Способ получения диагностических поливалентных сывороток для идентификации жгутикового антигена y.еsснеriснiа coli

 

Изобретение относится к микробиологии . Цель изобретения - упрощение идентификации жгутикового антигена эшерихий. По предлагаемому способу проводят иммунизацию животных штаммами с разными Н-аитигенами. В сыворотке крови этих животных определяют специфическую активность и присутствие гетерологических Н-антител. Антитела к соматическим О- и К-антигенам адсорбируют из поливалентной сыворотки каким-либо штаммом серогруппы 055:К59 (В 5) с Н-антигеном. При обнаружении в сыворотке гетерологйческих Н-антител используют в качестве адсорбента штамм с К-антигеном, соответствующим этим гетерологичным антителам, для одновременного удаления соматических и гетерологичных Н-антител. При этом повьппается специфичность получаемых поливалентных сьгеороток. табл. SS (Л с

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСтиЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

153 А1

ПЕ ПП (51)5 A 61 К 39/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ъ (00

Сл

©Э

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

11О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 23. 09. 91. 1 оп. Р 35 (21) 36774? 7/14 (22) 20.12.83. (71) Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова (72) Ю.А.Ратинер (53) 615.373(088.8) (56) Ратинер Ю.А. Диагностическая рапид-система для идентификации Н-аитигенов у эшерихий. ЖМЭИ, 1982, И 2, 37-41. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПОЛИВАЛЕНТНЦХ СЫВОРОТОК ДЛЯ

ИДЕНТИФИКАЦИИ ЖГУТИКОВОГО АНТИГЕНА

У.ESCHERICHIA COLT (57) Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения — упрощение идентификации жгутикового антигена эшерихий. По предлагаемому способу проводят иммунизацию животных штаммами с разными Н-антигенами.

В сыворотке крови этих животных определяют специфическую активность и присутствие гетерологических Н-антител, Антитела к соматическим

О- и К-антигенам адсорбируют иэ поливалентной сыворотки каким-либо штаммом серогруппы 055:К59 (В 5) с H-антигеном. При обнаружении в сыворотке гетерологйческих H-антител используют в качестве адсорбента штамм с

Н-антигеном, соответствующим этим гетерологичным антителам, для одновременного удаления соматических н гетерологичных Н-антител. При этом повышается специфичность получаемых поливалентных сывороток. 3 табл.

81 >3 7

1 !33

И.з>>6>р< те»>ff. »тн»cè > < я h обллсти

>»>кГ»6» л<>г>зи и >><>жет быть испольэонлно >з ир<зи знодст»e диагностических пр»>лрлто>з для "ерологического типир»>зля>зя Г>лктерий Е. Со1 i, в том числе являющихся воэГ>удитедями инфекционных заболеваний.

Цель изобретения — упрощение идентификации жгутиконого антиге»а эшерихий.

Способ осуществляется следующим образом, Для иммунизации животным— продуцентон сыворотки и лдсорбции антител используют коллекцию штаммов Е.Coli> относящихся к одной и той же серологической группе 055:К59 (В 5), но обладающих разными Н-антигенами, в число которых входят 54 разновидности: с Н! по Н!2, с Н14 по

Н21, с Н23 по Н49, с Н51 по Н56 и

Н"635" (номера штаммов н коллекции

ГИСК им.Тарасевича, соответственно, с Р 64 по 11> 73, Ф 40, с 11 74 по

У 81, !1 41, с Н - 82 по !! - 115 включительно). Иммунизацию проводят штаммами с разными H-антигенами, необходимыми для индукции у животных синтеза планируемых в составе полиналентной сыворотки Н-антител. В сыноротке крови, полученной от иммунизированных животных, определяют при помощи эталонных Н-тест-штаммов Е.Coli специфическую активность и присутствие гетерологичных H-антител, не запланированных н составе готового препарата сыворотки ° Антитела к соматическим 0- и К-антигенам, использованным для иммунизации штаммов, адсорбируют иэ поливалентной сыворотки каким-либо штаммом серогруппы

055:К59 (85) с Н-антигеном, не соответствующим запланированным н сыворотке Н-антителам. При обнаружении в сыворотке гетерологичных Н-антител используют в качестве адсорбента штамм с Н-антигеном, соответствующим этим гетерологичным антителам, для одновременного удаления соматических и гетерологичных Н-антител.

Пример. Бульонные культуры хорошо подвижных штаммон серогруппы

055:К59 (B5) убивают формалином (0,5X) и соединяют в ранных объемах для получения поливалентных вакцин, Состав вакцин представлен в табл.1.

его подбирают таким образом, чтобы получить 7 полинллентных сывороток, 10

Fl которых лгглютинины ь рл 3»bl>1 Н-антигенам были бы p;1(lip> пелены в неповторяющихся сочетаниях для идентификации Н-лнтигенов бе» применения мононллентных сывороток (в данном примере только следующие пары лнтигенон: Н! и Н12, Н30 и Н32, Н5 и Н"635", — иэ-эл резко выраженных у них общих плрцилльных антигенных факторов нуждах>тся в дополнительной дифференциации при помощи мононалентных сывороток). Иммунизацию проводят внутринеяно шестикратно с интервалами 4-5 дней н возрастающих дозах:

0,4, 0,8, 1,5, 2,0, 3,0 и 4,0 мл.

Для детоксикации эндотоксина вакцины перед введением обрабатынают натинной стерильной ОК-сывороткой

055:К59 (В5) при 37 С 30-40 мин, которую добавляют н количестве 1/10

1/20 объема вакцины. Сыворотку считают пригодной для испольэонания при титре специфических Н-антител

1:1600 и выше, определявшемся посредством пробирочкой реакции аг\ глютинации с эталонными Н-тест-штаммами зшерихий, Также при помощи эталонных Н-тест-штаммон, но посредством реакции агглютинации на стекле контролируют разведенную 1: 1О сыворотку на присутствие гетерологичных

Н-агглютининон. Диагностикумы для реакции агглютинации на стекле получают, выращивая бактерии 16-20 ч при 30 С на скошенном агаре, приготонленном из сухого питательного агара на рыбном гидролизате производства Дагестанского НИИ питательных сред, с добавкой 37 глицерина, Бактерии смывают изотоническим раствором хлорида натрия, содержащим

0,57 формалина, так, чтобы получить бактериальную взвесь густотой около

20 млрд. микробных клеток в 1 мл (по оптическому стандарту мутности)е

Сыворотки, в которых не обнаружены гетерологичные Н-антитела,адсорбируют каким-либо одним штаммом серогруппы 055:К59 (В5), не входящим в состав соответствующей поливалентной вакцины. Сыворотки, в которых обнаружены гетерологичные Н-антитела, адсорбируют штаммами 055:К59 (B5) с Н-антигенами, соответствующими этим Н-антителам. Результаты контроля специфичности сывороток и штаммы, использованные для их вдсорбции, прдеставлены в табл.2.

Преимушество предлагаемого спосо6а состоит в повышении специфичности получаемых поливалентных сывороток, позволяющем упростить процесс идентификации Н-антигенов беэ уменьшения его диагностической эффективности, в частности относительного количества штаммов, у которых оказывается возможным идентифицировать

Н-антиген, и правильности идентификации.

Повышение специфичности заключается в том, что сыворотки освобождают адсорбцией от антител к соматическим (О и К) антигенам использованных для иммунизации штаммов. благодаря этому становится возможным проводить идентификацию посредством реакции агглютинации на стекле, тогда как сыворотки, получаемые известным способом, используют исключительно для реакции агглютинации в пробирках по специальной методике, предотвращающей образование аг- глютината при взаимодействии бактерий с содержащимися в сыворотках антителами к соматическим антигенам.

Результаты идентификации Н-антигенов у эталонных и диких штаммов

E,Cali, выделенных из разных источников, показали, что приготовленные предлагаемым способом сыворотки не уступают по их диагностической эффективности сывороткам, Полученным способом, избранным в качестве прототипа.

Преимущества, связанные с упрощением методики идентификации, иллюстрирует табл.3.

Правильность идентификации Н-антигенов была подтверждена при помощи моновалентных сывороток, т.е все полученные результаты были специфич- 4 ны, Существенной отли tllTf tlat н< и характеристикой предлагаемого способа является использование специально созданного для его выполнения производственного набора идентичных по соматическим антигенам штаммов (для иммунизации животных и адсорбции сывороток) вместо используемой с этой целью в прототипе коллекции эталонных Н-тест-штаммов, обладающих разными соматическими антигенами, в том числе часто неизученными К-антигенамн. Это.отличительная черта, собственно, и обеспечивает возможность удаления иэ сывороток О- и

К-антител (т ° е. повышения их специфичности) и достоверного контроля их присутствия и полноты адсорбции.Кроме того, она обеспечивает возможность адсорбции одним штаммом О- и К-антител, индуцированных разными штаммами, использованными для иммунизации, а также воэможность одновременного удаления таких антител и гетерологичных (не запланированных в составе поливалентной сыворотки) Н-антител.

Ф о р м у л а и з о 6 р е т е н и я

Способ получения диагностических поливалентных сывороток для идентификации жгутикового антигена у.Escherichia Со11.,включающий иммунизацию животных штаммами Е.Со1, содержащими различные Н-антигены с последующим определением гстерологичных Н-антител в сыворотке крови и их адсорбции, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения идентификации Н-антигена, иммунизацию осуществляют штаммами Е,Coli, принадлежащими к одной и той же серологической ОК-группе (055:К59 (B5) серотинов с Н1 по Н12, с Н14 по Н21, с Н23 по Н49, H51 - H56 и

Н"635", а адсорбцию сыворотки проводят штаммами той же серогруппы.

1338153

Таблица}

Состав поючивалентных вакцин, использованных для иммунизации животных

Н-антигены штаммов серогруппы 055:K59(B5) включенных в состав поливалентной вакцины для получения соответствующей поливалентной сыворотки

Номер поливалентной сыворотки

Н1, Н2, Н6, Н7, Н9, Н12, Н14, Н23, Н24, Н25, Н27, Н28, Н29, НЗ 1, НЗЗ, Н34, Н38, Н51

Н10, Н16, Н20, Н21, Н23, Н24, Н25, Н26, Н30, H32 ° Н35, Н36, Н39, Н42, Н52, Н53, Н54

Н2, НЗ, Н5 ° Н9 ° Н15 ° Н16, Н20в Н27 ° Н35ю Н36 °

Н43, Н44, Н45, Н46, Н51, Н53, Н56, Н"635п

Н8, Н10, Н11, Н21, Н23, Н28, Н29, Н34, Н35, Н39, Н40, Н42, 843) Н47, Н48, Н49, Н56

Н4, Н6, Н11, Н15, Н18, Н24, Н31, Н36, Н37, Н38, Н39, Н41, Н45, Н46, Н48, Н49, Н51, Н52

НЗ, Н7, Н9, Н16, Í18, Н19, Н28, Н31, HÇÇ, Н40, Н4 1, Н42, Н45, Н48, Н52, Н54, Н55, Н56

Н4, Н6, Н14, 4t8, Н20, Н21, Н25, Н26, Н27, Н29» НЗЗ, Н43, Н44, H46q Н47, Н49, Н55

Таблица

Поливалентные сыворотки

Í5

У 68

Штаммы, использованные для адсорбции

1t 78, У 79

@87, У 100

Np 789 yt j0t

971, 197, 1102

М 115

Результаты контроля специфичности сывороток

Не обнаружены гетерологические

Н-антитела

Н17, Н 18

Н28, Н41

Н17, Н42

Н8, Н38, Н43

Не обнаружены гетерологические

Н-антитела

1338153

Т а б л и ц а 3

Упрощение процесса идентификации Н-антигонов при использовании сывороток, полученных предлагаемым и известным способами

Срок уче- (1 та результата от наСпособ

Способ использования сывороток

Расход получения сыпредметных стекол вороток или агглючала реакции агглютинации

Предла- реакция гаемый агглюти3-5 мин

7-9 предметных стекол

1-3 мин нации на стекле

14 ч

1-2,5 ч

21 пробирка

Известный реакция агглютинации в пробирках

При подготовке бактериальной культуры для исследования посредством реакции агглютинации в пробирках иследование начинают на следующий день после добавления к культуре формалина.Результат пробирочной реакции агглютинации учитывают, (г либо четырехкратно (через 15, 30, 45 и 60 мин) в случае инкубации при 50 С или однократно после 2 ч инкубации при 37 С и получаса при комнатной (17-25 С) температуре.

Составитель Г,Крюкова

Редактор Е.Месропова Техред B.Êàäàð Корректор В. Гирняк

Тираж 132 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Заказ 37? 8

Производственно-полиграфическое предприятие, г.уагород, ул.Проектная,4

Наименьшее ( необходимое время инкубации бактерий с формалином перед реакцией агглютинации тинационных пробирок (в расчете на исследование трех штаммов)