,6

0,6

47

9,9х 10

7,4 х 10

2,5х 10

1,3х 10

11 2,5 х 10

12 1,4х 10

Таблица 2 рН Активность интер- Выход активферонов, ИЕ х 10 ности, 7

Удельная активность, ИЕ/мг белка х 10

0,2

1,5»

0,2

0,7

1,2

3,0

100

1,0

4,5

2,0

0,6

1,4

5,5

0,1

0,2

6,0 к Для доведения рН используют соляную кислоту.

3 9х10

4 9х10

5 1,0х 10

627х10

7 4,2 х 10

8 7,5 х 10

9 6,6х 10

10 5,6 х,10 са, предварительно проводят хроматографию на поперечно сшитом декстране, содержащем сульфонильную группу при рН элюции 7,0-11,0, а хелатную хроматографию осуществляют с использованием производного агарозы, содержащей бискарбоксиметиламиногруппу, а в качестве иона металла ион Со, или М ++, или Zn+ или

Cu+, причем элюцию проводят раствором гистидина в случае Со++, Ni++ Zn++ или Си++или кислым раствором с рН 3,0 — 5,5 в случае

Zn++-хелатной хроматографии. а б л и ц а 1

Не определяли

Не определяли

0,5 х 10

0,6 х 10

6,8х10

f1,0 х 10