Способ получения производных гликолипидов,стимулирующих регенерацию клеток и тканей (его варианты)

 

Изобретение предназначено для получения соединений, ускоряющих заживление ран. Цель изобретения - повышение выхода целевого.продукта. После обработки этанолом и бактеркостатиком кровь подвергают автолизу. Надосадочную жидкость подвергают диализу . Противодиализат вьюушивают и растворянзт в смеси тетрагидрофурана и хлористого калия. В прозрачный раствор после упаривания добавляют смесь хлороформа и метанола. Верхнняо фазу упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в смеси хлороформа, метанола и воды. Колонку промьюают и злюируют из нее гликопипид смесью хлороформа, метанола и воды. Благодаря применению очищенного соединения ускоряется заживление ран на ранней стадии образования стромы и базального слоя с капиллярами. 4 с.п. ф-лы. со

СООЗ СОВЕТСКИХ

И

РЕСПУБЛИК (51) 4 А 61 К 35/14

3СЮОИУ М И

13,," .,1З

ИЙЮТЕМА .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО EJIAM ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3598349/28-14 (22) 27.05.83, (31) 3328/82 (32) 28. 05.82 (33) СН (46) 15.05.88. Бюп, У 18 (71) Золько Базель АГ (СН) (72) Вольфганг Фраэфель и Роланд

Чаннен (CH) (53) 615. 45(088. 8) (56) Заявка ЕР Я 81102849, кл. А 61 К 37/02, 1971. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ, ГЛИКОЛИПИДОВрСТИИУЛИРУЮЩИХ РЕГЕНЕРАЦИЮ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ (ЕГО ВАРИАНТЫ) (57) Изобретение предназначено для получения соединений, ускоряющих эа„SU„„1396958 АЗ живление ран. Цель изобретения - повышение выхода целевого. продукта.

После обработки этанолом и . бактеРиостатиком кровь подвергают автолиэу.

Надосадочную жидкость подвергают диализу. Противодиализат высушивают и растворяют в смеси тетрагидрофурана и хлористого калия. В прозрачный раствор после упаривания добавляют смесь хлороформа и метанола. Верхнюю фазу упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в смеси хлороформа, метанола и воды, Колонку промывают и элюируют иэ нее гликопипид смесью хлороформа, метанола и воды. Благодаря применению очищенного соединения ускоряется заживление ран на ранней стадии образования стромы и базального слоя с капилляраии, 4 с.п. ф-лы, 13969 б. Фильтрат смешивают с 6 л смеси этанола и эфира в соотношении 3:1.

При этом происходит выдавливание осадка,. содержащего главным образом гликосфинголипиды. Осадок подвергают центрифугированию в центрифуге с ускорением 18000 g в течение

30 мин и отделяют от жидкой фазы.

Полученный осадок высушивают в вакууме при 37 С, после чего растворяют в 20 мл смеси хлороформа и мета50

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения соединений, ускоряющих заживление ран.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Пример 1. а. 2 л полученной из убойных телят крови тут же на бойне смешивают с

300 мл этанола и обрабатывают бактериостатиком — метиловым эфиром и-оксибензойной кислоты (метилпарабен) и н-пропиловым эфиром и-оксибензойной кислоты (пропил-парабен) до концентрации каждого из них 0,02Х. Обработанную таким образом кровь подвергают автолизу в течение трех дней при комнатной температуре. При этом происходит сильный гемолиз и частичное разложение неустойчивых компонен- 20 тов, а также растворение проходящих через мембрану компонентов. Полученный автолизат отделяют от осадка декантацией, а надосадочную жидкость подвергают в течение трех дней диали- 25 зу через мембрану, не пропускающую соединения с молекулярным весом более 10 000, статическим или динамическим способом. В случае динамического диализа диализат и противодиа- 30 лизат в течение трех дней перекачивают через мембрану насосом, чтобы поддерживался максимальный градиент концентраций. При этом процессе кровь одновременно автолизуют и полученные продукты автолиза могут непрерывно диффундировать через диализную мембрану. Чтобы в каждый момент времени правильно поддерживать оптимальный уровень концентрации, проходящий автолиз осуществляют противотоком.

Образующийся противодиализат или фильтрат имеет содержание сухого вещества 5-80 мг/мл. Содержание в нем способствующих заживлению ран соединений доходит до 1 мг/мл (по известному способу получают продукт с содержанием гликосфинголипидов 0,005 мг/мл) .

58

2 иола в соотношении 65:35. Растворенные гликосфинголипиды пропускают через заполненную флорисилом (торговое название геля силиката магния высокоселективного адсорбента фирмы Floridin Corp Питтсбург, штат Пенсильвания, ClllA) колонку диаметром 5,0 и высотой

40 см с использованием в качестве подвижной фазы смеси хлороформа и метанола в соотношении 65:35, в результате чего из него удаляются остатки фосфолипидов. Гликосфинголипиды элюируют из колонки последовательно смесями хлороформа и метанола по 2 л с содержанием метанола 35, 50, 75Х и, наконец, 100%-ным метанолом, Получаемые на отдельньм стадиях элюирования соединения испытывали на способность эаживлять раны. При этом оказалось, что содержащиеся в последней, элюируемой 100Х-ным метанолом, фракции соединения ускоряют заживление ран. Выход составляет 18Х от содержания исходного материала.

Содержащиеся в этой фракции соединения наносят на препаративные пластины для тонкослойной хроматографии с покрытием из силикагеля толщиной 2 мм. Восходящую хроматографию проводят с использованием в качестве подвижной фазы смеси хлороформа, метанола и О, 1%-ного водного раствора хлористого кальция в соотношении 55:45:10. Расстояние — 18 см, После хроматографии пластины высушивают и ненадолго помещают в камеру с атмосферой, насыщенной парами йода.

Окрашиваемые при этом в желтый цвет зоны отмечают, после сублимации йода, соскребают с пластины силикагель и проводят элюирование смесью хлороформа и метанола в соотношении 50:50.

В опытах по ускоряющему действию на заживление ожоговых ран у крыс положительные результаты получены при использовании фракции со значением R при разделении указанным методом тонкослойной хроматографии, равным О, 65.

Пример 2. 2 л противодиализата, полученного по примеру 1а, высушивают в ротационном выпарном аппарате или с помощью лиофилизации и растворяют в 4 л смеси тетрагидрофурана и 0,01 M раствора KCl в соотношении

4: 1. Нерастворимый остаток отфильтровывают на бумажном фильтре, а прозрачный раствор упаривают в ротационном выпарном аппарате до объема

1396958

500 мл, добавляют к нему 1 л смеси хлороформа и метанола в соотношении

2:1 и органическую и водную фазы разделяют путем добавления к смеси 200 мл

5 воды. Верх нюю фа зу, с одержащую гликолипиды, отделяют и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл смеси хлороформа, метанола и воды в соотношении 90: 10:О, 2. Колонку промы-10 вают 1,5 л смеси того же состава, после чего элюируют из нее гликолипид в 1 л смеси хлороформа, метанола и воды в соотношении 85:15:0,2. Выход составляет 21% от содержания исходного материала, R = 0,65. Получаемое этим способом очищенное соединение представляет собой гликолипид, ускоряющий заживление ожоговых ран.

Пример 3. 2 л противодиали- 20 эата, полученного по примеру 1а, экстрагируют описанным в примере 1б образом смесью этанола и эфира в соотношении 3:1 и осадок растворяют в

20 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:8. Диэтиламиноэтилсефадекс А50 в Cl-форме путем промывки О, 1 н. раствором едкого натра и 1 н. раствором уксусной кислоты переводят в ацетатную форму, промы- Зр ваву метанолом и заполняют им колонку диаметром 2,5 и высотой 20 см. Растворенный в смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:8 продукт переносят в колонку и промывают ее последовательно порциями по 200 мл 0,001, 0,002 и 0,2 M ацетата натрия. После этого гликолипид элюируют смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:8, Выход составляет 48% от содержания 40 исходного материала, R 0,65. Элюируемый таким образом гликолипид ускоряет заживление ожоговых ран, Пример 4. Противодиализат примера 1а смешивают с 9 объемами этанола и перемешивают смесь в течение 30 мин при 85 С. Выпадающий при этом осадок отфильтровывают через бумажный фильтр, а прозрачный раствор выдерживают в течение 3 дней.при тем" пературе 20 С. Выпадающий осадок целевого соединения за это время оседает. Надосадочную жидкост ь отделяют декантацией, а остаток растворяют в смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1 и переносят раствор в колонку, заполненную модифицированным диэтиламиноэтиловым сефацелем в ацетатной форме. Элюирование проводят смесью хлороформа и метанола в соотношении 2: 1. Элюант собирают, упаривают в ротационном выпарном аппарате и растворяют в хлороформе. Раствор переносят в колонку, заполненную активированным углем в хлороформе. Колонку промывают вначале хлороформом, затем смесью хлороформа и метанола в соотношении 9: 1 и отбрасывают эти элюаты. После этого колонку промывают смесью ацетона и метанола в соотношении 9:1. В этой фракции содержится целевой гликолипид н чистой форме. Выход составляет 41% от содержания исходного материала, Rg-= 0,65.

Благодаря применению автолиза и диализа выход гликолипидов н значи-. тельной степени унеличивается (до мг/мл по сравнению с 0,005 мг/мл) .

Кроме того, используется только одно хроматографическое вьщеление, в то время как по известному способу требуется три хроматографических ныделения, Если автолиз и диалиэ проводятся одновременно и непрерывно методом противотока, то эффективность способа в дальнейшем увеличивается.

Благодаря диализу методом противотока у автолизата постоянно забираются ннзкомолекулярные продукты гидролиза, так как на другой стороне мембраны, т.е. на стороне диалиэата, ламинарным потоком постоянно удаляются продукты гидролиэа, которые прошли через мембрану.

Результатом этого является то, что к каждому моменту времени создаI ется оптимальный перепад концентрации продуктов Гидролиза между сТоро ной диализа и автолиза мембраны. Удаление этих продуктов приводит далее к тому, что гидролиз на стороне автолиза мембраны не может достичь равновесия и в соответствии с этим дает полный гидролиз целевого продукта, что при статической ультрафильтрации или статическом диализе невозможно, так как здесь достигается равновесие, при котором количество целевого продукта и гидролизата константно.

С помощью фармакологических опытов было показано, чтб полученные актинные вещества способствуют пролиферации предварительно поврежденных фибробластов in vitro и, кроме того, способствуют регенерации соответствующих клеточных популяций in vivo день после начала имплантации губку извлекают и анализируют на содержание

r емогл оби на, де з оксир иб о нукл еи новой кислоты и оксипир олина. Содержание указанных соединений в имплантированных губках, извлеченных из ран через

4 и 10 дней после начала введения чистых соединений, быпо не выше, чем в губках, извлеченных из ран контрольных животных. Однако через 16 и 21 день содержание в губках гемоглобина, дезоксирибонуклеиновой кислоты и оксипиролина было значительно выше, Благодаря очищенному соединению в соответствии с примерами 1-4 ускоряется заживление ран на .ранней стадии образования стромы и базального слоя с капиллярами.

Опыт 3. Рост клеточных культур, например растущих фибробластов, можно затормозить, убрав иэ питательной среды карбонат натрия. Добавка к питательной среде описанных в примерах

1-4 соединений приводит к тому, что клетки быстрее восстанавливают свои функции. Нормальная скорость деления у них достигается быстрее, чем у таким же образом заторможенных, но не подвергнутых дополнительной обработке клеточных культур.

Формула и э обретения

1. Способ получения производных гликолипидов, стимулирующих регенерацию клеток и тканей, путем выделения активного начала из крови теленка с последующей хроматографией, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, выделение проводят путем автолиэа крови в течение 3 дней при комнатной температуре и диалиэа .через мембрану с пределом растворения

10 000 относительно водно-спиртовой среды, при этом диализат и противодиализат непрерывно перекачивают насосом в противотоке или автолизат отделяют декантацией от осадка с последующим диализом надосадочной жидкости, затем к противодиалиэату добавляют смесь этанола и эфира в соотношении 3:1, полученный осадок центрифугируют при 18000 g в течение 30 мин, сушат и растворяют в смеси хлороформа и метанола в соотношении 65:35 и элюцию проводят смесью хлороформа и метанола при возрастающей концентра1396958

В данном случае речь идет не об обычных соединениях, оказывающих митотическое действие, поскольку при добавке упомянутых соединений к обыч5 ным здоровым клеточным культурам не происходит никаких изменений,а культуры с нормально низкой степенью деления, вызванной добавкой к ним вредных агентов, после добавки к ним указанных соединений в течение короткого времени вновь восстанавливают свои функции в отношении степени деленйя, которые практически идентичны соответствующей функции здоровой

15 к ул ьтур ы.

С учетом того факта, что восстановительные механизмы клеточных популяций как in vitro так и in vivo стимулируются соединениями, получаемыми предлагаемым способом, последние можно рекомендовать" для терапев тического применения, в частности при лечении медленно или плохо заживлякицихся ран или ульцераций, восста- 26 новительные способности которых ограничены, Благоприятное .действие этих соединений на исцеление ран иллюстрируется следующими опытами на животных.

Опыт 1. Наркотиэированным крысам ЗО сбривают шерсть и с обеих сторон тела вызывают ожоговые ранения прикладыванием к оголенной коже на 30 с латунных дисков диаметром 2 см, нагретых до 270 С. Активное вещество вводят в желеэообразную основу. В ре35 зультате получают мазь с 20 -ным содержанием активного вещества. Для сравнения готовят контрольную мазь путем введения в желе, воды или физиологического раствора поваренной соли. Двум партиям подопытных животных (по 10 животных в каждой партии) ежедневно (по два раза в день) обрабатывают раны мазью до полного выздоров- . ления. В случае соединения,описанного в примере 2, со значением R <

= 0,65 время излечения по сравнению с контрольной группой сокращается, причем это сокращение может доходить до 21 .

Опыт 2. Наркотизированным крысам наносят путем штампования раны шириной 1 см и глубиной 5 мм. В отверстия раны вводят полые цилиндры с вискозно-целлюлозной губкой. Во внутреннюю полость цилиндрической трубки ежедневно вводят по 100 мкл очищенного соединения. Через 4, 10, 16 и 21

1396958 ции метанола, а в качестве подвижной фазы при хроматографии активной фракции используют смесь хлороформа, метанола и водного раствора хлористого кальция в соотношении 55:45:10.

2. Способ получения производных гликолипидов, стимулирующих регенерацию клеток и тканей, путем вьщеления активного начала из крови теленка с последующей хроматографией, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, вьщеление проводят путем автолиза крови в течение 3 дней при комнатной температуре и диализа через мембрану с пределом растворения

10 000 относительно водно-спиртовой среды, при этом диализат и противодиализат непрерывно перекачивают при помощи насоса в противотоке или автолизат отделяют декантацией от осадка с последующей диализацией надосадочной жидкости, затем противодиалиэат высушивают и растворяют в смеси из 28 тетрагидрофурана и водного раствора хлорида калия в соотношении 4:1, раствор фильтруют и упаривают, концентрат смешивают со смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:1, разделяют на органическую и водную фазы, добавляя воду, отделяют надосадочную органическую фазу с последующей ее сушкой и растворением в смеси хлороформа, метанола и воды в соотношении

90: 10:О, 2, а хроматографию проводят на колонке Bio-Sil-А с той же смесью растворителей.

3. Способ получения производных гликолипидов, стимулирующих регене40 рацию клеток и тканей, путем вьщеления активного начала из крови теленка с последующей хроматографией, отличающийсятем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, выделение проводят путем авто45 лиза крови в течение 3 дней при комнатной температуре и диализа через мембрану с пределом растворения 101000 относительно водно-спиртовой. среды, 50

Составитель

Техред Л.Се при этом автолизат и противодиалиэат непрерывно перекачивают насосом в противотоке или автолизат отделяют декантацией от осадка с последующим диализом надосадочной жидкости, смешивают противодиализат с 9 объемами этанола и перемешивают при 85 С,фильтруют и фильтрат выдерживают в течение 3 дней при 20ОС, надосадочную жидкость отделяют декантацией и остаток растворяют в смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1, а хроматографию проводят в колонке, заполненной модифицированным диэтиламиноэтиловым сефацелем в ацетатной форме с той же смесью растворителей, после чего осуществляют элюирование смесью хлороформа с метанолом в соотношении

9:1 и затем смесью ацетона с метанолом в том же соотношении.

4. Способ получения производных гликолипидов, стимулирукщих регенерацию клеток и тканей, путем выделения активного начала из крови теленка с последующей хроматографией, о т л и« ч а ющи йс я тем, что, с цельюповышения выхода целевого продукта, вьщеление проводят путем автолиза крови в течение 3 дней при комнатной температуре и диалиэа через мембрану с пределом растворения 10 000. относительно водно-спиртовой среды, при этом диалиэат и противодиализат непрерывно перекачивают при помощи насоса в противотоке или автолизат отделяют декантацией от осадка с последующей диалиэацией надосадочной жидкости, затем к противодиализу добавляют смесь этанола с эфиром в соотношении 3:1, полученный осадок отделяют центрифугированием при 18000 g в течение

30 мин, высушивают и растворяют смесью хлороформа и метанола в соотно- . шении 2:8, а хроматографию раствора проводят на колонке, заполненной диэтиламиноэтил-сефадексом А50 в ацетатной форме, и элюцию осуществляют смесью хлороформа и метанбла в соотношении 2:8, Л. Шилина рдюкова Корректор А.Обручар

Редактор N. Петрова

Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делай изобретений и открытий

113035, Москва, -35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 2507/59

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4