Способ получения человеческого гамма-интерферона

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„,$0„„1405 1 аю 4 А 61 К 45/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 8,"

H AATEHTY (21) 3624508/28-14 (86) РСТ/HU 82/00064 (30.11.82) (22) 26.07.83 (3I) 3594/81 (32) 01. 12.81 (33) HU (46) 23.06.88, Бюл. У 23 (71) Эдьт Дьедьсерведьесети Дьяр (HU) (72) Илона Белади, Миклош Тот, Иштван Ростоци, Шандор Тот и Валерка Эндрес (НП) (53) 615.45(088.8) (56) 7. Immunol, 1980, 10, 877, Virology, T961, 14, 359. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО

ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА (57) Изобретение относится к медици.не, точнее к фармацевтической промыш" ленности, а именно к получению у=.интерферона. Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта путем дополнительной обработки лейкоцитов

cl- или р-интерфероном в количестве

500-5000 ?Е/мп в течение 1-12 ч. Затем обрабатывают лейкоциты митогене-.. тическим агентом и центрифугируют °

Удаляют эритроциты 0,83-0,89Х-ным водным р-ром хлористого аммония, Суспендируют лейкоциты в питательной среде, содержащей хлористый кальций, нитрат железа, хлористый калий, сульфат магния, гептагидрат, хлористый натрий, кислый углекислый натрий, дигидрат однозамещенного фосфата натрия и Глюкозуе

1405691

0,1

400

Изобретение относится к области медицины, в частности к фармацевтической промышленности гамма-интерферона. 5

Целью изобретения является повыение выхода целевого продукта за чет дополнительной обработки лейко . тов альфа- или бета-интерфероном, Способ осуществляется следуюцим 10 бразом е

Пример 1. Кровь, полученую в растворе ЛКД (водный раствор, одержащий лимонную кислоту и декстозу),хранят в течение 3 ч при темературе 4 С. Фракцию лейкоцитов ото еляют центрифугированием и оставлят стоять в течение ночи при темпео атуре 4 С. Затем одну съемную часть олученного таким образом концентраа лейкоцитов смешивают с 5 мас.ч. ,89Х-ного водного раствора хлоритого аммония при температуре 4 С выдерживают суспензию до полного астворения эритроцитов (обычно этот роцесс заканчивается через 5-10 мин ), осле чего лейкоциты отделяют центриугированием и, суспендируют в питаельной среде следующего состава, г/л: 30

Хлористый кальций

Нитрат железа

Хлористый калий

Сульфат магния, гептагидрат 200 35

Хлористый натрий 6400

Кислый углекислый натрий 2750

Дигидрат однозамещенного фосфата натрия 140

Глюкоз.а 4500

После этого вновь проводят удале ние эритроцитов, используя при этом

10 об ч, 0,83%-ного водного раствора хлористого аммония. Лейкоциты суспенДируют в питательном растворе, доводя концентрацию клеток в нем до 10 кле7 фок/ип. В питательный раствор, кроме казанных ингредиентов, добавляют

; мг/мп агамной сыворотки человека и

: 5 мкг/мл неомицина. Полученные кает си подвергают обработке в течение ч при температуре 37 С и постоян-. ном перемешивании альфа-интерфероном количестве 1500 IE обработанным предварительно при рН 2,0 для удале ния иэ него вируса Sendai. Затем льфа-интерферон удаляют путем двухкратного промывания клеток раствором

Хэнкса и добавляют к ним конкавалин в количестве 15 мкг/мп, выдерживая их при температуре 37оС в течение

12 ч. После этого клетки отделяют от надосадочного слоя центрифугированием. Выхрд гамма-интерферона в неочищенном надосадочном слое равен

1666 IEjwx.

Для сравнения процесс проводили таким же образом, но перед добавлением индуктора лейкоциты не подвергали предварительной обработке альфаинтерфероном. В этом случае выход гамма-интерферона равен 216 IE/мл.

Пример 2. Процесс проводят по примеру 1 с той лишь разницей, что в качестве питательного раствора используют среду MEN типа Hasgow (Virology, 14, 359, 1961), при этом выход гамма-интерферона в неочищенном виде составляет 1600 IE/ìë.

Описанный процесс повторяют за исключением стадии обработки альфаинтерфероном. Содержание активного. вещества в неочищенном интерфероне, полученном таким образом, равно лишь

206 IE/мп.

Пример 3, Процесс. проводят по примеру 1 с той разницей, что используемый для дополнительной обработки альфа-интерферон не удаляют.

Обработанные альфа-интерфероном клетки выдерживают в присутствии конкавалина А (концентрация 15 мкг/мп) о при 37 С в течение 12 ч при постоянном перемешивании. Содержание интер" ферона в надосадочной жидкости составляет 1733 IE/êë.

Полученный в результате продукт, содержащий альфа- и гамма-интерферон, разделяют на отдельные компоненты с помощью хроматографии. Для этого сырой продукт вводят в колонку, заполненную насадкой из CPG-стекла. Аньфаинтерферон и примеси проходят через колонку, а гамма-интерферон задерживается. Элюирование гамма-интерферона осуществляют с помощью водного раствора, содержащего 20 об,ч. этиленгликоля, 150 ммоль хлористого натрия и 20 ммоль фосфатного буфера.

Hp и м е р 4. Процесс проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что для предварительной обработки вместо альфа-интерферона используют

2500 lE/ип бега-интерферона, Содержание гамма-интерферона в пЬлучаемом

14056

Преимущество предлагаемого спосо5а заключается в том, что благодаря предварительной обработке альфа- . или бета-интерфероном, выход гаммаинтерферона возрастает в 5-10 раз.

По своим физико-химическим. свойствам (чувствительности при рН 2,0; стабильности, определенной при 56 и.

37 С) и биологической активности (антивирусное.и противоклеточное действие), полученный предлагаемым способом гамма-интерферон полностью эквивалентен гамма-интерферону, полученному известным способом.

Формула изобретения

Способ получения человеческого гамма-интерферона путем выделения из крови фракции лейкоцитов, удаления эритроцитов, суспендирования лейкоцитов в питательной среде, с последующей обработкой их митогенетическим агентом и отделением кле-. ток центрифугированием, о.т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, удаление эритроцитов проводят 0,83—

0,89Х-ным водным раствором хлористого аммония, а перед обработкой митогенетическим агентом лейкоциты обрабатывают альфа- или бета-интерфероном в количестве 500-5000 IE/ìï в течение 1-12 ч.

Составитель Л. Шилина

Редактор Л. Гратилло Техред Л. Сердюкова Корректор Г. Решетник

Заказ 3111/57 Тираж 655 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-пблиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 при этом сыром продукте составляет

1866 IE/ìë.

Повторяют описанный процесс за исключейием стадии предварительной обработки бета-интерфероном. Содержание активного вещества в неочищенном интерфероне, полученном таким образом, составляет 226 IE/ìë.

Пример 5, Получение гамма- 10 интерферона проводят по примеру 1 с той лишь разницей, что предварительную обработку проводят альфа-интерфероном в концентрации 500 IE/ìï, при этом гамма-интерферона получено в 15 количестве 700 IE/ìë.

Пример 6. Процесс проводят по примеру 1, только для предварительной обработки используют бета-интерферон в концентрации 500 IE/ìë, при 20 этом выход гамма-интерферона составляет 1000 IE/ìë.

Пример 7 ° Процесс проводят по примеру 1 с той лишь разницей, что для обработки лейкоцитов исполь- 25 зуют альфа-интерферон в концентрации

5000 IE/ìë, при этом выход гамма-интерферона составляет 300 IE/ìë.

Пример 8. Получение гаммаинтерферона проводят по примеру 1, 30 при этом обработку лейкоцитов проводят бета-интерфероном в;.концентрации

5000 IE/ìë. Выход гамма-интерферона в данном случае составляет 1000 ?Е/мл, При проведении обработки лейкоци- 35 тов альфа- или бета-интерферонов в течение 30 мин, а не 4 ч как в примере 1, производство гамма-интерферона снижается при этом от 1500 до

91

250 IE/ìë, а проведение ее в течение

15 ч не превышает выхода гамма-интерферона, равного 1550 IE/ìë.