Способ индентификации сероваров бактерий вида bacillus тнuringiеnsis

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается идентификации энтомопатогенных микроорганизмов вида Bacillus thurin- giens is. Целью изобретения является упрощение способа. Штамм Вас. thurtn- g I ens is идентифицируется путем одновременного определения его чувствительности к набору фагов ВКПМ ffPH-660, ВКПМ № РН-661, ВКПМ № РН-662, ВКПМ № ГН-663, ВКПМ №РН-664, ВКПМ № РН-663. Каждый из полученных сероваров проявляет чувствительность только к своей определенной, отличной от других группе фагов. Это позволяет с высокой точностью и достоверностью относить изучаемый штамм к определенному серовару. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (Н) (11 4 С 12 (! О-, - - 00 .

Ъ,, (н лвтогсиомм свидктюьствм

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТ НИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4060069/28-13 (22) 21.04.86 (46) 30.05.88. Бюл. У 20 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Е,М. Нетыкса и P.P. Азизбекян (53) 576,8.077.5(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 378412, кл. С 01 Й 33/569, !971. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ CEPOBAPOB

БАКТЕРИЙ ВИДА ВАС!!.! US THURINGtENS1S (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается идентификации энтомопатогенных микроорганизмов вида 8ас 11us thur ngiånsis Целью изобретения является упрощение способа. Штамм Вас. thuringiensis идентифицируется путем одновременного определения его чувствительности к набору фагов ВКПМ 9РН-660, ВКПМ У PH-661, ВКПМ У PH-662, BKPN

Р PH-663, ВКПМ У FH-664, ВКПМ !

1 PÍ-665. Каждый из полученных сероваров проявляет чувствительность только к своей определенной, отличной от других группе фагов . Это позволяет с высокой точностью и достоверностью относить изучаемый штамм к определенному серовару. 1 табл.

139934 !

Изобретение относится к микробио,логической промьппленности и касается энтомопатогенных микроорганизмов Вас.

thuringiensis. Штаммы Вас. thuringiens s широко используются в микробиологической промышленности в качестве продуцентов бактериальных средств с вредными насекомыми.

Цель изобретения заключается в разработке нового способа идентификации штаммов Вас. thuringiånsiis 1, 11, II1, IV, V, .Х IV серотипов, характери,зующегося меньшей трудоемкостью за счет снижения затрат времени и труда 15 и позволяющего идентифицировать вари анты 1 серотипа.

Поставленная цель достигается тем, что штамм Вас. thuringlånsiis идентифицируется путем одновременного опре-20 еления его чувствительности к набору фагов: Tgl3, Tgl8, Tg25 Tpl15, g21, Td15. Установлено, что каждый из.изенных серотипов Вас. thuringiensis проявляет чувствительность только к воей определенной, отличной от других группе фагов, что позволяет с вы- окой точностью и достоверностью отноить изучаемый штамм к определенному ,серотипу (см. таблицу}.

ЗО

Иэ данных таблицы видно, что 1 серотип var insectus чувствителен только к фагу Tg25, а к фагам Tg13, Tg18, d15, g2l, Тр115 не чувствителен; серотип, var. thur IngIens!s чувстителен к фагам Tg25, Td15, Tpl15 не чувствителен к фагам Tgl3, Tgl8, 21; II серотип, var. finitimus wyaтвителен к фагам Td15, g21, Tpl15 не чувствителен к фагам Tg13, Tg18, g25; I1I серотип, var. kurstak! чувствителен к фагам Tg)3, Tg25, Tg18, Тр115 и не чувстви"елен к Td!5, g21;

IV серотип, var. dendrollmus чувстви телен к фагам Тд!5, Трl15 и не чувствителен к Tg13, Tg25, Tg18, g21; Ч серотип, var. gal ler1àå чувствителен ко всем исйользованным фагам; ХIV се отип, var. israe!ens s чувствителен

1 фагу g21 и не чувствителен к Tg13, 50 Гд25, Tg18, Td15, Тр115, Таким образом каждый серотип чувствителен только к определенному фагу ! ли к определенной группе фагов, т.е.

1меет свой спектр чувствительности к предложенной группе фагов. Определив, К каким фагам из предложенной группы чувствительна проверяемая культура, по таблице можно определить ее серотип .

Получение и характеристика фагов, необходимых для определения серотипов штаммов Вас. thuringiensis.

Фаги Tg13, Tg25, Tg18, Td!5 получены в лабораторных условиях путем выделения из почвы методом обогаще" ния; фаги g21, Тр115 выделены из промьппленных фаголизатов при производстве знтобактерина. По классификации

Тихоненко перечисленные фаги относятся к следующим группам: фаги Tg13, Tdl5, Tg25 и Тр115 относятся к 111 группе фагов с сокращающимся чехлом отростка; фаг Tg18 - к 11 группе, которая характеризуется удлиненным капсидом и структурой типа "воротника", расположенного между капсидом и коротким отростком; фаг g21 — к

I группе; фаги, относящиеся к этой группе, характеризуются головкой иксагональной формы и несокращающимся отростком, заканчивающимся кисточкообразными выростами.

При титровании на штаммах Вас.

thuringiens s var. даl Iегiae негативные колонии этих фагов имеют следующую морфологию: фаг Tg18 — колонии средних размеров (d = 3-4 мм), центр прозрачный, вокруг полупрозрачная

"оборка"; фаг g21 — мелкие, прозрачные колонии, фаг Tg13 - мелкие точечные прозрачные колонии; фаг Td15 колонии диаметром 1,5-4 мм, очень прозрачные с резко очерченными краями; фаг Тд25 — колонии средних размеров (d. до 3 мм), центр прозрачный с двумя полупрозрачными "оборками" вокруг; фаг Тр115 — очень мелкие (д до мм), прозрачные колонии.

Все фаги, необходимые для данной работы, хранятся в бульоне Хоттингера. Титр используемого фага не менее

10 фаговых частиц/мп. Препараты фагов получают методом сливного лизиса с последующим центрифугированием и фильтрованием. Весь набор препаратов фагов может быть получен в течение

3-5 дней. При хранении фагов в холодильнике (4 С) или при комнатной температуре титр фагов остается неизменным в течении 5-6 мес.

Фаги Тд!3, Tg18, Tg25, Tdl5, Tpl15, g21 депонированы во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеют соответственно регистрационные номера: ВКПИ РН-660, ВКПМ РН-66!, 1399341

ВКПИ PH-664, BKIIM IsH-663, ВКПИ

PH-665, ВКПИ PH-662.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определяют серотип культуры Bacillus thuringiensis.

Культуру Вас. thuringiensis, серотип которой необходимо определить, выращивают в бульоне Хоттингера в тео чение 3-4 ч при 37 С при равномерном покачивании (220 об/мин). Для определения серотипа испытуемой культуры необходимо иметь 6 фагов: Tg13 Tg25, Tgl8, Tdl5, Тр115, g21 с исходным .титром 10 фаговых частиц/мл, раэмноенных на штамме Bac. thuringiensis серотипа.

Испытуемую культуру Вас. thurin"giensis в объеме 0,3 мп добавляют до

3 мп солевой среды следующего состава, г: СаС1 ° 6H О 0,11; ИдС1 ° 6Н О

О, 14; MnS04 5Н<О О, 15; M gSO 1, 23 агар Oifco 6, бульон Хоттингера

200 мл, дистиллированная вода 800 мл, рН 7,2-7,4, и выливают на чашку Петри со слоем 27. агара Хоттингера. Затем чашку Петри с испытуемым газоном культуры делят на 6 зон, в каждую из которых петлей наносят по одной капле каждого иэ вышеупомянутых шести фагов. Затем чашку Петри ставят в термостат на 28 С. Через 19 ч по общей картине наличия или отсутствия лизиса культуры во всех шести зонах судят о фагочувствительности испытуемой культуры. Контролем служит штамм

V серотипа,,на котором все шесть фагов дают отчетливую зону лизиса.

Лизис испытуемой культуры наблюдается только в зоне фага Tg25. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к серотипу, var. insectus.

Пример 2. Определяют серотип культуры Вас. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Ливис испытуемой культуры наблюдается в зоне фагов

Tg25, Td15 и Тр115.

Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к.l серотипу.

Пример 3. Определяют серотип культуры Bac. thuringiensis. . Все операции осуществляют в соответствии с примером,1. Лизис испытуемой культуры наблюдается в зоне фа5

15

25

35 длится 2-3 мес и требует многократной иммунизации животных. Предлагаемый способ не требует наличия животных, 55 обеспечивает стандартность и достоверность получаемых результатов и позволяет.дифференцировать варианты

ihuringiensis u insectus внутри 1 се40

4S

50 гов Td15, g21, Tpl15. Сравнивая рсэультаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к серотипу II.

Пример 4. Определяют серотип культуры Вас thurlng1епэ1s.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуемой культуры наблюдается в зоне фагов

Tg13, Tg25, Tgl8, Tpl15. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к III серотипу.

Пример 5. Определяют серотип культуры Bac. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуемой культуры наб..юдается в зоне фагов

Tdl5 и Tpl15. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод,что испытуемая культура относится к IV серотипу.

Пример 6. Определяют серотип культуры Вас. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером l. Лизис испытуемой культуры наблюдается в зоне всех

6 фагов. Сравнивая результаты с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к V серотипу.

Пример 7. Определяют серотип культуры Вас. thuring1ens s..

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лиэис испытуемой культуры наблюдается в зоне фага

g21. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к XIV серотипу.

Предлагаемый способ идентификации штаммов. I, I I, 1 t t, .IV, V, X IV серотипов Вас. thuringiensis с помощью набора фагов менее трудоемок по сравнению с известным способом, .основанном на применении типовых специфических иммунных сывороток. Для осуществления предлагаемого способа требуется 3-5 дней — столько времени занимает размножение данного набора фагов.

Это примерно в IO раз меньше времени, необходимого для получения иммунных сывороток, процесс получения которых ротипа, что невозможно при использо"

Определение серотипов штаммов Вас111пэ thuringiensis по спектру чувствительности к набору фагов Тд13, Тс118, Tg25,. Tdl5, Tpli5,g21

Tg13 Tg25 Tgl8 Т 15 g21 Тр1

Серотипы 15

«Ю «» I,1 серотип (var. insectus) 1 серотип (var ° thurlngiensis) lI серотип (var finttimus) l1l серотип (var kurstaki) !

lV серотип (чаг. dendrol imus)

Ч серотип (чаг. galleriae)

1

XIV серотип (var, lsraelensis) П р и м е ч а н и е "+" Наличие зоны лиэиса на газоне испытуемой культуры.

"-" Отсутствие зоны лизиса на газоне испытуемой культуры, Составитель В. Романова

Редактор Н. Киштулинец Техред N.яндык Корректор, О.Кравцова

Заказ. 2643/29 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4

5 1 399341 6 ванин способа на основе иммунных сы- к серовару dendrolimus - к фагам вороток ° ВКПМ У РН"663, ВКПМ ii PH-665, к серовару thuringiensis - к фагам ВКПМ рмула изобретения рPH663BKIIMyPH664ВКПМ9PH

Способ идентификации сероваров к серовару israelensis - к фагу ВКПМ бактерий вида Bacillus thuringiensis, 11 PH-662, к серовару finitimus " к отличающийся тем, что, с фагам ВКПМ .Р PH-662, BKIIM У PH-663, 1 целью упрощения способа, на исследуе- BKIIN Ф РН-665, к серовару kurs мую культуру воздействуют бактерио-, 10 taki - к фагам ВКПМ У PH"660, фагамн ВКПМ У PH-660, ВКПМ 11 PH-661, BKIIM Р PH-661, ВКПМ:Р РН-664,, ВКПМ

ВКПМ Р РН-662, ВКПМ Ф PH-663, ВКПМ 11 PH-665, к серовару galleriae - к

У РН-664, ВКПМ У PH-665, при этом к фагам ВКПМ Ф РН-660, ВКПМ В РН-661, серовару insectus относят культуры, ВКПМ II PH-662, ВКПМ У PH-663, ВКПМ чувствительные к фагу ВКПМ У PH-664, 15 В PH-664, ВКПМ У PH-665.